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利用活体成像定量分析患者来源肿瘤类器官的细胞放射敏感性

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DOI：

10.3791/66680

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2024年4月5日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文详细介绍了一种简单直接的活体成像方法，用于量化患者来源的肿瘤类器官对电离辐射的敏感性。

摘要

放射治疗（RT）是现代临床癌症治疗的主要手段之一。然而，并非所有癌症类型对辐射的敏感性都相同，这种差异通常（但并非总是）源于恶性细胞修复电离辐射所引发的氧化性DNA损伤能力的不同。数十年来，克隆形成实验一直被用于评估培养中的癌细胞对电离辐射的敏感性，主要原因在于受辐射的癌细胞往往以延迟方式死亡，而这种死亡难以通过短期的流式细胞术或显微镜辅助技术进行量化。遗憾的是，传统的克隆形成实验无法直接应用于更复杂的肿瘤模型，例如患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）。事实上，对已建立的PDTOs进行辐射照射并不一定会阻断其作为多细胞单位的生长能力，除非其具有干细胞特性的组分被完全清除。此外，对PDTOs解离所得的单细胞悬液进行照射，可能无法准确反映恶性细胞在完整PDTOs环境中的放疗敏感性。本文详细介绍了一种对传统克隆形成实验的改进方法，该方法包括将已建立的PDTOs暴露于电离辐射，随后进行单细胞解离、在适宜培养条件下重新接种，并进行活细胞成像。未照射（对照）PDTOs来源的具有干细胞特性的细胞能够以特定于PDTO的效率重新形成生长中的PDTOs，而这种效率会随着辐射剂量的增加而呈依赖性下降。在此条件下，可通过时间延时成像记录图像，直至对照组PDTOs达到预设的空间占据程度，进而定量分析PDTO形成效率和生长速率，作为评估放射敏感性的指标。

引言

体外束放射治疗（RT）是现代肿瘤学的主要手段之一，不仅因其具有显著的抗癌活性以及通常可管理的特定副作用谱而著称1，还因其临床应用极为广泛（发达国家的大多数癌症中心均配备用于体外束RT的现代直线加速器）2。正因如此，RT在全球范围内已成功应用于根治性治疗（通常针对早期疾病）3,4和姑息性治疗（用于控制转移性肿瘤引起的症状，例如疼痛）5。然而，并非所有恶性肿瘤对RT的敏感性均等，这反映了多种肿瘤细胞内在及微环境因素的影响6,7,8,9。以单一因素为例，多种与癌症相关的遗传和表观遗传改变可通过影响DNA修复和氧化还原稳态，导致肿瘤细胞内在放射敏感性增强或降低，这主要体现了RT通过直接损伤以及活性氧（ROS）依赖性机制对DNA和其他大分子造成损伤从而杀伤癌细胞的能力10,11,12,13。

数十年来，克隆形成实验一直被常规用于评估培养的人类和小鼠癌细胞的放射敏感性14,15,16。事实上，尽管化疗药物和其他应激因素通常能以相对较快的方式杀死恶性细胞，但在临床相关剂量下使用的放疗（RT）往往引发一种延迟性的细胞死亡形式，这种死亡无法通过短期的流式细胞术或显微镜辅助技术（例如在细胞毒性刺激暴露后24–72小时测量活体染料的细胞摄取，该染料可选择性地标记死亡细胞）进行简单量化17。克隆形成实验不仅操作简便且依赖的试剂成本较低，还特别适用于实施所谓的"线性二次"模型，这是一种用于放疗剂量反应定量分析的相对简单的数学工具18,19。类似地，培养的癌细胞（包括已建立的细胞系以及来源于患者的原代细胞）为研究癌症生物学的多个方面提供了一个便捷的平台，能够在相对直接但简化的条件下测试治疗敏感性，其主要局限之一在于缺乏结构化的肿瘤微环境（TME）20,21。事实上，二维癌细胞培养体系本质上无法重现癌细胞之间以及癌细胞与细胞外基质之间的相互作用和细胞间通讯，而这些在真实肿瘤中至关重要22,23。患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）作为一种肿瘤模型应运而生，至少在一定程度上克服了这一局限24,25,26。

遗憾的是，传统的克隆形成实验无法用于评估PDTO的放射敏感性。一方面，对已形成的PDTO进行照射可能并不会必然影响其作为一个多细胞单位的生长能力，除非其具有干细胞特性的组分——该组分负责PDTO的形成与成熟，但相较于PDTO中更为分化的细胞，其对DNA损伤具有更高的耐受性27——被完全清除。另一方面，对PDTO来源的单细胞悬液进行照射可能无法准确反映在完整PDTO结构背景下PDTO组成细胞（包括具有干细胞特性的细胞）所表现出的放射敏感性。本文详细描述了一种技术，该技术利用活细胞成像方法，监测经电离辐射处理后的乳腺癌PDTO来源细胞与未受照射的对照细胞相比，在PDTO形成能力及生长速率方面的变化。鉴于不同PDTO在生物学特性上存在差异（如培养基需求、生长速度等），我们预期本方案经过适当调整后，可广泛适用于研究多种乳腺及非乳腺来源PDTO的放射敏感性。

方案

研究中使用的试剂和设备列在材料表中。

1. 类器官培养

注意：TNBC#1 PDTO 是在本实验室基于一名三阴性乳腺癌（TNBC）患者手术切除的肿瘤组织建立的，该患者已签署知情同意书，同意参与生物样本库项目（IRB21-06023682）。经组织学和RNA测序（RNAseq）验证后，TNBC#1 PDTO 在66% Matrigel 滴（即所谓的“穹顶”结构）中，使用添加了多种补充成分的DMEM/F12培养基（表1）进行培养，并每2-3周以1:2至1:10的比例传代一次28。

  1. 在照射前约2周，将PDTOs以1:2至1:10的比例接种于多个独立的非黏附6孔板中，每个测试辐射剂量对应一个孔板（另设阴性对照组，即未接受电离辐射的PDTOs）。
  2. 每隔3至4天向PDTOs中加入3 mL新鲜的高营养DMEM/F12培养基。
    注意：接种和培养条件可能需要适当调整，以避免PDTOs在显微镜下出现明显环状结构（提示核心坏死），并确保在照射时具有最佳的存活状态。

2. 辐射

  1. PDTOs 达到平均大小（约 100 µm，根据带刻度参照的明场显微镜预先测定）和类器官占据率（约 80%）时，即可准备进行照射。在此阶段传代 PDTOs，以避免过度拥挤。
  2. 使用小型动物放射研究平台（SARRP）辐照仪（或其它等效辐照仪）对含有PDTO的半球形结构进行辐照 体外 或 体内 在开放野模式（无准直器）下应用，分别给予2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy和10 Gy的单次剂量。未受辐照的PDTO作为适当的阴性对照条件。
    注意：每次实验前应进行剂量测定校准，以确保Matrigel包埋的PDTOs接收到预定的辐射剂量。所选剂量基于对TNBC#1 PDTOs放射敏感性的初步评估，因此其他PDTOs可能需要调整剂量。

3. 解离

  1. 照射后立即用2 mL含补充物的DMEM/F12培养基清洗每个含有PDTO的Matrigel凝胶滴，然后用移液枪加入1–3 mL TrypL-E重悬。每个孔重复操作约30次。
  2. 将细胞悬液收集至50 mL离心管中，在37 °C水浴中孵育约5分钟。
  3. 通过以 800 x g 离心使细胞沉淀 g 室温下孵育5分钟。
  4. 去除多余的 TrypL-E 留约 1 mL 于管中，并加入原始酶体积（见步骤 3.1）3 倍的含补充物的 DMEM/F12 培养基洗涤细胞。
  5. 使用40 µm孔径的滤膜过滤细胞悬液。此步骤可确保铺板时无细胞团块残留，使每个新形成的PDTO均起源于单个细胞。
  6. 使用 PBS 中 10% 台盼蓝染色后，在自动细胞计数仪中计数细胞，并将细胞重悬于 4 °C 的含 66% Matrigel 的改良 DMEM/F12 培养基中，每 50 µL 体系含有 800 个细胞（适用于 1 个类器官 dome 的条件）。
  7. 将每个类器官分别接种于适合活细胞成像的48孔培养板的独立孔中，避免产生气泡。建议每种辐射剂量设置技术重复三次。
  8. 将培养皿置于细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中2) 30 分钟以凝固基质胶。
  9. 加入0.5–1 mL增补的DMEM/F12培养基，去除可能存在的气泡，将培养板放入细胞培养孵育箱内的活细胞成像系统中。成像前让培养板在设定温度下平衡约30分钟。
    注意：Matrigel 在低温下会凝固 >4 °C，意味着在需要凝固之前应始终保持此温度。

4. 活体成像

  1. 在 Incucyte 软件中，选择 计划获取。
  2. 点击 启动添加容器 左上角的 加号。
  3. 如需重复或单次扫描，请选择 按计划扫描，然后点击 下一步。
  4. 如需创建或恢复容器，请选择 新建容器，然后点击 下一步。
  5. 选择扫描类型时，请选择 类器官，然后点击 下一步。
  6. 扫描设置：选择 QC < ' 相位 + 明场图像通道。'4x 物镜' 将自动选中，然后点击 下一步。
  7. 容器选择：根据目录编号选择经软件验证的合适培养板。
  8. 容器位置：根据仪器布局选择培养板的位置，然后点击 下一步。
  9. 扫描模式：根据培养板布局选择孔位，然后点击 下一步。
  10. 容器记录本：为培养板命名（可选：填写 细胞类型 和 传代次数）。通过点击培养板布局右上角的 加号，选择“创建培养板图谱”来创建板图谱。
  11. 在 培养板图谱编辑器 中，通过点击 细胞 部分的 新建细胞 图标来标明细胞类型，并通过点击 加号 图标将其应用到相应孔位，然后选择对应的孔。可选：可注明接种细胞数量和传代次数。每种细胞系均需重复此操作。
  12. 通过点击 生长条件 部分的 新建细胞 图标来标明处理方式，并通过点击 加号 图标将其应用到相应孔位，然后选择对应的孔。每种实验条件均需重复此操作。完成后，点击 确定 > 下一步。
  13. 分析设置：“延迟分析至后续时间”为默认选中状态；点击 下一步。
  14. 扫描计划：选择每天扫描两次，持续无限期。点击 下一步。通过监测对照 PDTO 的黑暗程度判断最佳终点，因其在过度生长时容易塌陷。
  15. 总结：检查摘要信息，然后点击 添加到计划。
    注意：可通过右键点击扫描时间轴查看扫描属性，并在需要时编辑扫描计划。

5. 分析

  1. 在兼容的软件中选择 查看也可通过连接至系统的计算机进行操作 通过 内网
  2. 双击所选实验以打开。
  3. 选择 启动分析 图标。
  4. 选择 创建新的分析定义，然后点击 下一步.
  5. 分析类型： 选择 类器官，然后点击 下一步.
  6. 图像通道： '相差 + 明场“默认已选中，点击”下一步'.
  7. 选择一组代表性图像进行分析。单击 下一步建议选择早期和晚期的时间点以及不同的处理条件，例如对照组和不同辐射剂量。
  8. 对TNBC#1执行分析定义，步骤如下：
    1. 在图像上：选择 预览 当前 或 '预览全部用于可视化当前或选定图像的默认掩膜。每次更改分析参数后需重复此步骤以更新掩膜。
    2. 分割：设置 半径 到 300, 灵敏度背景 到 80, 边缘分割 到 开启，和 边缘敏感性 到 70.
    3. 清理：设置 孔洞填充 到 5×10⁵ µm2 和 调整大小 到 0 像素.
    4. 筛选器： 设置 无最小值 或 最大面积, 最小偏心率 设定为 0.19，以及 无最大偏心率. 点击 下一步.
  9. 扫描时间 和 孔 选择所有需要的扫描时间点和孔位。点击 下一步可选：选择 分析未来扫描图像.
  10. 保存 和 应用分析定义： 输入 定义名称，然后点击 下一步.
  11. 查看摘要，然后点击 完成.
  12. 一个弹出窗口将提示用户分析已进入分析队列。单击 好的分析队列窗口打开后，即可查看剩余任务。
  13. 如有必要，可调取已完成的分析结果 查看 通过选择 蓝色箭头 在 分析 柱，在“容器名称”旁，右键单击 分析定义名称接下来，可通过点击软件中的选项来可视化原始数据 图分析指标，或通过选择导出以进行进一步分析 输出分析定义.
    注意：原始数据导出可在其中进行自定义 图分析指标 窗口。类器官数量、总面积、平均离心率和暗度可分别导出，且数据可整理在 选择分组 下拉菜单，通过点击 无、列、行或平板图重复对于TNBC#1，为导出原始数据， 图分析指标，以及用于 选择分组 下拉选项，该选项 无 选择了这些导入参数，其设定依据来自对TNBC#1 PDTOs的初步评估。因此，其他PDTOs可能需要对参数进行调整，这可通过软件实现 "预览" 特征。我们建议在以下两种图像上调整导入参数：（1）主要包含单个细胞或小型PDTO的早期图像；（2）在较晚时间点采集的图像，以确保在对照和处理条件下均能获取较大的PDTO。

结果

在第0天，TNBC#1 PDTO接受单次辐射照射，剂量分别为0（未照射对照组）、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy或10 Gy。照射后立即对PDTO进行解离，以获得每种实验条件下的单细胞悬液。随后，将PDTO来源的细胞接种于48孔板中，每孔中心加入50 µL含66% Matrigel的凝胶滴（每种条件设3个技术重复）。将培养板置于活细胞成像系统中，使用类器官模块4倍物镜每6小时成像一次，持续共30天。单次2 Gy剂量的放射治疗显著延迟了TNBC#1 PDTO的再生长，而≥4 Gy（最高至10 Gy）的辐射剂量则完全抑制了PDTO的再生（图1）。

辐射后克隆生长；0 Gy、2 Gy、10 Gy剂量；生长曲线图；放射生物学研究。
图1：患者来源肿瘤类器官（PDTOs）的活细胞成像。 三阴性乳腺癌TNBC#1患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）未经处理或接受指定剂量的辐射处理，随后迅速进行解离、重新接种，并使用活细胞成像系统进行成像。展示了对比度调整后的代表性图像（A）和定量评估结果（B，均值 ± 标准误）。图像尺寸：1.19 × 1.16 mm（1.38 mm2）。比例尺：400 µm；插图：200 µm。****p < 0.001（双因素方差分析，与0 Gy组相比）；####p < 0.001（双因素方差分析，与2 Gy组相比）。请点击此处查看该图的放大版本。

组分浓度
DMEM F/121X
GlutaMax1X
Hepes10 mM
PenStrep100 U/mL
B271X
nAc1.25 mM
烟酰胺10 mM
TGFbeta 受体抑制剂 A83-010.5 μM
p38 MAP 抑制剂 p38i SB2021901 μM
Noggin10%
Rspondin 培养基10%
FGF1020 ng/mL
FGF75 ng/mL
NR (Heregulin)5 nM
Primocin100 μg/mL
Y-27632 (RhoKi)5 μM
表皮生长因子 hEGF5 ng/mL

表1：PDTO培养基成分。

讨论

在此，我们介绍一种对传统克隆形成实验的改进方法，该方法利用乳腺癌患者来源的类器官（PDTO）和活细胞成像技术，通过以下方式定量评估PDTO的放射敏感性：（1）在PDTO接受照射后，具有类器官形成能力的干细胞样细胞的持续存在情况 体外，以及这些细胞（可能）生成的PDTO的生长速率。本方案的关键步骤包括：（1）建立PDTO，使其达到可保证良好存活率的穹顶占据状态；（2）将PDTO暴露于不同剂量的电离辐射下，包括模拟照射的对照条件；（3）将PDTO解离为单细胞；（4）重新接种PDTO来源的单细胞；（5）进行活细胞成像，直至对照条件下达到预设的穹顶占据状态。

经过少量修改后，该方案预计可适用于多种市售的活细胞成像平台以及多种乳腺和非乳腺来源的PDTO，这些修改主要与PDTO形成效率及对照条件下PDTO的生长速率相关（这两者在不同PDTO之间可能存在显著差异）。一方面，单细胞分散后PDTO的基础形成效率将影响为获得新PDTO所需重新接种的单细胞数量，以达到既便于基于图像的PDTO定量分析，又能保证未处理PDTO正常生长的密度。另一方面，PDTO的生长速率将影响实验的持续时间，因为应避免相邻PDTO的融合，以维持最佳的分析能力。因此，针对每一种PDTO在对照条件下确定其形成效率和生长速率，对该方案的正确实施至关重要。

尽管该方法被发现相对简单直接，但也存在一些局限性。首先，形成类器官的细胞数量过少可能会损害在单细胞解离后正常生长的PDTO的再生能力。事实上，虽然常规的PDTO传代可通过不完全解离实现，但本方案所提供的定量评估依赖于单细胞悬液的制备（可在计数过程中通过显微观察确认）。其次，生长速度过慢会显著延长实验周期，并可能导致放射敏感性评估不准确。确实可以设想，对于生长缓慢的PDTO，为达到适合终点检测的尺寸所需延长的培养时间，可能为亚致死辐射损伤的PDTO形成细胞提供更多从应激状态中恢复并重建增殖能力的机会。 可检测到的（尽管生长缓慢的）PDTO。最后，预计在放疗后不久即对PDTO进行解离，将对形成PDTO的细胞施加额外压力，可能由于恢复早期细胞间通讯的改变，从而增加其放射敏感性。将解离时间延迟至24–72小时，可能有助于了解在放疗所致大分子损伤后，细胞间通讯的保留对PDTO形成细胞恢复能力的相对贡献。

尽管活体成像平台为纵向监测PDTO的形成和生长提供了便捷的方法，但单次终点成像也可用于实现相同目的。在此情况下，应注意确保相邻的PDTO在成像前未发生融合，且可通过将PDTO大小标准化至实验持续时间来评估其生长速率。

在个体化癌症治疗时代，评估单个肿瘤对治疗的敏感性至关重要，因为它为设计疗效更优的个体化治疗策略提供了一定的依据29。本文所述方案正契合这一目标，提供了一种便捷的方法，用于评估个体患者来源类器官（PDTO）细胞对电离辐射（单独或联合其他治疗方式）的敏感性。然而，通过PDTO测定的癌细胞放射敏感性是否能够准确预测癌症患者对局部放疗（RT）的临床反应，仍有待证实。将不同PDTO的放射敏感性与相应供体患者对放疗的临床反应进行关联分析，将有助于深入理解这一可能性。

披露

与本工作无关，SCF 曾与默克（Merck）、瓦里安（Varian）、百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb）、Celldex、再生元（Regeneron）、卫材（Eisai）和礼来（Eli-Lilly）签订研究合同，并从拜耳（Bayer）、百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb）、瓦里安（Varian）、Elekta、再生元（Regeneron）、卫材（Eisai）、阿斯利康（AstraZeneca）、MedImmune、默克美国（Merck US）、EMD Serono、Accuray、勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、罗氏（Roche）、基因泰克（Genentech）、阿斯利康（AstraZeneca）、View Ray 和 Nanobiotix 获得咨询/顾问酬金。与本工作无关，SD 从Lytix Biopharma、EMD Serono、小野制药（Ono Pharmaceutical）、基因泰克（Genentech）和强生企业创新公司（Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc.）获得咨询/顾问酬金，并曾与Lytix Biopharma、Nanobiotix 和勃林格殷格翰（Boehringer-Ingelheim）签订研究合同。与本工作无关，LG 曾与Lytix Biopharma、Promontory 和 Onxeo 签订研究合同，从勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、阿斯利康（AstraZeneca）、OmniSEQ、Onxeo、The Longevity Labs、Inzen、Imvax、Sotio、Promontory、Noxopharm、EduCom 和 Luke Heller TECPR2 基金会获得咨询/顾问酬金，并持有 Promontory 的股票期权。

致谢

感谢 Raymond Briones 和 Wen H. Shen（美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院）在本实验方案开发过程中提供的帮助。本研究工作获得了美国国防部乳腺癌研究计划（US DoD BCRP）转化性乳腺癌联盟基金（#W81XWH2120034，项目负责人：Formenti）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40 µm 细胞筛网滤器Thomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellometer Auto T4 明场细胞计数仪Nexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
表皮生长因子 hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL 数字倒置荧光显微镜 Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 35050061
HepesInvitrogen 15630-080
IncuCyte 软件 2021ASartorius版本：2021A
Incucyte SX1Sartorius型号 SX1
Incucyte 验证用 48 孔板Corning 3548
MatrigelDiscovery Labware354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
烟酰胺Sigma-AldrichN0636
Noggin购自美国纽约威尔康奈尔医学院 Englander 精准医学研究所
未处理 6 孔板Cellstar657 185
NR（Heregulin）Peprotech100-03
p38 MAP 抑制剂 p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
青霉素-链霉素（PenStrep）Invitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin 培养基购自美国纽约威尔康奈尔医学院 Englander 精准医学研究所
小型动物放射研究平台（SARRP） Xstrahl Ltd
TGFβ 受体抑制剂 A83-01Tocris2939
台盼蓝染液（0.4%）Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632（Rho激酶抑制剂）SelleckS1049

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