缺氧敏感的嵌合抗原受体-T 细胞的生成和功能验证

嵌合抗原受体 T 细胞 （CAR-T） 疗法代表了癌症治疗的重大突破。自 2017 年美国食品药品监督管理局 （FDA） 批准首个用于治疗晚期/耐药性淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的 CAR-T 疗法以来，^1,2,3， 10 种靶向 CD19 或 B 细胞成熟抗原 （BCMA） 的 CAR-T 疗法已在全球范围内获得批准⁴。然而，尽管进行了广泛的研究，但复制 CAR-T 疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面的显着疗效对于其在实体瘤中的应用仍然具有挑战性 5,6,7,8。

免疫抑制性肿瘤微环境 （TME） 是 CAR-T 在实体瘤环境中疗效不佳的主要因素。由于营养不足、缺氧、酸性 pH 值和代谢废物的积累，TME 会阻碍 CAR-T 细胞的活性和存活 9,10,11,12。进一步的敌意来自浸润免疫抑制细胞，例如调节性 T 细胞 （Treg）、髓源性抑制细胞 （MDSC） 和肿瘤相关巨噬细胞 （TAM），这些细胞与肿瘤细胞一起分泌免疫抑制细胞因子，一旦 CAR-T 细胞进入肿瘤，就会对 CAR-T 细胞造成额外的抑制^13,14。

除了治疗效果不令人满意外，安全性问题是 CAR-T 细胞在处理实体瘤时的另一个致命弱点^15,16。安全性问题源于这样一个事实，即迄今为止确定的肿瘤特异性抗原 （TSA） 都没有严格限于肿瘤细胞。换句话说，选择作为 CAR 靶标的肿瘤相关抗原 （TAA） 虽然在肿瘤细胞中表达较高，但通常也由正常组织表达¹⁷。因此，CAR-T 细胞在 CAR 有效识别正常组织时意外激活可能会产生靶向、非肿瘤效应，从而导致细胞因子释放综合征 （CRS）、CAR-T 相关脑病综合征 （CRES）¹⁸ 和其他不良后果¹⁹。

已经探索了许多策略来避免此类影响，包括降低 CAR 的亲和力，以允许 CAR-T 细胞根据靶向 TAA 的表达水平区分肿瘤细胞和正常细胞;为 CAR-T 细胞配备关闭开关，例如自杀基因或消除标志物，以促进它们在意外激活时被消除;将 CD3ζ 和共刺激信号分成两个 CAR 部分，因此需要同时参与是 CAR-T 细胞有效激活所必需的;利用基于合成 Notch （synNotch） 的电路，将 CAR-T 细胞的活性限制在共表达两种不同 TAA 的靶细胞上;以及通过实施一种机制来调整 CAR 表达以适应不断变化的环境线索，从而改造 CAR-T 细胞以获得 TME 敏感性 20,21,22,23,24,25,26。

上述 TME 敏感性选项的一个关键考虑因素是由于肿瘤细胞的快速增殖而导致的 TME 中的低氧水平。肿瘤细胞对缺氧的适应取决于缺氧诱导因子-1 （HIF-1） 的激活，HIF-1 是一种异二聚体转录因子，由一个诱导型亚基 HIF-1α 和一个组成型表达的亚基 HIF-1β²⁷ 组成。在常氧条件下，HIF-1α 蛋白发生泛素化和快速蛋白酶体降解，具体取决于其氧依赖性降解结构域 （ODD）²⁸。当细胞中的氧气供应受到限制时，HIF-1 会稳定下来，并通过与缺氧反应元件 （HRE） 结合来激活其下游靶基因的转录²⁹。鉴于 ODD 和 HRE 作为氧敏感元件的性质，已经探索了它们在缺氧 TME³⁰ 内实现 CARs 的条件表达。在这里，我们提出了一个方案，重点是缺氧敏感的 CAR-T 细胞的表型和功能表征方法，然后简要描述了 CAR 设计和这些细胞的制备程序。该协议旨在为利用缺氧反应性 CAR 生成具有抑制性肿瘤外毒性的 CAR-T 细胞提供有用的指南。

在这项研究中，将 HER2-BBz-ODD，一种靶向 HER2 （基因 ID: 2064） 的缺氧敏感 CAR 与其常规对应物 HER2-BBz 进行了比较。两种 CAR 的示意图如图 1A 所示，其中显示 HER2-BBz-ODD 是通过将 ODD 序列添加到 CD3ξ 的 C 端而从 HER2-BBz 衍生而来的。表达两种 CAR 的慢病毒载体的构建以及通过 293T 细胞转染产生相应的慢病毒已在前面描述^{过 31}。

1. 慢病毒感染产生缺氧敏感的 CAR-T 细胞

1. 在水浴中于 37 °C 快速解冻冷冻保存的人外周血单核细胞 （PBMC）。将解冻的 PBMC 转移到含有 9 mL 无血清淋巴细胞培养基的 15 mL 试管中，该培养基补充有 400 IU IL-2、5 ng/mL IL-7 和 10 ng/mL IL-15（人 T 细胞生长培养基， 以下简称 TGM ）。
2. 取等分试样进行细胞计数后，将试管以 300 × g 离心 5 分钟。用 TGM 以 4 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度重悬沉淀的 PBMC，并将悬浮液转移到 6 孔板中。
3. 制备抗 hCD3/hCD28 包被的免疫珠。
   1. 将 100 μL 小鼠 IgG 磁珠转移到 1.5 mL 微量离心管中，并使用含 PBS 的磁力架洗涤 2 次。
   2. 将磁珠重悬于 100 μL PBS 中，并添加 0.2 μg 小鼠抗人 CD3 抗体和 2 μg 小鼠抗人 CD28 抗体。使用移液管轻轻混合混合物，并在 4 °C 下摇动过夜。
   3. 使用含 PBS 的磁力架洗涤珠子 2 次，然后将它们重悬于 100 μL PBS 中。
4. 在步骤 1.2 中，以 1:1 的微珠与细胞比例将抗 hCD3/hCD28 包被的免疫珠添加到板中。将板放入 37 °C 下含 5% CO₂ 的加湿培养箱中。
5. 孵育 48 小时后，用移液管轻轻混合细胞后，将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中。将试管放在磁力架上 3 分钟，然后小心地将上清液转移到新的 15 mL 试管中，以去除 PBMC 中的免疫珠。
6. 取等分试样进行细胞计数，然后将 PBMC 以 5 × 10⁵ 个细胞/孔的浓度接种在 300 μL TGM 中，放入 48 孔平板中。将 200 μL 慢病毒原液添加到相应的孔中，并添加硫酸鱼精蛋白至终浓度为 10 μg/mL。
7. 将板在 32 °C 下以 1,000 × g 离心 1.5 小时，然后使用移液管小心地从每个孔中取出并丢弃 300 μL 上清液。然后，使用移液管加入 1 mL 新鲜 TGM，并将板置于 37 °C 的 5% CO₂ 加湿培养箱中。
8. 加入新鲜的 TGM 以将细胞密度调节至每 2-3 天一次 0.5-2 × 10⁶ 个细胞/mL。首先将细胞转移到 12 孔板中，然后转移到 6 孔板中。继续培养细胞，直到 4 mL 体积的细胞总数达到 6 × 10⁶ 。
   注:同时，按照上述相同的程序进行 Jurkat T 细胞的 CAR 转导，只是用含有 10% 胎牛血清 （FBS） 的RPMI1640培养基替换 TGM。

2. 使用流式细胞术评估 CAR-T 细胞中的氧依赖性 CAR 表达

1. 将步骤 1.8 中 CAR 转导的 T 细胞以 2.5 × 10⁶ 个细胞/孔的密度接种到两个 12 孔板中，溶于 2 mL TGM 中。将一个板直接放入 37 °C 下含 5% CO₂ 的加湿培养箱中（常氧条件，因为培养细胞的标准条件为 21% O₂），并将另一个板放入移动式 CO₂/O₂/N₂ 培养箱中，O₂ 水平预设为 1%（缺氧条件），然后将腔室保持在加湿中， 5% CO₂/94% N₂ 培养箱，37 °C。
2. 每 24 小时，在缺氧或常氧条件下从平板中收集 5 × 10⁵ 个细胞，放入 1.5 mL 微量离心管中。将试管以 500 × g 离心 5 分钟，去除上清液，然后通过移液将细胞轻轻重悬于 1 mL PBS 中。再重复一次 PBS 洗涤。
3. 将沉淀的细胞重悬于每管中的 50 μL FACS 缓冲液（补充有 2% FBS 的 PBS）中。加入 50 μL 1:100 稀释的 PE 偶联抗 Flag 抗体 （0.2 μg/mL），并通过移液充分混合。在室温下避光孵育 20 分钟。
4. 孵育结束时，向每个试管中加入 1 mL FACS 缓冲液。通过移液充分混合，然后以 500 × g 离心 5 分钟。
5. 使用移液管小心取出并丢弃上清液，然后再次重复步骤 2.4 一次。
6. 使用移液管小心取出并丢弃上清液。将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中，然后将所得细胞悬液转移到 5 mL 流管中。
7. 在步骤 2.6 中对细胞悬液进行流式细胞术，以确定表面 CAR 表达。包括未转染的 T 细胞作为阴性对照。
   1. 使用 FSC/SSC 和 FSC-A/FSC-H 门筛选活的单细胞。为每个样本收集 1 ×^{10 4} 个实时单个事件。对 EGFP 阳性的细胞（慢病毒载体中携带的组成型标志物，作为成功转导的 T 细胞的指标）进行门控，然后，藻红蛋白 （PE） 阳性的细胞（CAR 表达细胞）以测量 PE 阳性和中位荧光强度 （MFI）。

3. Western blot 分析 CAR 修饰的 Jurkat T 细胞中 CAR 表达的氧依赖性

1. 将第 1 切片中 CAR 转导的 Jurkat T 细胞以每孔 5 × 10 个⁵ 个细胞（500 μL 培养体积）的密度接种在含有 10% FBS RPMI1640培养基中。
2. 对于一个板，将 CoCl₂ 添加到实验孔中，至终浓度为 0 μM、50 μM 或 200 μM。然后，将板置于 37 °C（常氧条件）的加湿 5% CO₂ 培养箱中。对于另一块板，不要添加 CoCl₂ ，并将其置于移动式 CO₂/O₂/N₂ 培养箱中，O₂ 水平预设为 1%（低氧条件），然后再转移到同一培养箱中。
3. 孵育 24 小时后，将细胞悬液转移到 1.5 mL 微量离心管中。将试管以 500 × g 离心 5 分钟。首先使用 1 mL 移液器完全去除并丢弃上清液，然后使用 100 μL 移液器，然后将细胞沉淀重悬于 50 μL 的 1x SDS-PAGE 样品缓冲液中。
4. 在沸水浴中加热样品 10 分钟。立即将试管置于冰上 30 秒，然后以 16,000 × g 离心 30 秒。
5. 将 30 μL 澄清的样品加载到厚度为 1.5 mm 的 10 孔、10% SDS PAGE 凝胶的每个插槽中。将凝胶在 80 V 下运行 30 分钟，然后将电压增加到 100 V 并运行 1.5 小时。
6. 在电泳结束时，使用标准湿式转印方法将蛋白质从凝胶转印到 PVDF 膜上，电流和持续时间分别设置为 400 mA 和 1 h。
7. 在室温下将膜封闭在封闭缓冲液（PBST 中的 5% 牛奶 （w/v） 中的 PBST （PBS+0.05% Tween-20）） 中 1 小时。然后，切出 30 kD 和 40 kD 之间的一块用于检测 GAPDH 负载对照，切出 50 kD 和 70 k D 之间的一块用于检测 CAR 分子。
8. 将 30-40 kD 和 50-70 kD 片段分别与小鼠抗 GAPDH 抗体（1:2,000 稀释）和小鼠抗 Flag 抗体（1:2,000 稀释）分别在 3 mL 封闭缓冲液中在室温下孵育 2 小时或在 4 °C 下过夜。
9. 在室温下在平台摇杆上用 PBST 洗涤膜 3 x 5 分钟。
10. 在室温下用 HRP 偶联的山羊抗小鼠抗体（1:5,000 稀释）在 3 mL 封闭缓冲液中孵育膜 1 小时;然后用 PBST 洗涤膜 5 x 10 分钟。
11. 通过与 HRP 底物一起孵育来显影膜，然后使用发光图像分析仪可视化检测到的蛋白质条带。

4. 缺氧敏感 CAR-T 细胞介导的细胞毒性氧依赖性的 体外 评估

1. 在第 0 天，在两个黑色平底 96 孔组织培养板中，每个实验孔接种 1 × 10^{个 4} 个靶细胞（SKOV3-Luc 细胞）在 200 μL 含有 10% FBS 的 DMEM 中。
2. 第 1 天，小心地从每个孔的顶部去除 100 μL 上清液。在 100 μL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基中，以 1:1、2:1 和 4:1 的效应比添加 CAR-T 细胞或未转导的 T 细胞。
3. 如步骤 2.1 所述，使用移动式 CO₂/O₂/N₂ 培养箱，将一个板置于 21% O₂ 气氛中，另一个板置于 1% O₂ 气氛中。
   注:如果没有移动式 CO₂/O₂/N₂ 培养箱，则可向培养基中添加 CoCl₂ 来模拟低氧条件。
4. 第 2 天，共培养 24 小时后，使用移液管小心地将所有上清液（约 150-200 μL）转移到新的 U 形底 96 孔板中。储存在 -20 °C 以备以后检测细胞因子，请按照第 5 节中概述的程序进行操作。
5. 从步骤 4.4 开始，向黑色平底 96 孔板的每个实验孔中加入 60 μL 1x 被动裂解缓冲液。然后，将板放在摇床上摇动 30 分钟，以确保有效的细胞裂解。
6. 向每个实验孔中加入 60 μL 萤火虫荧光素酶底物，并立即使用酶标仪测量荧光素酶活性。
7. 使用公式 （1） 计算归一化细胞毒性 （%）:
   归一化细胞毒性 （%） = 100 - ×100 （1）

5. 检测缺氧敏感的 CAR-T 细胞分泌的 IL-2 和 IFN-γ

1. 第 0 天，在包被缓冲液中制备 1:250 稀释的 IL-2 或 IFN-γ 捕获抗体。向 96 孔 ELISA 板的每个孔中加入 100 μL 稀释的抗体，并在 4 °C 下孵育板过夜。
   注:包被缓冲液的制备方法是将 7.13 g NaHCO₃ 和 1.59 g Na₂CO₃ 溶解在 1 L 蒸馏水中，并将 pH 值调节至 9.5。
2. 第 1 天，通过用力将板倒置以去除未吸附的捕获抗体，然后用 200 μL 洗涤缓冲液（含有 0.05% Tween 20 的 PBS）洗涤孔 3 次。
3. 向每个孔中加入 200 μL 测定稀释剂（含 10% FBS 的 PBS），并在室温下孵育 1 小时。
4. 用力将板倒置，丢弃溶液;然后，用 200 μL 洗涤缓冲液洗涤孔 3 次。
5. 在室温下解冻步骤 4.4 中的冷冻上清液样品/板。完全解冻后，用 Assay Diluent 稀释样品和标准品。向包被的 ELISA 板的每个孔中加入 100 μL 稀释的样品或标准品，并在室温下孵育 2 小时。
   注:对于 IL-2 检测，建议使用 10 倍稀释，而对于 IFN-γ 检测，首选 50 倍稀释。
6. 用力将板倒置以去除样品和标准品，然后用每孔 200 μL 洗涤缓冲液洗涤孔 5 次。
7. 通过在测定稀释剂中以 1:250 的比例稀释 IL-2 检测抗体或 IFN-γ 检测抗体/链霉亲和素-HRP （SAv-HRP） 来制备工作检测溶液。向每个孔中加入 100 μL 工作检测溶液，并在室温下轻轻摇动板孵育 1 小时。
8. 弃去溶液，用 200 μL 洗涤缓冲液洗涤孔 7 次。
9. 向每个孔中加入 100 μL 底物试剂，并在室温下避光孵育板 30 分钟。
10. 向每个孔中加入 50 μL 终止液 （1 M H₂SO₄）。立即使用酶标仪读取 450 nm 处的吸光度。

将 HIF-1α 的 ODD 结构域与 CAR 部分融合是产生缺氧敏感 CAR 的主要策略。本研究中分析的缺氧敏感的 HER2 靶向 CAR 命名为 HER2-BBz-ODD，是通过将 ODD 序列整合到其常规 HER2-BBz 中来使用这种策略构建的（图 1A）。在这项研究中，我们使用慢病毒转导表达 HER2-BBz-ODD CAR 或 HER2-BBz CAR，随后检测了它们在两种细胞类型中的氧敏感性:人 PBMC 和 Jurkat T 细胞。

第一项检查是低氧条件下 CAR 与常氧条件下的表达，通过流式细胞术在 CAR 转导的 PBMC 衍生的 T 细胞中进行，通过蛋白质印迹在 CAR 转导的 Jurkat T 细胞中进行。在 CAR 转导的 PBMC 衍生的 T 细胞的情况下，我们观察到 HER2-BBz-ODD CAR 在 1% O2 下的表达在 CAR 阳性细胞的百分比和中位荧光强度 （MFI） 方面显着高于 21% O2 下的表达（图 1B）。CAR 转导的 Jurkat T 细胞的免疫印迹分析也证实了 HER2-BBz-ODD 的缺氧依赖性诱导。

值得注意的是，在这种情况下，可以通过向培养基中添加 CoCl2（一种缺氧的化学诱导剂）来方便地模拟低氧条件。如图 1C 所示，我们的免疫印迹结果表明，暴露于 50 或 200 μM CoCl2 概括了暴露于 1% O2 的影响，显着诱导了 HER2-BBz-ODD CAR 的表达，而不是 HER2-BBz CAR 的表达。用 PBMC 来源的 CAR-T 细胞对缺氧敏感的 CAR 进行功能表征。在该研究中，使用携带萤火虫荧光素酶的 SKOV-3 细胞系作为靶细胞系。这种设置使我们能够测量靶细胞相关的荧光素酶活性，作为评估共培养 CAR-T 细胞介导的细胞毒性的代理。

如图 1D 所示，测量表明 HER2-BBz CAR-T 细胞有效杀死靶细胞，无论大气是常氧还是缺氧。相比之下，对于所有检查的三种 E:T 比率，HER2-BBz-ODD CAR-T 细胞在常氧条件下表现出显着较弱的细胞毒性。然而，当暴露于低氧条件下时，它们的细胞毒性显着增强。CAR-T 细胞与靶细胞共培养 24 h 后，ELISA 检测 IL-2 和 IFN-γ 的上清液水平。对于这两种细胞因子，观察到 HER2-BBz-ODD CAR-T 细胞在 1% O2 下的分泌高于 21% O2 ，这与细胞毒性数据一致。相比之下，HER2-BBz CAR-T 细胞在 1% O2 下显示两种细胞因子的分泌低于 21% O2，表明缺氧对细胞活性有不利影响（图 1E）。综上所述，这些结果令人信服地验证了 HER2-BBz-ODD CAR 的缺氧敏感性。

图 1:缺氧敏感的 CAR-T 细胞的构建和表征。 （A） 缺氧敏感的 CAR HER2-BBz-ODD 及其常规对应物 HER2-BBz 的设计示意图。两种 CAR 都由一个 N 末端 CD8α 信号肽、一个 FLAG 标签、一个靶向人 HER2 的 scFv、一个 CD8 铰链和跨膜结构域以及一个由 4-1BB 的共刺激结构域、一个 CD3ξ 信号结构域、一个 IRES 和一个 EGFP 组成的细胞内部分组成。HER2-BBz-ODD 与 HER2-BBz 的不同之处在于 ODD 结构域与 CD3ξ 信号结构域的 C 端融合，通过在常氧条件下促进其泛素依赖性降解来实现其缺氧依赖性表达。（B，C）评估 HER2-BBz-ODD CAR 的氧依赖性表达。（B） 使用流式细胞术在 1% 或 21% O2 下培养 24、48 或 72 小时后，对人 PBMC 来源的 CAR-T 细胞进行了一项评估。（C） 另一项评估是使用 CAR 转导的 Jurkat T 细胞，在 21% O2、50 或 200 μM CoCl2 或 1% O2 下培养 24 小时后收获细胞裂解物，并使用蛋白质印迹分析 CAR 表达，包括 HER2-BBz CAR 转导的细胞作为对照。（D，E）不同氧条件下 CAR-T 细胞的 体外 细胞毒性和细胞因子分泌。（D） CAR-T 细胞与表达萤火虫荧光素酶的 SKOV3 细胞共培养，指定 E:T 比率低于 1% 或 21% O2。共培养 24 小时后，通过测量细胞相关萤火虫荧光素酶活性相对于未转导 T 细胞的变化来确定靶细胞杀伤效率。（E） 收集上清液用于检测分泌的 IL-2 和 IFN-γ。结果显示为 SEM ±平均值（n = 3 个健康供体）（****p < 0.0001）。缩写: scFv = single-chain fragment variable;CAR = 嵌合抗原受体。图 C 和 D 改编自 Liao 等人31。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有需要声明的利益冲突。