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方法文章

狨猴卵巢周期阶段判定中的采血与激素测定

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DOI：

10.3791/66691

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2024年7月5日

 , 
1National Center for Child Health and Development

本文内容

摘要

本方案描述了采集血液和尿液样本以测定孕酮/雌二醇和绒毛膜促性腺激素水平，从而确定卵巢周期阶段的方法。通过激素水平可预测并确定排卵时间，并可通过注射激素来调节卵巢周期和卵母细胞的生长。

摘要

普通狨猴是一种小型新世界猴。由于其许多生物学机制与人类相似，狨猴在神经科学、再生医学和发育等多个领域的医学与人类生物学研究中具有潜在的应用价值。然而，目前尚缺乏系统描述许多基础实验和操作方法的文献。本文详细介绍了测定狨猴体内性激素（孕酮、雌二醇和绒毛膜促性腺激素）水平的方法。这些激素水平的测定有助于预测卵巢周期所处的阶段，狨猴的卵巢周期通常为26至30天；准确判断周期阶段对于在正确的时间点采集卵母细胞/受精卵，以及为制备宿主雌性个体以培育基因修饰狨猴至关重要。

此外，性激素水平的测定对于内分泌学、动物行为学、早期发育以及生殖生物学研究具有重要意义。本方案详细描述了从股静脉采血、分离血浆用于激素测定、利用尿液和血浆检测绒毛膜促性腺激素水平、通过注射前列腺素F2α类似物重置卵巢周期以缩短并同步周期，以及通过注射促卵泡激素和绒毛膜促性腺激素促进卵泡生长和排卵的方法。采用这些方案，可准确判断卵巢周期的各个阶段，从而及时采集卵母细胞或受精卵。

引言

普通狨猴（Callithrix jacchus）是一种小型新世界猴，具有许多与人类相似的特征，其卵巢周期持续26–30天1,2。关于早期发育及基因修饰狨猴生成的研究，需要在卵巢周期的特定阶段采集卵母细胞和受精卵。因此，准确判断周期阶段至关重要，可通过检测血液中孕酮（P4）和雌二醇（E2）的激素水平进行估算2,3。这些激素促进子宫内膜生长，而子宫内膜生长是胚胎着床所必需的。P4由黄体产生，黄体在排卵后立即于卵巢中形成。E2则由卵巢卵泡在脑部下丘脑-垂体复合体分泌的促卵泡激素（FSH）刺激下分泌。随着卵泡成熟，E2水平逐渐升高，并在排卵前达到峰值3。在人类中，高水平的E2通过下丘脑-垂体复合体引发黄体生成素（LH）的脉冲式释放；这种LH激增会诱导排卵。然而，在狨猴中，LH基因在进化过程中发生了退化，排卵转而由垂体分泌的绒毛膜促性腺激素（CG）诱导，CG的结构与LH相似4,5。

卵巢周期可通过激素注射进行控制。在人类中，促卵泡激素（FSH）注射作用于卵巢上的FSH受体，用于促进雌激素合成和卵泡生长6。在卵泡期末期，以人绒毛膜促性腺激素（hCG）替代黄体生成素（LH）进行注射，可刺激人类排卵7。由于hCG可在妊娠早期刺激黄体，增加孕酮（P4）的产生，因此hCG注射也用于治疗人类不孕症。前列腺素F2α（PGF2α）注射可重置卵巢周期8。在家牛中，PGF2α注射被用于缩短黄体期，并同步发情周期，以利于繁殖管理。

尽管狨猴与人类具有相似的生物学机制，使其成为理想的模式动物，但目前仍缺乏描述许多常用技术基本方法的文献。采血是最常用的技术之一9,10,11,12。然而，初学者有时难以找到静脉。因此，本研究对股静脉区域进行了解剖学分析。基于解剖学观察，本方案将股三角近端区域作为易于进行静脉穿刺的部位予以介绍。

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方案

所有涉及狨猴的研究方法均遵循高伦理标准和福利规范，并已获得国家儿童健康与发育中心机构动物护理和使用委员会的批准。实验所用动物为单只饲养或成对饲养（一雌一雄），每日光照12小时。

1. 血液采样 股静脉

  1. 准备一支1 mL注射器（短型更易操作），安装25 G针头，针刃朝上。为避免血液堵塞，用200 µL未稀释的肝素钠溶液冲洗注射器：将肝素吸入注射器内，反复抽拉数次使其均匀涂布内壁，然后将肝素溶液排出。
    注意：由于常需更换新注射器，建议额外准备若干已肝素化的注射器。
  2. 准备好吸水棉和酒精棉片。打开可调光源，照亮用于放置狨猴采血区域的位置。
  3. 准备固定装置（420 × 85 × 85 mm，图1A），该装置为市售产品（详见材料表）。将固定装置的海绵绑带打开，放入狨猴，使其仰面朝上进入装置内。
    注意：狨猴在固定装置中通常较为安静，可能无需进行固定适应性训练。
  4. 捕捉狨猴，将其插入圆筒部分，并通过压紧海绵绑带加以固定。将用于采血的腿置于另一条腿之上（图1A）。用非优势手握住双腿，中指和无名指分别插入每条腿内侧以固定，其余手指置于外侧辅助固定。
    注意：捕捉狨猴时建议佩戴防咬手套。若无固定装置，应在麻醉状态下或由另一人协助固定狨猴后进行采血。
  5. 检查股静脉是否在大腿根部可见。如不可见，可通过触诊定位搏动的动脉，并以此为标志判断静脉位于其内侧走行（图1B-D）。
    注意：建议使用台灯照明并剃除局部毛发以提高可视性。也可用酒精棉片擦拭皮肤以增强静脉可见度。三角区内的淋巴结常靠近静脉，呈深蓝色类似静脉。如何区分两者详见“代表性结果”部分。
  6. 使用酒精棉片对穿刺部位进行消毒。将针头针刃朝上，以15°–20°角刺入皮肤。为防止采血过程中针头滑出血管，应稳定持注射器的手，例如将其支撑于另一只手上。
  7. 轻柔回拉活塞以产生负压（图1E），同时将针尖缓慢前推。一旦血液进入注射器，保持针尖位置不动，直至采集到所需体积（500–700 µL）。
    1. 若无血液进入注射器，应更换穿刺位置。若拔针时有血液流出，需对穿刺点施加压力止血3分钟。止血完成后，重新开始穿刺操作。
    2. 若采血过程中血液流入中断，可缓慢将针尖向前推进后再回撤，以重新定位血管，可能恢复血流。若仍无效，则拔出针头，更换新的注射器重新穿刺。
      注意：当同侧腿部难以采血时，可尝试使用对侧大腿进行采血。
  8. 拔针时用小指轻压穿刺点，随后立即用吸水棉签对穿刺部位加压3分钟以彻底止血。将注射器倒置，轻轻混匀血液与肝素。
    注意：若采集动脉血，应在冷敷条件下延长加压时间（5分钟），并仔细确认出血完全停止，以防血肿形成，严重时可能导致致命后果。
  9. 确认出血停止后，松开海绵绑带，一手握住动物腰部，另一手从背部穿过并握住其腋下，旋转动物使其安全脱离装置。
  10. 将狨猴放回笼中。为减轻应激并便于后续重复采血，可给予其喜爱的食物（如饼干、棉花糖或海绵蛋糕）。定期检查是否出现血肿。
    注意：若早期发现血肿，应立即加压包扎以防止进一步扩大。若发现较晚，可能需要手术清除血肿，并结扎股动脉及进行输血治疗9,13。
  11. 将针头从注射器上取下，以防溶血。然后沿1.5 mL微量离心管内壁缓慢排出采集的血液。
    注意：采集的血液可在4 oC保存最多24小时，之后进行血浆分离以测定P4/E2水平。

2. 血浆分离及激素水平测定

  1. 将血液在1.5 mL离心管中于4 oC条件下以1,100 × g离心5分钟。
  2. 小心吸取分离出的血浆（上清液）至新的离心管或样品杯中，避免混入血细胞（沉淀物）。
  3. 使用ELISA试剂盒或全自动分析仪测定P4和E2水平。若血浆量不足以进行全自动分析仪检测，可使用样本稀释液进行稀释。
    注意：使用全自动分析仪检测时，仅测定P4水平需血浆量>175 µL，同时测定P4和E2水平则需血浆量>250 µL。

3. 使用尿液绒毛膜促性腺激素检测来判断排卵和妊娠

注意：狨猴的绒毛膜促性腺激素（CG）水平可使用免疫层析试剂盒检测，用于判断排卵和妊娠。在排卵情况下，可在排卵前0-2天获得阳性结果；在妊娠情况下，可在妊娠第15-20天至约第100天期间检测到阳性结果。该检测仅需少量尿液（90 µL）（一滴尿液约30 µL）。

  1. 托盘法：若同一笼内饲养超过两只动物，应在前一天将目标狨猴（或其他动物）转移至另一笼中。在前一晚或开灯前将干净的托盘放置于笼底。由于夜间膀胱内的尿液不会排出，因此通常在开灯后不久即可从膀胱排尿。
    注意：早晨开灯前进入房间可能会干扰群体的睡眠周期。通常在开灯后约30分钟内可完成尿液采集。
  2. 挤压法：准备好已清洗的托盘用于尿液收集。找到狨猴的膀胱后，用手指全长从前方及两侧小心地轻轻挤压（图1F）。在早晨开灯前立即收集尿液。
    注意：若因膀胱无尿导致采集失败，可等待一段时间后再尝试。注意不可用力过大，以免损伤动物。
  3. 采集后立即取尿液样本加入免疫层析检测试剂盒的加样孔中。依据生产商说明书，在10分钟后读取结果。

4. 卵母细胞、受精卵和胚胎采集过程中卵巢周期阶段的控制与确定

  1. 从卵巢中收集生发泡（GV）卵母细胞
    1. 在黄体期末期（即黄体期开始后 ≥10 天），向肌肉注射 3 µL 浓度为 0.263 mg/mL 的氯前列醇（一种合成的 PGF2α 类似物），用 150 µL 生理盐水稀释后注射14（图 2），以重置卵巢周期。
      注意：配制较大体积的稀释液可能更为方便，因为稀释后的氯前列醇在 +4 °C 下至少可稳定保存数周。
    2. 次日（第 1 天），通过检测孕酮（P4）水平是否下降来确认卵泡期的开始。
      注意：已有文献报道，注射氯前列醇可在 24 小时内显著降低 P4 水平（通常 <10 ng/mL）3。
    3. 从第 1 天起，每隔 2 天注射一次 FSH（25 IU，肌肉注射），共注射 5 次（第 1、3、5、7 和 9 天）。第 10 天下午注射 hCG（75 IU，肌肉注射）。
    4. 第 11 天，在麻醉条件下通过卵泡穿刺法从卵巢中收集 GV 卵母细胞，操作参照文献方法15,16。
      注意：有时排卵会早于预期发生。因此建议从第 8 天起检测绒毛膜促性腺激素（CG）水平。若 CG 检测呈阳性，应在当天进行 GV 卵母细胞的收集。
  2. 中期 II（MII）卵母细胞、受精卵及早期胚胎的收集
    1. 按照步骤 4.1.1 所述方法，使用氯前列醇重置卵巢周期。
    2. 次日（第 1 天），通过检测 P4 水平是否下降来确认卵泡期的开始。
    3. 若需收集受精卵和胚胎，从第 6 天起将雌性狨猴与雄性狨猴同笼饲养以进行交配。
    4. 从第 7 天起，检测雌性狨猴的血液中 P4/E2 水平及尿液中 CG 水平。CG 的检出提示将在数日内（通常为次日）发生排卵。当 P4 水平较前一日升高、E2 水平较前一日降低时，从输卵管中收集 MII 卵母细胞或胚胎第 0 天（E0）的受精卵17,18。
    5. 对于胚胎收集，根据目标发育阶段，在适当时间点按照文献所述方法进行冲洗，可从输卵管中回收 E1–E3 阶段（1–8 细胞期）胚胎17,18，或从子宫中回收 E5–E10 阶段（8 细胞期至囊胚期）胚胎19,20,21,22。

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结果

本研究中所用动物的相关信息列于表1中。

股静脉的解剖学分析
使用一只实施安乐死的2岁雄性普通狨猴（I 7713M）进行股静脉的解剖学分析。股静脉和股动脉位于股三角区域内。股三角位于腹壁与大腿肌肉之间的交界处（图1B-D）。在大腿根部，一条粗大的静脉穿过倒置三角形的中央，动脉则与之平行走行于静脉的外侧。在远端区域，静脉和动脉逐渐变细并相互重叠，动脉位于静脉的上方（图1D）。

进行采血时，应以静脉为靶点，因为动脉损伤可能导致股动脉血肿，当出血严重时，可引发心血管休克13。尽管可以从股三角区及其远端静脉的任何部位抽取血液，但建议从股三角近端位置进行静脉穿刺，因为该处静脉较粗大，且与动脉的重叠程度较小。此外，近端部位的静脉位置表...

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讨论

寻找静脉是采血过程中最关键的一步。根据解剖学观察，本方案推荐将股三角区近端区域作为狨猴采血的便捷部位。利用该区域可方便地从较大静脉中进行采血。然而，即使采用本方案，仍有可能误伤动脉。一旦发生动脉损伤，建议持续压迫止血超过>5分钟，以防止血肿形成。此外，在压迫的同时，使用冰块冷敷穿刺部位也具有辅助效果。血肿可使用肝素（例如：Tensolvet 5.000 I.E. 凝胶）进行治疗。大多数血肿在接受连续3至4天的肝素治疗并口服0.05 mL美洛昔康（0.5 mg/mL，p.o.）后可自行消退。在大腿近端区域，动脉位于静脉的外侧。而在远端区域，静脉与动脉之间的距离更近，重叠程度更大，且动脉位于静脉的腹侧。根据这种位置关系，从大腿近端区域采血发生动脉损伤的风险可能更低。

此外，近端区域的股静脉较粗且位置表浅，便于使用针头进行定位。然而，从远端区域采血的优势在于可以保留近端部位的完整性，即使采血过程中静脉受损，仍可立即在同一肢体的近端部位进行重复穿刺。这是因为受损部位远端的静脉通常无法立即再次穿刺。但如果采血失败，可从另一条腿的近端部位进行重复采样。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢申春申、Akutsu Hiroko、Sugiki Fumiyo、Hashimoto Yuuna、Naritomi Hina、Sakamoto Yuuki 和Horigome Mikiko在建立本实验方案以及日常狨猴护理工作中提供的支持；感谢峰重贵对稿件提出的修改意见；感谢阿部裕子及Aiba实验室成员分享合子采集技术；感谢CIEA分享其在狨猴饲养与实验方面长达40年积累的经验与信息。本研究由AMED、JST和KAKENHI资助，项目编号分别为JP19gm6310010、JP20gm6310010、JP21gm6310010和JP22gm6310010（AMED），JPMJPR228B（JST），20H05764、20H03177和22K18356（KAKENHI）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AIA-360Tosoh Corporation0019945激素测定（P4/E2）
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATETosoh Corporation0020956激素测定（P4/E2）
AIA-PACK SUBSTRATE SET IITosoh Corporation0020968激素测定（P4/E2）
AIA-PACK WASH CONCENTRATETosoh Corporation0020955激素测定（P4/E2）
CMS-1CLEA Japan狨猴饲料
EstrumateMSD Animal HealthPGF2alpha类似物（氯前列醇）
Gonal-f 皮下注射液 150Merck Biopharma Co., Ltd.FSH
促性腺激素肌肉注射液 1000ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.872413hCG
肝素钠注射液 5,000 单位/5 mLMochida Pharmaceutical Co., Ltd.224122458采血
普通狨猴绒毛膜促性腺激素免疫层析检测试剂盒（Dual Checker）CLEA Japan, Inc.测定CG水平
低轮廓双臂显微镜照明灯 LPF-SDSHIOKAZE GIKEN采血用台灯
狨猴采血固定装置JIC JapanJM-1006采血
http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html
email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.血肿治疗
样品杯，3 mL，聚苯乙烯，适用于Tosoh 360和AIA-600 II，每袋1000个Globe Scientific110913激素测定（P4/E2）
ST AIA-PACK iE2Tosoh Corporation0025224激素测定（P4/E2）
ST AIA-PACK iE2 校准品套装Tosoh Corporation0025324激素测定（P4/E2）
ST AIA-PACK iE2 样品稀释液Tosoh Corporation0025524激素测定（P4/E2）
ST AIA-PACK PROGIIITosoh Corporation0025240激素测定（P4/E2）
ST AIA-PACK PROGIII 校准品套装Tosoh Corporation0025340激素测定（P4/E2）
ST AIA-PACK PROGIII 样品稀释液Tosoh Corporation 0025540激素测定（P4/E2）
带25 G（0.50 × 25 mm）针头的注射器TERUMOSS-01T2525采血
Tensolvet 5.000 I.E. 凝胶Dechra Pharmaceuticals14033492血肿治疗
TOSOH 多控校准品套装Tosoh Corporation0015965激素测定（P4/E2）

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