本文介绍一种通过气管切开术进行气管插管，随后实施开胸手术的大鼠标准化操作流程，旨在提高需要侵入性通气及暴露胸腔器官的非存活性实验应用的精确性和可重复性 体内 大鼠模型
本文内容
摘要
摘要
在大鼠模型的转化研究中，气管插管及后续通气通常是许多干预措施的基本要求，尤其是需要控制或高通气压力、或进入胸腔及器官的研究。通过口腔解剖通路进行的传统经口气管插管适用于存活实验。然而，该操作存在一些挑战，包括通常需要较高的操作经验与技术水平、更先进的设备，以及更长的操作时间，且存在一定的插管失败率和并发症风险，如气管穿孔、短暂性全身低氧血症和明显的气体泄漏。
因此，本论文提供了一种详细的分步操作方案，用于在非存活大鼠模型中经气管切开进行气管插管，适用于需要确保插管成功、维持恒定氧合水平、实现高通气压力或实施开胸手术的情况。
该方案强调了精细手术技术的重要性，以确保结果的一致性和可靠性，尤其适用于缺乏经验或不常进行经喉镜直接气管插管技术的研究人员。因此，该操作有望减轻动物痛苦并减少不必要的动物损耗。
引言
一般来说，啮齿类动物比患者更能长时间耐受呼吸窘迫。在自主呼吸条件下，它们能够更长时间地维持心循环稳定和充分的生理状态，即使在肝移植等对心肺循环压力极大的侵入性手术过程中也是如此，而肝移植被认为是心肺循环负担最重的手术之一1,2,3。
然而，在多种生物医学领域所开展的不同实验条件和干预措施的转化研究中，气管插管是大鼠模型的基本要求，在当今科学界具有重要意义4,5,6,7,8,9,10,11。尽管目前大多数针对大鼠的实验动物研究仍不需要侵入性通气12，但某些实验设计必须进行插管并实施可控的呼吸支持。这些实验设计包括需要确保气道通畅、高通气压力，以及腹腔镜操作或对胸腔及器官直接进行干预的实验。
特别是在需要进入胸腔及胸腔内器官的情况下，气管插管至关重要，因为一旦胸膜腔内的负压以及肋间肌和膈肌的吸气机制丧失，肺脏塌陷将导致致命的呼吸功能不全13。
尽管已有大量关于啮齿类动物无创经口插管方法的文献报道14,15,16,17，但针对通过气管切开术实施有创气管插管的操作规程却似乎较为缺乏。尽管气管切开插管属于侵入性操作，仅适用于非存活动物模型，但其具有诸多显著优势，包括学习曲线更陡峭、成功率更高且更稳定、所需技术设备更少，以及更佳的操作成功监测条件18,19。
插管成功与否对实验结果至关重要。在患者中，各种错误的插管操作以及反复多次的插管尝试均明确与不良事件和严重并发症（包括死亡）相关20,21，此类事件在实验动物中同样有害。在最理想的情况下，这些操作会成为实验中强烈的混杂变量，但也可能导致实验动物的非必要损耗。因此，如果实验设计和策略允许，在牺牲一定非侵入性的前提下提高插管成功率是合理的。
通过手术气管切开术进行插管的这一标准化方案具有多项优势，包括降低插管成功率的变异性、最小化对心肺生理参数的影响，以及实现对各项参数的完全研究控制与操作。该方法有助于建立可靠的气道，尤其适用于在经直接喉镜进行气管插管操作方面经验不足的研究人员，并使研究人员能够在高度受控的条件下开展非存活性研究。我们强调了关键的解剖学标志，并提供了针对操作过程中常见问题的解决思路。
方案
本文所述所有动物实验均已获得德国卡尔斯鲁厄巴登-符腾堡州地区委员会机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。实验动物的管理遵循机构标准、德国动物使用与护理法律法规、欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）以及ARRIVE指南，并在经认证的设施中进行。实验所用动物为来自Janvier Labs的雄性Spraque Dawley大鼠，订购时体重为400 g。
1. 实验步骤准备（图1）
- 通过将套管在距尖端1 cm处以135°角弯折，使用鲁尔锁接头将其连接至塑料灌流管，并利用外科蚊式钳施加张力，制备手术准备钩（图1A，B）。
- 准备啮齿类动物手术暴露装置。
注意：除可购买的商用平台外，也可如本研究中所述，自行低成本构建。- 为此，使用一块40 cm × 50 cm、厚度为4 mm的钢板。在预定位置使用钢钻加工多个直径为8 mm的孔，作为后续张力固定点。将Y形固定杆插入这些孔中。
- 在手术暴露装置的钢板上方放置加热垫，以提供热支持。
- 准备好带有连接塑料管和外科蚊式钳的手术准备钩，用于后续对组织施加张力以实现手术暴露。
- 取下带有雄性鲁尔锁接头的10 mL塑料注射器的堵头，切除注射器近端。将远端部分如图插入通气袋中，并使用热缩管覆盖接口处，再用实验室喷灯轻微加热，实现气密性密封（图1D–F）。
- 剪短并斜面处理不同规格的静脉留置针，将动脉导丝套件中的导丝（柔性端位于尖端）插入与动物体型相匹配的留置针中（预计为14 G），用于插管过程中后续的赛尔丁格技术22，23（图1G，H）。
图 1：实验装置示意图。 (A) 折叠的套管连接灌流管，用作手术准备钩。(B) 带夹钳的准备钩固定在金属固定杆上。 (C) 干预前处于镇静状态的动物。(D) 新生儿科用呼吸球囊。(E-F) 使用热缩管将鲁尔锁式注射器气密性地安装到呼吸球囊上。(G) 不同规格的短化并斜面处理的静脉导管，配有Seldinger技术用动脉导引导管套件中的导丝。(H) 最终定制组装的装置。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 麻醉与镇痛
- 使用所选药物对大鼠进行麻醉。
注意：此处使用10%的氯胺酮（100 mg/mL）、2%的赛拉嗪（20 mg/mL）、卡洛芬50 mg/mL以及异氟烷进行麻醉和镇痛。赛拉嗪和卡洛芬以1:10稀释液作为应用时的储备溶液。- 将动物放入诱导箱中，以5 L/min的流速通入100%氧气，并通过蒸发器加入4%（v）异氟烷以诱导麻醉。
- 待动物失去意识后，将其从诱导箱中取出，并腹腔注射（i.p.）氯胺酮100 mg/kg体重和赛拉嗪4 mg/kg体重。
注意：对于一只400 g的动物，相当于注射40 mg氯胺酮（0.4 mL原液）和1.6 mg赛拉嗪（0.08 mL原液或0.8 mL的1:10稀释液）。 - 将动物重新放回充满异氟烷的诱导箱中，直至腹腔注射的药效发挥作用。
- 通过用力捏压足趾测试大鼠无反应，以确认适当的麻醉深度。
- 在眼睛上涂抹眼用软膏。
- 在手术过程中评估并维持麻醉深度。
- 当麻醉效果随时间减弱（约每小时一次）时，皮下注射（s.c.）额外的氯胺酮50 mg/kg体重和赛拉嗪1 mg/kg体重。对于一只400 mg的动物，相当于20 mg氯胺酮（0.2 mL原液）和0.4 mg赛拉嗪（0.2 mL的1:10稀释液）。
- 在开胸术前，通过皮下注射给予5 mg/kg体重的卡洛芬以提供额外镇痛。对于一只400 mg的动物，相当于2 mg卡洛芬（0.04 mL原液或0.4 mL的1:10稀释液）。
3. 手术准备（图2）
- 通过经鼻新生儿面罩给予动物吸入100%氧气，以使动物血液循环充分氧合（图2A）。
- 5分钟后，从经鼻新生儿面罩切换至使用带有雄性塑料注射器鲁尔锁接头的新生儿通气袋装置，如上所述，并将注射器接头靠近动物鼻尖处提供溢流式氧气（图2B）。
- 沿预定长度行胸颈正中皮肤切口，使用手术牵开钩暴露手术区域（图2C，D）。
- 使用精细剪刀钝性分离颈筋膜，继续解剖推进；暴露胸锁乳突肌和舌骨下肌群，在左侧侧膜解剖后将正中舌骨下肌向右侧牵开（图2E-G）。
- 钝性分离至气管，并使用奥弗霍尔特钳（Overholt clamp）进行气管隧道分离（图2H-I）。
- 使用硅胶血管环套绕气管，并用多股缝合线对远端气管进行双环套扎，以备后续气管内插管固定之用（图2J-N）。
图2气管的制备 (A) 通过面罩吸入氧气。B) 切换至带公鲁尔锁接头的注射器以供氧。C胸颈皮肤切口。D) 经颈筋膜的制备。E胸锁乳突肌和舌骨下肌群的暴露。F) 甲状舌骨肌中线的偏侧化。G向气管方向钝性分离。H使用Overholt钳进行气管隧道式分离。 (I) 使用硅胶血管环牵引气管。J-N使用多股缝合线对气管进行尾侧双环悬吊，以备后续固定经气管插管。 请点击此处以查看此图的放大版本。
4. 插管操作（图3）
- 使用无创镊子向尾侧延长气管（图 3A，B）。
- 使用剪刀对气管进行周长180°的不完全切口（图 3C–F）。
- 将Seldinger导丝的柔软端插入气管内（图 3G–H），随后沿Seldinger导丝将合适粗细的改良静脉导管导入气管（图 3I–N）。
- 撤出Seldinger导丝（图 3O），将气管导管的鲁尔锁接头连接至改良的呼吸囊，开始采用高频率、低潮气量进行轻柔的手动肺保护性通气（图 3P）。在尚未实施前胸正中开胸术且肺未完全暴露之前，持续进行手动通气。
- 使用滑结扎紧先前放置的锁线，以防止漏气及导管意外脱出（图 3Q–T）。
图3：经气管切开行气管插管。（A）准备完成后的初始状态。（B）使用无创镊子向尾侧延长气管。（C-F）对气管进行周长180°的部分切开。（G,H）将Seldinger导丝插入气管内。（I-M）在Seldinger导丝引导下，将改良的静脉导管插入气管。（N-O）撤出Seldinger导丝。（P）使用鲁尔锁接头将气管导管连接至改良的呼吸囊。（Q-T）结扎先前放置的锁定缝线，以防止导管意外脱出。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 人工通气与正中开胸术（图4）
- 使用钝性且稳定的材料剪刀从剑突开始行正中开胸术（图4A，B），并沿胸骨向上方继续切开。当剪刀在胸骨后方推进或进行切割操作时，应始终暂停通气数秒钟，以避免对肺组织造成损伤（图4C–E）。
- 使用外科牵开钩获得胸腔暴露，并去除纵隔的浆膜层（图4F–H）。
- 以所需的频率和潮气量继续手动通气，并扩展监测措施（例如建立动脉内血压监测，根据实验目的或具体研究问题置入中心静脉导管或肺动脉导管）（图4I–L）。
图 4：手动通气与正中开胸术。 （A）插管后的初始状态。（B-E）从剑突开始的正中开胸术。（F-I）使用手术牵开钩暴露胸腔。（J）通气期间的最终设置。（K-L）手动通气的操作过程。请点击此处查看此图的放大版本。
6. 安乐死
- 对深度麻醉的动物使用剪刀进行快速锐性心脏切除，以实施安乐死。
结果
对10只雄性大鼠（平均体重405 ± 30 g）进行经气管切开的气管插管及后续开胸手术，用于非存活实验。该操作由一名二年级外科住院医师完成。以插管和通气后存活超过20分钟为标准，操作成功率为100%。从皮肤切口至气管插管固定，准备和插管操作的平均持续时间为6分55秒 ± 53秒（表1）。
| 使用的动物数量 | 10 |
| 体重（均值 ± 标准差） | 405 ± 30 g |
| 插管成功率 | 100% |
| 操作持续时间（均值 ± 标准差） | 6:55 ± 0:53 min |
| 平均血氧饱和度 | 96% |
| 最低血氧饱和度 | 92% |
表1：代表性结果。 该方案在10只动物中的代表性结果。
通过后肢的一次性自粘式脉搏血氧仪探头监测血氧饱和度，饱和度从未低于92%。在切开膈肌前，保持自主呼吸。所有大鼠均存活至实验测量所需的20分钟，随后通过突然快速心脏切除实施安乐死（图5）。
图5：外周血氧饱和度。 整个实验过程中测量的外周血氧饱和度。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
仅在美国，每年就有约1.1亿只大鼠和小鼠被用于动物实验24。尽管目前无法获得可靠的统计数据，但其中相当一部分动物需要接受辅助通气，尤其是在肺部和心脏研究以及麻醉学领域。这些动物大多数接受的是无创性经口插管，该方法存在诸多挑战，包括学习曲线较慢、插管失败率较高、再插管次数增多，以及相关的呼吸系统并发症和气道漏气等问题25。因此，无创性插管通常需要经验更丰富的研究人员、更先进的技术设备（如光纤设备、二氧化碳监测和机械呼吸机）以及更多的财力和物资资源26。插管这一环节本身因此成为后续统计分析和个体间结果异质性中一个有意义的混杂因素。然而，在纵向实验设计中，无创性经口插管往往是唯一可行的选择。
替代方法包括在需要长期气管通路的纵向实验中采用气管切开造口术，或在非存活实验中采用“一次性使用”的外科气管切开术。尽管已有大鼠气管造口术显微外科技术的操作方案27，但目前尚无针对非存活大鼠模型经气管切开行气管插管的技术方案。
因此，本文所述通过气管切开术进行气管插管并随后实施开胸手术的大鼠标准化操作流程，为从事非存活实验的研究人员提供了一种有价值的方法。该操作无需专业人员或 extensive 培训，其插管成功率远高于经口或经鼻气管插管，且可实现更为可控的操作步骤。
所介绍的技术主要局限性包括操作的侵入性，以及由此导致仅适用于非存活实验。由于皮肤和软组织存在较大缺损，且伴有切开性气管瘘，因此该操作后无法实现拔管和恢复，尤其在同时进行开胸手术的情况下，更不建议尝试拔管和恢复。
在解决该操作过程中常见问题时，我们希望强调以下要点和建议：应尽可能充分地准备设备和药物。实验人员应通过精细操作并使用无创棉签，仔细进行止血控制。应充分暴露气管，长度至少达到0.5 cm，以确保足够的活动度；同时使用硅胶血管环，防止切开后气管滑入组织深处而丢失，否则可能因背景现象导致气管坠入深部组织，引发误吸和窒息。使用剪刀切开气管时，应仅部分切开，且仅用一次明确的剪切动作完成。理想情况下，应切开气管周长的180°。若切开范围小于此值，可能导致插管失败；若超过此值，则可能导致气管断裂，两端回缩至组织深部，进而引起窒息。在使用聚丝缝线固定气管插管时，应采用滑动结，以确保结扎足够紧密，防止漏气或导管意外脱出，同时避免无意中压闭导管。缝合过程中保留Seldinger导丝在原位，有助于防止导管被意外关闭。使用呼吸球囊进行手动通气时，应严格避免因潮气量过高导致肺部气压伤。相反，应采用肺保护性通气策略，即高频、低潮气量通气，尤其是在尚未进行开胸手术、无法直观评估肺容积的情况下更应如此。
通过提供一种详细且可重复的方法，本方案有助于实验流程的标准化，提高不同研究之间数据的可靠性和可比性。因此，该方法促进了临床前研究中科学技术的优化，最终增强了生理学、药理学、外科学及生物医学领域研究成果的转化相关性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者衷心感谢由巴登-符腾堡州科学、研究与艺术部（MWK）和德国研究基金会（DFG）通过资助号 INST 35/1314-1 FUGG 和 INST 35/1503-1 FUGG 支持的数据存储服务 SDS@hd。此外，作者衷心感谢德国海德堡国家肿瘤疾病中心（NCT）通过其结构化博士后项目和肿瘤外科项目提供的支持。我们还感谢巴登-符腾堡州议会批准的州级资金对海德堡—曼海姆创新园区健康与生命科学联盟结构化博士后项目的支持，该项目支持 Alexander Studier-Fischer 参与“健康领域的人工智能”（AIH）——该项目由德国癌症研究中心（DKFZ）、欧洲分子生物学实验室（EMBL）、海德堡大学、海德堡大学医院、曼海姆大学医院、中央心理健康研究所和马克斯·普朗克医学研究所以及合作开展。此外，我们感谢曼海姆大学医学中心 DKFZ HECTOR 肿瘤研究所提供的支持。本出版物的出版费用得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）在资助计划中的财政支持 "开放获取出版费用" 以及海德堡大学。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 新生儿一次性使用 Ambu Spur II 人工呼吸气囊 | Meier Medizintechnik | 335 102 000 | 人工呼吸气囊 |
| BD Microlance 3 套管针 20 G | BD (Beckton, Dickinson) | 301300 | 套管针 |
| BD Microlance Discardit II 20 mL 注射器 | BD (Beckton, Dickinson) | 300296 | 塑料注射器 |
| 固定杆 | Legefirm | 500343896 | 用作 Y 形金属固定杆的音叉 |
| 热缩管 | Sekesoer | RSG-400 | 热缩管 |
| 静脉导管 | BD (Beckton, Dickinson) | 393230 | BD Venflon Pro Safety 静脉导管 14 G；使用剪刀剪短；也可选用 16 G 或 18 G |
| 塑料灌注管 | M. Schilling GmbH | S702NC150 | 连接管 COEX 150 cm |
| 多股缝合线 | COVIDIEN | CL331 | 推荐使用 1 至 2 号强度的多股外科缝合线；针头可拆除 |
| Royal Gardineer 加热垫 S 型号，20 瓦 | Royal Gardineer | IP67 | 加热垫 |
| Seldinger 导丝 | VYGON | 115.798 | 动脉导管套件中的金属导丝 |
| 硅胶血管环扎带 | SERAG WIESSNER | SL26 | 2.5 mm 红色硅胶血管环扎带 |
| Sprague Dawley 大鼠 | Janvier Labs | 体重 400 克的雄性大鼠 | |
| 钢板 | Maschinenbau Feld GmbH | C010206 | 镀锌钢板，40 × 50 cm，厚度 4.0 mm |
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