方法文章

实时成像量化患者来源的肿瘤类器官中的细胞放射敏感性

DOI：

10.3791/66680

⸱

2024年4月5日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们详细介绍了一种简单的实时成像方法，用于量化患者来源的肿瘤类器官对电离辐射的敏感性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

放射治疗 （RT） 是现代临床癌症管理的主要手段之一。然而，并非所有癌症类型对辐射都同样敏感，这通常（但并非总是）是因为恶性细胞修复电离射线引起的氧化 DNA 损伤的能力存在差异。几十年来，克隆形成测定一直被用于评估培养的癌细胞对电离照射的敏感性，这主要是因为受照射的癌细胞通常以延迟方式死亡，这很难用短期流式细胞术或显微镜辅助技术进行量化。不幸的是，克隆形成检测不能用于更复杂的肿瘤模型，例如患者来源的肿瘤类器官 （PDTO）。事实上，照射已建立的 PDTO 不一定会消除它们作为多细胞单位的生长，除非它们的茎状隔室被完全根除。此外，在已建立的 PDTO 的情况下，照射 PDTO 衍生的单细胞悬液可能无法正确概括恶性细胞对 RT 的敏感性。在这里，我们详细介绍了对常规克隆形成测定的改编，其中包括将已建立的 PDTO 暴露于电离辐射，然后进行单细胞解离，在合适的培养条件下重新铺板和实时成像。未照射（对照）PDTO 衍生的干细胞样细胞以 PDTO 特异性效率重组生长中的 PDTO，该效率以剂量依赖性方式受到照射的负面影响。在这些条件下，PDTO 形成效率和生长速率可以量化为对收集的延时图像的放射敏感性的量度，直到对照 PDTO 达到预定义的空间占用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

外照射放射治疗 （RT） 是现代肿瘤学的支柱之一，它不仅反映了明显的抗癌活性，而且反映了与明确定义的通常可控的副作用谱相关的抗癌活性1，而且还反映了异常广泛的临床可用性（发达国家的大多数癌症中心都配备了用于外照射 RT 的现代直线加速器）2.根据这一概念，RT 在全球范围内成功用于治疗目的（通常在早期疾病 3,4 和姑息性应用中），以控制转移性肿瘤的症状（例如疼痛）5。也就是说，并非所有恶性肿瘤对 RT 都同样敏感，这反映了许多癌细胞内在和微环境特征 6,7,8,9。作为一个独立的例子，影响 DNA 修复和氧化还原稳态的各种癌症相关遗传和表观遗传改变与内在放射敏感性的增加或降低有关，这在很大程度上反映了 RT 通过对 DNA 和其他大分子造成直接和活性氧 （ROS） 依赖性损伤来杀死癌细胞的能力 10,11,12,13。

在过去的几十年里，克隆形成测定已被常规用于评估培养的人和小鼠癌细胞的放射敏感性 14,15,16。事实上，虽然化疗药物和其他应激源通常以相当快的方式杀死恶性细胞，但以临床相关剂量使用的 RT 最常引起延迟形式的细胞死亡，这不能用短期流式细胞术或显微镜辅助技术进行简单量化，例如测量细胞对活染料（选择性染色死细胞）的细胞摄取暴露于细胞毒性刺激后 24-72 小时17.除了简单明了并依赖于相当便宜的试剂之外，克隆形成测定还特别方便，因为它们允许实施所谓的"线性二次"模型，这是一种相当简单的数学工具，用于定量分析 RT 剂量反应18,19。沿着类似的思路，培养的癌细胞（包括已建立的细胞系以及原代、患者来源的细胞）为测试癌症生物学的各个方面提供了一个方便的平台，包括（但不限于）以相当简单但简化的方式对治疗的敏感性，一个主要限制是缺乏结构化的肿瘤微环境 （TME）20，21.事实上，二维癌细胞培养物本质上无法概括细胞间通讯和与细胞外基质的相互作用，就像它们在癌症中发生的那样22,23。患者来源的肿瘤类器官 （PDTO） 已成为至少部分绕过这种限制的肿瘤模型 24,25,26。

不幸的是，传统的克隆形成测定法不能用于评估 PDTO 的放射敏感性。一方面，照射已建立的 PDTO 不一定会损害它们作为多细胞单位的生长，除非它们的茎样区室 - 负责 PDTO 的形成和成熟，但与分化程度更高的 PDTO 组成细胞相比，表现出对 DNA 损伤的抵抗力增加27 - 被完全根除。另一方面，照射 PDTO 衍生的单细胞悬液可能无法正确概括 PDTO 组成（包括干细胞样）细胞的放射敏感性，如在形成的 PDTO 的情况下所表现出的那样。在这里，我们详细介绍了一种技术，该技术利用乳腺癌 PDTO 的实时成像来监测以前暴露于电离照射的 PDTO 衍生细胞的 PDTO 形成功效和生长速率，与未照射的细胞相比。由于所需的变化在很大程度上反映了单个 PDTO 的差异生物学（例如，培养基需求、生长速率），我们预计该协议适用于研究乳腺和非乳腺来源的广泛 PTDO 的放射敏感性。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 类器官培养

注意:TNBC#1 PDTO 是在我们的实验室中建立的，基于从三阴性乳腺癌 （TNBC） 患者手术切除的肿瘤组织，该患者提供知情同意参与生物样本库方案 （IRB21-06023682）。经组织学和 RNA 测序 （RNAseq） 验证后，将 TNBC#1 PDTO 在富集的 DMEM/F12 培养基（表 1）中培养在 66% 基质胶滴（所谓的"圆顶"）中，并以 1:2-1:10 的比例每 2-3 周传代一次 28。

  1. 在照射前约 2 周，以 1:2-1:10 的比例在单独的、非粘附的 6 孔板中播种 PDTO，每个测试的辐射剂量一个（加上阴性对照，这将由未暴露于电离辐射的 PDTO 提供）。
  2. 每 3-4 天向 PDTO 中加入 3 mL 新鲜富集的 DMEM/F12 培养基。
    注:接种和培养条件可能需要一些调整，以防止 PDTO 获得非常可识别的环状外观，这表明在显微镜下存在核心坏死，并确保照射时的最佳活力。

2. 辐射

  1. 一旦 PDTO 达到平均尺寸（约 100 μm，在明场显微镜下使用比例参考初步确定）和圆顶占用率（约 80%），就可以进行照射。在此阶段通过 PDTO 以避免过度拥挤。
  2. 使用小动物研究辐射平台 （SARRP） 辐照器（或用于 体外 或 体内 应用的替代辐照器）在开场模式（无准直器）照射含有 PDTO 的圆顶，提供 2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy 和 10 Gy 的单剂量。未辐照的 PDTO 提供适当的阴性对照条件。
    注意:每次实验前应进行剂量学测试校准，以确保 Matrigel 封闭的 PDTO 接受计划的辐射剂量。这些剂量是根据对 TNBC#1 PDTO 放射敏感性的初步评估选择的，因此可能需要调整其他 PDTO。

3. 解离

  1. 照射后，立即用 2 mL 富集的 DMEM/F12 培养基洗涤每个含有 PDTO 的基质胶圆顶，并使用 p1000 微量移液器将它们重悬于 1-3 mL 的 TrypL-E 中。每个孔重复约 30 次。
  2. 将细胞悬液收集在 50 mL 离心管中，并在 37 °C 的水浴中孵育 ~5 分钟。
  3. 通过在室温下以 800 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞。
  4. 去除过量的 TrypL-E，在试管中留下 ~1 mL，并加入 3 倍原始酶体积（参见步骤 3.1）的富集 DMEM/F12 培养基来洗涤细胞。
  5. 使用 40 μm 网状过滤器过滤细胞悬液。此步骤确保在铺板时没有细胞簇残留，并且每个新的 PDTO 都来自单个细胞。
  6. 在 PBS 中用 10% 台盼蓝染色后，在自动细胞计数器中对细胞进行计数，并在 4 °C 下将它们重悬于 50 μL 富集的 DMEM/F12 培养基和 66% 基质胶中（条件为 1 个圆顶）。
  7. 将每个圆顶接种在与实时成像兼容的 48 孔培养板的单个孔中，同时避免形成气泡。建议对每种辐射剂量进行技术一式三份。
  8. 将板置于细胞培养箱（37°C，5% CO2 ）中 30 分钟以固化基质胶。
  9. 加入 0.5-1 mL 富集的 DMEM/F12 培养基，去除潜在的气泡，并将板放入细胞培养箱内的活体成像系统中。成像前让板平衡至设定温度约 30 分钟。
    注:Matrigel 在 >4 °C 的温度下凝固，这意味着应保持此温度直到需要凝固。

4. 实时成像

  1. 在 Incucyte 软件上，选择 Schedule to Aquire。
  2. 单击 Launch Add Vessel 左上角的加号。
  3. 要重复扫描或扫描一次，请选择 Scan on Schedule（按计划扫描），然后单击 Next（下一步）。
  4. 要创建或恢复船只，请选择 Create Vessel New，然后单击 Next。
  5. 要选择扫描类型，请选择 Organoid （类器官），然后单击 Next（ 下一步）。
  6. 扫描设置:选择 QC < ' 相位 + 明场图像通道。"4x Objective"将自动选中。然后点击 Next（ 下一步）。
  7. 船只选择: 根据目录号选择合适的软件验证板。
  8. 船只位置: 根据布局选择板在仪器上的位置，然后单击 Next（下一步）。
  9. 扫描模式: 根据板布局选择孔，然后单击 Next。
  10. 船只笔记本: 铭牌（可选:名称 Cell Type 和 Passage）。通过单击板布局右上角的 加 号"Create plate map"创建板图。
  11. 在 Plate Map Editor 中，通过单击"Cells"部分中的 Create New Cell 图标来指示细胞类型，通过单击加号图标应用于适当的孔，然后选择适当的孔。可选:可以指示接种细胞和传代的数量。对每个细胞系重复。
  12. 通过单击"生长条件"部分中的"创建新细胞"图标来指示处理，通过单击加号图标应用于适当的孔，然后选择适当的孔。对每个实验条件重复此操作。接下来，点击 Ok > Next。
  13. 分析设置: 自动选择"将分析推迟到以后";点击 Next（下一步）。
  14. 扫描计划: 选择每天扫描两次，无限期。单击 Next（下一步）。监测对照 PDTO 的黑暗度以获得理想的终点，因为它们在杂草丛生时往往会塌陷。
  15. 总结: 检查摘要，然后单击 Add to Schedule。
    注意:扫描属性可以可视化，如果需要，可以通过右键单击扫描时间线来编辑计划。

5. 分析

  1. 在兼容软件上，选择 View （查看）。这也可以通过 通过 Intranet 连接到系统的计算机进行操作。
  2. 双击选择所需的实验。
  3. 选择 Launch Analysis 图标。
  4. 选择 Create New Analysis Definition，然后单击 Next。
  5. 分析类型: 选择 Organoid （类器官），然后单击 Next（下一步）。
  6. 图像通道: 默认选中 'Phase + Brightfield'，点击 'Next'。
  7. 选择一组具有代表性的图像进行分析。单击 Next（下一步）。建议选择早期和晚期时间点以及不同的治疗条件，例如对照和不同的辐射剂量。
  8. 按照以下步骤执行 TNBC#1 的分析定义:
    1. 在图像上:选择 "预览当前 图像"或"全部预览"以可视化当前或选定图像的默认蒙版。更改分析参数时重复此操作，以更新遮罩。
    2. 分割:将 半径 设置为 300，将 灵敏度背景 设置为 80，将 边缘分割 设置为 ON，将 边缘灵敏度 设置为 70。
    3. 清理:将 Hole Fill 设置为 5E+05 μm2 并将 Size 调整 为 0 像素。
    4. 过滤 器:无最小或最大面积，最小偏心率设置为 0.19，无最大偏心率。单击 Next（下一步）。
  9. 扫描时间和孔:选择所有所需的扫描时间点和孔。单击 Next（下一步）。可选:选择 Analyze future scans （分析将来的扫描）。
  10. 保存 并 应用分析定义: 输入 定义名称，然后单击 下一步。
  11. 可视化 Summary ，然后单击 Finish。
  12. 此时将显示一个弹出窗口，通知用户分析已进入 Analysis Queue。点击 Ok.一旦 Analysis Queue 窗口打开，就可以可视化其余任务。
  13. 如有必要，通过在 Analyses 列中的 Vessel Name 旁边的蓝色箭头，然后右键单击 Analysis Definition Name 来检索已完成的分析。接下来，通过单击 Graph analysis Metrics 在软件上可视化原始数据，或者通过选择 Export Analysis Definition 导出以供进一步分析。
    注意:可以在 Graph analysis Metrics （图形分析指标） 窗口中自定义原始数据导出。类器官计数、总面积、平均偏心率和暗度可以单独导出，并通过单击无、列、行或板映射重复在选择分组下拉菜单中组织数据。对于 TNBC#1，对于原始数据导出、Graph Analysis Metrics 和 Select Grouping 下拉选项，选择了选项 None。这些导入参数是根据 TNBC#1 PDTO 的初步评估选择的。因此，它们可能需要调整其他 PDTO，这可以在软件上基于 "预览" 功能进行调整。我们建议调整 （1） 主要包含单个细胞或小 PDTO 的早期图像，以及 （2） 在晚期时间点收集的图像，以确保在对照和处理条件下也能获得大 PDTO。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TNBC#1 PDTO 在第 0 天暴露于 0 （未照射对照）、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy 或 10 Gy 的单次辐射剂量。此后，立即解离 PDTO 以获得每种实验条件的单细胞悬液。接下来将 PDTO 衍生的细胞接种在 48 孔板中，接种在沉积在孔中心的 66% 基质胶圆顶（每个 50 μL）内，每种条件分 3 个技术重复。将板置于实时成像系统中，并使用类器官模块 4X 物镜每 6 小时成像一次，总共 30 天。用单剂量 2 Gy 的 RT 照射 TNBC#1 PDTO 显着延迟了 PDTO 再生，而完成的辐射剂量 ≥4 Gy（高达 10 Gy）阻止了生长的 PDTO 的再生（图 1）。

figure-results-1
图 1:患者来源的肿瘤类器官 （PDTO） 的实时成像。 乳腺癌 TNBC#1 患者来源的肿瘤类器官 （PDTO） 未经治疗或暴露于指定的辐射剂量，然后很快用活细胞成像系统进行解离、重新电镀和成像。报告了对比度调整 （A） 和定量评估 （B，平均 ± SEM） 的代表性图像。图像比例:1.19 x 1.16 毫米（1.38 毫米2）。比例尺:400 μm;插图:200 μm。****p < 0.001（双向方差分析，与 0 Gy 相比）; ####p < 0.001 （双向方差分析，与 2 Gy 相比）。 请单击此处查看此图的较大版本。

元件浓度
DMEM F/121 倍
谷胱甘肽1 倍
赫普斯10 毫米
PenStrep 系列100 U/mL
B27型1 倍
nAc1.25 毫米
烟 酰 胺10 毫米
TGFβ 受体抑制剂 A83-010.5 微米
p38 MAP 抑制剂 p38i SB2021901 微米
诺金10%
Rspondin 媒体10%
FGF1020 纳克/毫升
FGF75 纳克/毫升
NR （赫雷古林）5 纳米
Primocin （初生霉素）100 微克/毫升
Y-27632 （RhoKi）5 微米
表皮生长因子 hEGF5 纳克/毫升

表 1:PDTO 培养基组成。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们描述了一种对常规克隆形成测定的改编，它利用乳腺癌 PDTO 和实时成像来量化 PDTO 放射敏感性，基于 （1） 形成 PTDO 的干细胞样细胞在 体外 PDTO 照射下的持久性，以及 （2） 这些细胞（可能）产生的 PDTO 的生长速率。该协议的关键步骤包括 （1） 将 PDTO 建立到圆顶占用率，以实现良好的生存能力，（2） PDTO 暴露于不同剂量的电离照射，包括模拟辐照控制条件;（3） PDTO 解离成单细胞;（4） PDTO 衍生的单细胞的重新接种;（5） 实时成像，直到在控制条件下达到预定义的圆顶占用率。

通过最少的修改，主要与对照条件下的 PDTO 形成效率和 PDTO 生长速率有关（在不同的 PDTO 之间可能有很大差异），我们预计该协议将适用于多种市售实时成像平台，以及众多 PDTO，包括乳腺和非乳腺衍生物。一方面，单细胞分散时的基线 PDTO 形成效率预计会影响要重新接种的单细胞数量，以获得新 PDTO，其密度不仅能够实现基于图像的 PDTO 定量，而且能够实现未处理的 PDTO 的正常生长。另一方面，预计 PDTO 增长率会影响分析的持续时间，因为应避免相邻 PDTO 的合并以保持最佳分析能力。因此，确定每个单独 PDTO 在控制条件下的 PDTO 形成效率和 PDTO 生长速率对于正确实施该方案至关重要。

虽然发现这种方法相当简单，但它有一些局限性。首先，PDTO 形成细胞数量过少可能会损害单细胞解离时正常生长的 PDTO 的再生。事实上，虽然可以通过不完全解离来实现常规 PDTO 传代，但该方案提供的定量评估依赖于单细胞悬浮液的产生（可以在计数过程中目视确认）。其次，过慢的生长速率可能会大大延长测定的持续时间，并可能导致放射敏感性的估计不精确。确实可以想象，缓慢生长的 PDTO 达到终点兼容大小所需的延长培养时间可能会为亚致死 PDTO 形成细胞提供额外的机会，以从应激中恢复并恢复可检测（尽管生长缓慢）PDTO。最后，预计在照射后不久解离 PDTO 会对形成 PDTO 的细胞施加额外的压力，由于恢复早期细胞间通讯的改变，可能会增加放射敏感性。延迟 24-72 小时的解离可能有助于了解保留的细胞间通讯对 PDTO 形成细胞从 RT 施加的大分子损伤中恢复的能力的相对贡献。

虽然实时成像平台提供了一种纵向监测 PDTO 形成和生长的便捷方法，但单终点图像也可用于相同的目标。在这种情况下，应注意确保相邻的 PDTO 在成像前不会合并，并且可以将生长速率评估为 PDTO 大小的函数，该函数已标准化为测定持续时间。

在个性化癌症医学时代，评估个体肿瘤对治疗的敏感性至关重要，因为它为设计疗效更高的个体化治疗策略提供了一些提示29。本文描述的方案通过提供一种方便的方法来估计单个 PDTO 对电离辐射的细胞敏感性（单独或与其他治疗方式结合）来适应这项工作。也就是说，测量 PDTO 的癌细胞放射敏感性是否能准确预测个体癌症患者对局灶性 RT 的反应仍有待证明。将不同 PDTO 对照射的放射敏感性与其各自供体对 RT 的临床反应相关联，将为这种可能性提供重要的见解。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与这项工作无关，SCF 一直与默克、瓦里安、百时美施贵宝、Celldex、再生元、卫材和礼来签订研究合同，并已获得拜耳、百时美施贵宝、瓦里安、Elekta、再生元、卫材、阿斯利康、MedImmune、默克美国、EMD 雪兰诺、安科瑞、勃林格殷格翰、罗氏、基因泰克、阿斯利康、View Ray 和 Nanobiotix 的咨询/顾问酬金。与这项工作无关，SD已经从Lytix Biopharma、EMD Serono、Ono Pharmaceutical、Genentech和Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc.那里获得了咨询/顾问酬金，并且已经与Lytix Biopharma、Nanobiotix和Boehringer-Ingelheim签订了研究合同。与这项工作无关，LG 现在/一直与 Lytix Biopharma、Promontory 和 Onxeo 签订研究合同，已获得勃林格殷格翰、阿斯利康、OmniSEQ、Onxeo、The Longevity Labs、Inzen、Imvax、Sotio、Promontory、Noxopharm、EduCom 和 Luke Heller TECPR2 基金会的咨询/顾问酬金，并持有 Promontory 股票期权。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Raymond Briones 和 温 H. Shen（美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院）对本协议开发提供的帮助。这项工作得到了美国国防部 BCRP （#W81XWH2120034， PI: Formenti） 的变革性乳腺癌联盟资助的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40 µm 网状过滤器Thomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell CounterNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
表皮生长因子 hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL 数字倒置荧光显微镜 Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 
HepesInvitrogen 15630-080
IncuCyte 软件 2021ASartorius版本：2021A
Incucyte SX1Sartorius型号 SX1
经 Incucyte® 验证的 48 孔板康宁 3548
MatrigelDiscovery 实验室器皿354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
烟酰胺Sigma-AldrichN0636
Noggin购自美国纽约州威尔康奈尔市英格兰精准医学研究所
未经处理的 6 孔板Cellstar657 185
NR （Heregulin）Peprotech100-03
p38 MAP 抑制剂 p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBS康宁 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin 培养基购自美国纽约州威尔康奈尔市英格兰精准医学研究所
小动物放射研究平台 （SARRP） Xstrahl Ltd
TGFβ 受体抑制剂 A83-01Tocris2939
台盼蓝染色剂 （0.4%）Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 （RhoKi）SelleckS1049
35050061

参考文献

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