小鼠胰腺内皮细胞的分离

摘要

本方案描述了从小鼠完整胰腺中分离内皮细胞的方法。

摘要

胰腺是维持机体代谢平衡的重要器官，部分原因在于其能够产生胰岛素和胰高血糖素等代谢激素以及消化酶。胰腺也是一个高度血管化的器官，这一特性得益于复杂的胰腺毛细血管网络。这一广泛的毛细血管网络由高度有孔的内皮细胞（ECs）构成，这些细胞对胰腺的发育和功能至关重要。因此，ECs的功能障碍可能在糖尿病和癌症等疾病中导致胰腺功能异常。因此，研究胰腺内皮细胞（pECs）的功能不仅有助于理解胰腺生物学，也有助于相关疾病的病理机制研究。小鼠模型是研究代谢性和心血管疾病的重要工具。然而，由于ECs数量相对较少，且腺泡组织可能释放大量消化酶，导致细胞损伤和得率低，目前尚无详细描述的小鼠pECs分离方案。为应对这些挑战，我们设计了一种富集和回收小鼠pECs的方案，结合了温和的物理和化学解离以及抗体介导的筛选方法。本文所述方案提供了一种从完整小鼠胰腺中提取完整且具有活性的ECs的可靠方法。该方案适用于多种下游检测，并可应用于多种小鼠模型。

引言

胰腺是代谢调控和内环境稳态的关键器官，具有高度血管化的结构。胰腺兼具内分泌和外分泌功能，分别负责调节血糖水平和消化酶的分泌。这两个功能区通过广泛的胰腺血管网络相互连接，促进氧气、激素和酶的交换与运输。尤为重要的是，这一致密的毛细血管网络深入朗格汉斯岛（Islet of Langerhans）——胰腺内负责内分泌功能的一类激素调控细胞群，其主要由分泌胰高血糖素的α细胞、分泌胰岛素的β细胞以及分泌生长抑素的δ细胞组成^1,2。尽管胰岛仅占胰腺总质量的1–2%，却接收了约20%的总血流量³，凸显了胰岛血管系统的重要性。胰腺毛细血管主要由高度 fenestrated（有孔）的内皮细胞（ECs）构成，这些细胞周围被壁层周细胞（mural pericytes）包绕。这些毛细血管内皮细胞在胰岛的发育、成熟及功能（或功能障碍）中发挥关键作用，并与多种内分泌和外分泌细胞之间形成密切的交互作用⁴（图1）。

在1型和2型糖尿病中均观察到内皮功能障碍，这两种疾病是最常见的由胰岛功能障碍引起的病症^5,6。糖尿病可导致胰....

方案

组织分离操作根据希望之城贝克曼研究所动物护理和使用委员会（IACUC，美国加利福尼亚州杜阿尔特）批准的研究方案 #17010 进行。本研究中使用的是在 C57BL/6 背景下、年龄为 8 至 12 周的 Tie-2CreERT2;Rosa26-TdTomato 小鼠品系。在此品系中，内皮细胞（ECs）在给予他莫昔芬诱导后可被 TdTomato 标记，方法如先前所述³⁴。然而，本方案可适用于不同基因型和遗传背景的成年小鼠的各个年龄段。

1. 组织采集（预计时间：1-2 小时）

注意：每只动物的操作时间约为 15 分钟，建议每次解离样本最多合并 3 只动物。

1. 采用过量二氧化碳（CO₂）实施安乐死，并通过二次确认确保动物死亡。解剖前，用70%乙醇（EtOH）喷洒整个动物体表，彻底消毒操作区域。
2. 用大头针固定四肢并拉直。使用手术剪从腹部下端开始，沿中线方向剪开皮肤和腹膜，切口向上延伸至胸腔区域。
3. 剪开膈肌以暴露肋骨，抬起肋骨以显露心脏。
4. 将连接注射器（内含冰上预冷的无菌PBS）的针头（25G–30G）插入心脏左心室。
5. 以5–10 mL/min的速度经心脏灌注PBS。灌注10 mL后停止，或直至肝脏和肾脏颜色变浅为止。

结果

按照本方案，可获得约 2 x 10⁶ 当合并3只小鼠的胰腺时可获得活细胞，单只小鼠胰腺可获得750,000个细胞。为验证内皮细胞（EC）的富集效果，我们进行了以下分析：1）定量PCR：与流穿组（FT）样本（即未与CD31抗体结合的组分）相比，EC组分中相关标志物的表达水平显著升高 Pecam1 （编码 CD31）和 Kdr （编码VEGFR2），两种内皮细胞标志基因³³，以及更低水平的NK6同源框1（Nkx6.1，胰腺内分泌细胞中的一种转录因子（图4A）；2）Western印迹：三个制备样品中的内皮细胞富集组分（pEC-1-3）在预期大小（约130 kDa）处显示出强烈的CD31信号。相比之下，输入样品和流穿样品中的CD31信号极弱。作为阳性对照，pEC细胞系MS1细胞的裂解液也显示出强烈的CD31信号（图4B）；3）台盼蓝染色：我们发现分离细胞的存活率约为50%（

讨论

本文介绍了一种富集和分离胰腺内皮细胞（pECs）的实验方案。与以往从其他组织或器官中分离内皮细胞（EC）的方案类似，本方案主要包括三个关键步骤：物理性解离、酶消化以及基于抗体的内皮细胞富集。为应对胰腺组织处理过程中的独特挑战，我们在方案中引入了若干关键改进和关键步骤：1）采用温和的一步式胶原酶消化法，并缩短孵育时间；2）添加较高浓度的DNase和胰蛋白酶抑制剂，以最大限度减少DNA污染和内源性酶消化，这些因素可能干扰抗体结合，从而降低内皮细胞的富集效率和细胞活性；3）在消化步骤后进行细胞计数，以调整加入样本的抗体用量，从而优化内皮细胞的富集效果。在优化该方案的过程中，我们测试了先前研究中使用的其他酶类，例如胰蛋白酶²⁸、IV型胶原酶³¹，以及不同的消化温度（如4 °C）和不同的孵育时间（表1）。我们发现，I型胶原酶在37 °C下消化20分钟是小鼠pEC分离的最佳条件，因此本研究采用此条件。尽管在灌注过程中加入抗凝剂可能提高整体细胞活性，但常用的抗凝剂（如EDTA或肝素）可能干扰某些酶的活性，例如用于细胞解离的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	USA Scientific	1615-5500
10 cm 培养皿	Genesee Scientific	25-202
25G 针头	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL 离心管	Thermo Fisher	14282300
6 孔板	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm 滤网	Fisher	22-363-548
抗 CD31 生物素标记抗体	Miltenyi Biotech	REA784
热激处理的牛血清白蛋白	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
离心机	Eppendorf
Ⅰ型胶原蛋白（来自小牛皮）	Sigma Aldrich	C9791	实验方案中的贴壁试剂
Ⅰ型胶原酶	Worthington Bio	LS004197
Countess 自动细胞计数仪	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	免疫荧光染色
一次性安全手术刀	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNase I	Roche	260913
D-PBS (含 Ca²⁺, Mg²⁺)	Thermo Fisher	14080055
乙醇	Fisher	BP2818-4
胎牛血清	Fisher	10437028
培养箱			维持在 37 °C、5% CO2
LS 柱	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199 培养基	Sigma	M2520-1L
MACS 多功能支架配 QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
抗生物素磁珠	Miltenyi Biotech	130-090-485
显微镜	Leica		用于评估细胞形态
分子生物学级水	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R 摇床	Eppendorf
PECAM1 (CD31) 抗体	Abcam	ab56299	免疫荧光染色
PECAM1 (CD31) 抗体	R&D Systems	AF3628
磷酸盐缓冲液 (10X) (不含 Ca²⁺, Mg²⁺)	Genesee Scientific	25-507-XB
引物 36B4 小鼠正向	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
引物 36B4 小鼠反向	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
引物 Kdr 小鼠正向	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
引物 Kdr 小鼠反向	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
引物 Nkx6.1 小鼠反向	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
引物 Nxk6.1 小鼠正向	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
引物 PECAM1 小鼠正向	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
引物 PECAM1 小鼠反向	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
无 RNase 水	Takara	RR036B
无菌 12" 长镊子	F.S.T	91100-16
无菌精细镊子	F.S.T	11050-10
无菌精细剪刀	F.S.T	14061-11
组织培养皿 2 cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol 试剂	Fisher	15596018
台盼蓝	Corning	MT25900CI
胰蛋白酶抑制剂	Roche	10109886001
Tween-20
VE-钙黏蛋白抗体	Abcam	ab33168	免疫荧光染色
水浴锅