本文详细介绍了一种简单直接的活体成像方法，用于量化患者来源的肿瘤类器官对电离辐射的敏感性。
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方法文章
利用活体成像定量分析患者来源肿瘤类器官的细胞放射敏感性
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
放射治疗（RT）是现代临床癌症治疗的主要手段之一。然而，并非所有癌症类型对辐射的敏感性都相同，这种差异通常（但并非总是）源于恶性细胞修复电离辐射所引发的氧化性DNA损伤能力的不同。数十年来，克隆形成实验一直被用于评估培养中的癌细胞对电离辐射的敏感性，主要原因在于受辐射的癌细胞往往以延迟方式死亡，而这种死亡难以通过短期的流式细胞术或显微镜辅助技术进行量化。遗憾的是，传统的克隆形成实验无法直接应用于更复杂的肿瘤模型，例如患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）。事实上，对已建立的PDTOs进行辐射照射并不一定会阻断其作为多细胞单位的生长能力，除非其具有干细胞特性的组分被完全清除。此外，对PDTOs解离所得的单细胞悬液进行照射，可能无法准确反映恶性细胞在完整PDTOs环境中的放疗敏感性。本文详细介绍了一种对传统克隆形成实验的改进方法，该方法包括将已建立的PDTOs暴露于电离辐射，随后进行单细胞解离、在适宜培养条件下重新接种，并进行活细胞成像。未照射（对照）PDTOs来源的具有干细胞特性的细胞能够以特定于PDTO的效率重新形成生长中的PDTOs，而这种效率会随着辐射剂量的增加而呈依赖性下降。在此条件下，可通过时间延时成像记录图像，直至对照组PDTOs达到预设的空间占据程度，进而定量分析PDTO形成效率和生长速率，作为评估放射敏感性的指标。
引言
体外束放射治疗（RT）是现代肿瘤学的主要手段之一，不仅因其具有显著的抗癌活性以及通常可管理的特定副作用谱而著称1，还因其临床应用极为广泛（发达国家的大多数癌症中心均配备用于体外束RT的现代直线加速器）2。正因如此，RT在全球范围内已成功应用于根治性治疗（通常针对早期疾病）3,4和姑息性治疗（用于控制转移性肿瘤引起的症状，例如疼痛）5。然而，并非所有恶性肿瘤对RT的敏感性均等，这反映了多种肿瘤细胞内在及微环境因素的影响6,7,8,9。以单一因素为例，多种与癌症相关的遗传和表观遗传改变可通过影响DNA修复和氧化还原稳态，导致肿瘤细胞内在放射敏感性增强或降低，这主要体现了RT通过直接损伤以及活性氧（ROS）依赖性机制对DNA和其他大分子造成损伤从而杀伤癌细胞的能力10,11,
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方案
研究中使用的试剂和设备列在材料表中。
1. 类器官培养
注意：TNBC#1 PDTO 是在本实验室基于一名三阴性乳腺癌（TNBC）患者手术切除的肿瘤组织建立的，该患者已签署知情同意书，同意参与生物样本库项目（IRB21-06023682）。经组织学和RNA测序（RNAseq）验证后，TNBC#1 PDTO 在66% Matrigel 滴（即所谓的“穹顶”结构）中，使用添加了多种补充成分的DMEM/F12培养基（表1）进行培养，并每2-3周以1:2至1:10的比例传代一次28。
- 在照射前约2周，将PDTOs以1:2至1:10的比例接种于多个独立的非黏附6孔板中，每个测试辐射剂量对应一个孔板（另设阴性对照组，即未接受电离辐射的PDTOs）。
- 每隔3至4天向PDTOs中加入3 mL新鲜的高营养DMEM/F12培养基。
注意：接种和培养条件可能需要适当调整，以避免PDTOs在显微镜下出现明显环状结构（提示核心坏死），并确保在照射时具有最佳的存活状态。
2. 辐射
- PDTOs 达到平均大小（约 100....
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结果
在第0天，TNBC#1 PDTO接受单次辐射照射，剂量分别为0（未照射对照组）、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy或10 Gy。照射后立即对PDTO进行解离，以获得每种实验条件下的单细胞悬液。随后，将PDTO来源的细胞接种于48孔板中，每孔中心加入50 µL含66% Matrigel的凝胶滴（每种条件设3个技术重复）。将培养板置于活细胞成像系统中，使用类器官模块4倍物镜每6小时成像一次，持续共30天。单次2 Gy剂量的放射治疗显著延迟了TNBC#1 PDTO的再生长，而≥4 Gy（最高至10 Gy）的辐射剂量则完全抑制了PDTO的再生（图1）。
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讨论
在此，我们介绍一种对传统克隆形成实验的改进方法，该方法利用乳腺癌患者来源的类器官（PDTO）和活细胞成像技术，通过以下方式定量评估PDTO的放射敏感性：（1）在PDTO接受照射后，具有类器官形成能力的干细胞样细胞的持续存在情况 体外，以及这些细胞（可能）生成的PDTO的生长速率。本方案的关键步骤包括：（1）建立PDTO，使其达到可保证良好存活率的穹顶占据状态；（2）将PDTO暴露于不同剂量的电离辐射下，包括模拟照射的对照条件；（3）将PDTO解离为单细胞；（4）重新接种PDTO来源的单细胞；（5）进行活细胞成像，直至对照条件下达到预设的穹顶占据状态。
经过少量修改后，该方案预计可适用于多种市售的活细胞成像平台以及多种乳腺和非乳腺来源的PDTO，这些修改主要与PDTO形成效率及对照条件下PDTO的生长速率相关（这两者在不同PDTO之间可能存在显著差异）。一方面，单细胞分散后PDTO的基础形成效率将影响为获得新PDTO所需重新接种的单细胞数量，以达到既便于基于图像的PDTO定量分析，又能保证未处理PDTO正常生长的密度。另一方面，PDTO的生长速率将影响实验的持续时间.......
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披露
与本工作无关，SCF 曾与默克（Merck）、瓦里安（Varian）、百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb）、Celldex、再生元（Regeneron）、卫材（Eisai）和礼来（Eli-Lilly）签订研究合同，并从拜耳（Bayer）、百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb）、瓦里安（Varian）、Elekta、再生元（Regeneron）、卫材（Eisai）、阿斯利康（AstraZeneca）、MedImmune、默克美国（Merck US）、EMD Serono、Accuray、勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、罗氏（Roche）、基因泰克（Genentech）、阿斯利康（AstraZeneca）、View Ray 和 Nanobiotix 获得咨询/顾问酬金。与本工作无关，SD 从Lytix Biopharma、EMD Serono、小野制药（Ono Pharmaceutical）、基因泰克（Genentech）和强生企业创新公司（Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc.）获得咨询/顾问酬金，并曾与Lytix Biopharma、Nanobiotix 和勃林格殷格翰（Boehringer-Ingelheim）签订研究合同。与本工作无关，LG 曾与Lytix Biopharma、Promontory 和 Onxeo 签订研究合同，从勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、阿斯利康（AstraZeneca）、OmniSEQ、Onxeo、The Longevity Labs、Inzen、Imvax、Sotio、Promontory、Noxopharm、EduCom 和 Luke Heller TECPR2 基金会获得咨询/顾问酬金，并持有 Promontory 的股票期权。
致谢
感谢 Raymond Briones 和 Wen H. Shen（美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院）在本实验方案开发过程中提供的帮助。本研究工作获得了美国国防部乳腺癌研究计划（US DoD BCRP）转化性乳腺癌联盟基金（#W81XWH2120034，项目负责人：Formenti）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 40 µm 细胞筛网滤器 | Thomas Scientific | 1164H35 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Cellometer Auto T4 明场细胞计数仪 | Nexcelom | ||
| DMEM F/12 | Corning | 12634-010 | |
| 表皮生长因子 hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| EVOS FL 数字倒置荧光显微镜 | Thermo Fisher Scientific | 12-563-460 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF7 | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050061 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| IncuCyte 软件 2021A | Sartorius | 版本：2021A | |
| Incucyte SX1 | Sartorius | 型号 SX1 | |
| Incucyte 验证用 48 孔板 | Corning | 3548 | |
| Matrigel | Discovery Labware | 354230 | |
| nAc | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | 购自美国纽约威尔康奈尔医学院 Englander 精准医学研究所 | ||
| 未处理 6 孔板 | Cellstar | 657 185 | |
| NR（Heregulin） | Peprotech | 100-03 | |
| p38 MAP 抑制剂 p38i SB202190 | Sigma Aldrich | S7067 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 青霉素-链霉素（PenStrep） | Invitrogen | 15140-122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Rspondin 培养基 | 购自美国纽约威尔康奈尔医学院 Englander 精准医学研究所 | ||
| 小型动物放射研究平台（SARRP） | Xstrahl Ltd | ||
| TGFβ 受体抑制剂 A83-01 | Tocris | 2939 | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Gibco | 15250-61 | |
| TrypLE | Gibco | 112605-028 | |
| Y-27632（Rho激酶抑制剂） | Selleck | S1049 |
参考文献
- De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13(2019).
- Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for prostate cancer. Int J Radi....
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重印与许可
