本文介绍了一种改良的炎症性疼痛模型，通过向双后爪注射角叉菜胶来评估镇痛效果。
本文内容
摘要
摘要
热板实验被广泛用于评估小鼠炎症性疼痛的镇痛效果。通常采用在单侧后肢足底注射角叉菜胶来建立炎症性疼痛模型。然而，我们实验室的研究发现，单侧后肢注射角叉菜胶的小鼠在进行热板实验时会抬起后肢以避免热刺激引起的伤害性感觉。由于这一行为反应， 此前的注射方法无法准确反映热痛阈值。因此，我们探索了一种新的方法以解决这一问题。在本研究中，我们对原有方法进行了改进，通过将角叉菜胶同时注射至双侧后肢足底来建立炎症性疼痛模型。结果表明，与单侧后肢注射相比，双侧后肢注射角叉菜胶在热板实验中对诱导炎症性疼痛更为敏感且效果更佳。基于这些发现，我们进一步设计实验，分别对双侧或单侧后肢注射角叉菜胶的小鼠给予口服塞来昔布（30 mg/kg）。热板实验结果显示，塞来昔布可提高双侧后肢注射角叉菜胶小鼠的热痛阈值，但对单侧注射小鼠无此作用。综上所述，我们建立了一种更优的炎症性疼痛模型诱导方法，可用于评估镇痛药物的效果。
引言
疼痛是全球范围内的一个公共卫生问题。它由有害的热、机械或化学刺激引发。由于伦理方面的顾虑，很难在人类身上开展疼痛研究。因此，使用动物疼痛模型是理解疼痛机制和研发治疗方法的关键途径1。热板试验已被广泛用于评估热伤害感受和痛觉过敏2。目前，热板试验中常用的炎症性疼痛模型是通过向一只后肢足底皮下注射角叉菜胶来建立的。例如，为研究载有罗替戈汀的微球的抗伤害感受作用，研究人员通过单侧后肢足底注射建立动物炎症性疼痛模型3。为评估儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂对小鼠热伤害感受的影响，研究人员将角叉菜胶注射至右侧后肢足底区域4。为探究大洋海神草（Posidonia oceanica (L.) Delile）提取物的镇痛作用，研究人员通过向小鼠右侧后肢足底注射角叉菜胶建立炎症性疼痛模型5。然而，我们实验室的研究发现，单侧后肢注射角叉菜胶的小鼠在热板试验中会抬起其受累足爪以避免热刺激，从而不准确地延长了动物对热刺激的反应时间。因此，我们推测，采用单侧后肢注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型无法准确反映热痛阈值。为此，我们优化了该方法，通过将角叉菜胶注射至双侧后肢足底，建立了一种改良的炎症性疼痛模型。
接受双后爪注射角叉菜胶的小鼠无法同时避免双侧后爪的热刺激。疼痛阈值定义为将小鼠放置于热板上至其舔舐任一后爪所需的时间。结果证实，改良后的炎症性疼痛模型更适用于评估伤害性温度阈值。这可能提高热板实验在镇痛药物研发中的有效性。
方案
实验方案已获烟台大学机构动物护理与使用委员会批准（编号：YTDX20220425）。实验操作遵循美国国立卫生研究院《实验动物使用指南》。
1. 动物
- 实验使用体重为 20–25 g 的 ICR 雌性小鼠。
- 实验开始前，让动物在实验室内环境适应 3 天。
- 实验室内保持 12 小时光照-黑暗循环，并为小鼠提供自由饮水和饲料。
2. 卡拉胶溶液的制备
- 称取0.1 g卡拉胶，向试管中加入10 mL无菌生理盐水。
- 将0.1 g卡拉胶加入试管中，涡旋振荡30 s。
- 收集1%无菌卡拉胶溶液。
- 在实验前配制卡拉胶溶液。
3. 足底注射角叉菜胶
- 使用注射器（0.05 mL，29G × ½ 英寸，0.33 mm × 12.7 mm）注射1% 卡拉胶溶液。
- 抽取卡拉胶溶液前应充分振荡混匀，确保注射器内无气泡。
- 用75%酒精对注射部位（后肢足掌）进行消毒。
- 将30 µL6,7的1%卡拉胶溶液皮下注射至后肢足底部位。对照组小鼠注射30 µL生理盐水。
- 将针头斜向上刺入后肢足垫组织。保持注射器稳定。
- 注射完成后缓慢拔出注射器，并按压注射部位2秒，以防药液渗漏。
4. 热板实验
- 在足底注射后3小时进行热板实验。
- 清洁并消毒热板表面。
- 启动热板仪器。点击 Temperature Mode 按钮，然后点击 CONSTANT ，将温度设定为 55 ± 0.2 °C。
- 点击 Start experiment 按钮，再点击 REACH。从饲养容器中取出一只小鼠，轻轻抓住其躯干，将小鼠置于热板中心，然后点击 START。
- 观察并记录小鼠对热刺激产生反应时舔舐左后爪（单后爪注射小鼠）或后爪（双后爪注射小鼠）所需的时间。踩下热板脚踏开关，在热板屏幕上读取时间。将疼痛阈值定义为从小鼠放置于热板至舔舐后爪的时间间隔。
- 热板实验设定60秒的时间上限4,8,9。若达到该时限，则记录疼痛阈值为60秒。
注意：在放入下一只小鼠前，需使用75%酒精清洁热板装置，以避免前一只小鼠残留气味可能带来的干扰。
5. 制备 1.5 mg/mL 的塞来昔布混悬液
- 取一粒含有 200 mg 塞来昔布的胶囊，倒出内容物并研磨成粉末。
- 加入 0.5% 羧甲基纤维素钠，定容至 13.3 mL，即为塞来昔布的储备混悬液。
- 取 1 mL 塞来昔布储备混悬液，加入 9.0 mL 0.5% 羧甲基纤维素钠，得到浓度为 1.5 mg/mL 的塞来昔布混悬液。
- 以 0.2 mL/10 g 的剂量将塞来昔布混悬液经口胃内灌注给予小鼠。
注：对于体重为 20–25 g 的小鼠，应选用长度为 4.0–4.5 cm 的灌胃针。
6. 评估改良的炎症性疼痛模型
- 将ICR雌性小鼠随机分为三组：对照组、模型组和塞来昔布组。
- 在后肢足底皮下注射30 µL 1%角叉菜胶溶液（单后肢或双后肢）。对照组小鼠注射30 µL生理盐水。
- 注射角叉菜胶或生理盐水后立即进行给药处理。塞来昔布组小鼠以30 mg/kg剂量经口灌胃给予塞来昔布；对照组和模型组小鼠经口灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液。
- 在注射角叉菜胶后3 h进行热板实验（第2节）。
7. 统计学方法
- 以均值 ± 标准差形式呈现实验结果。使用 Kolmogorov-Smirnov 统计适配性检验进行正态性分布检验。
- 采用非配对 t 检验分析两组之间的比较。对于多组比较，采用单因素方差分析，随后进行 Dunnett 检验。认为 p < 0.05 具有统计学显著性。
结果
炎症性疼痛模型中的痛阈
采用单侧后肢足底注射卡拉胶建立的炎症性疼痛模型，其痛阈为 32.23 ± 11.11 s，而对照组的痛阈为 27.73 ± 7.08 s。与对照组相比，单侧后肢注射模型的痛阈未显示显著降低（p > 0.05，图 1A）。采用双侧后肢足底注射卡拉胶建立的炎症性疼痛模型，其痛阈为 21.84 ± 5.63 s，而对照组的痛阈为 28.21 ± 8.61 s。与对照组相比，双侧后肢注射模型的痛阈显著降低（p < 0.05，图 1B）。
塞来昔布在不同炎症性疼痛模型中的镇痛作用
在采用单侧后肢足爪注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型中，塞来昔布组的痛阈（27.01 ± 10.98 s）与模型组（29.77 ± 13.97 s，p > 0.05）相比未见显著升高。与上述结果一致，模型组与对照组（30.94 ± 14.54 s）相比，痛阈亦无显著降低，表明单侧后肢足爪注射角叉菜胶未能成功诱导炎症性疼痛模型（图2A）。在采用双侧后肢足爪注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型中，模型组的痛阈（15.61 ± 4.85 s）较对照组（23.55 ± 3.96 s）显著降低（p < 0.05）。与模型组相比，塞来昔布组的痛阈（20.29 ± 3.10 s）显著升高（图2B）。
图1：炎症性疼痛模型中的痛觉阈值。（均值 ± 标准差，n = 15）。（A）采用单侧后肢足底注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型的痛觉阈值。（B）采用双侧后肢足底注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型的痛觉阈值（#P＜0.05）。请点击此处查看该图的高清版本。
图 2：塞来昔布在不同炎症性疼痛模型中的镇痛作用（均值 ± 标准差，n = 14）。(A) 塞来昔布在采用单侧后肢足垫注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型中的镇痛作用。(B) 塞来昔布在采用双侧后肢足垫注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型中的镇痛作用（#P＜0.05，*P＜0.05）。请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
疼痛是由组织损伤或伤害引发的一种保护性反应。然而，它也会对生活质量产生负面影响10。因此，有效镇痛药物的开发以及疼痛机制的探索仍是当前研究的热点领域。疼痛评估方法在镇痛药物的研发过程中起着关键作用。单侧后肢足底注射角叉菜胶是热板试验中的一种经典方法。本文所介绍的通过双侧后肢足底注射角叉菜胶建立的改良模型，为研究潜在治疗药物缓解疼痛的疗效提供了可靠的方法。
在本研究中，我们发现单后肢足底注射卡拉胶的小鼠并未出现痛阈降低。然而，在其他研究中，该方法在热板试验中导致了痛阈的显著下降11,12。既往研究与本研究结果之间的差异，可能归因于实验中使用了不同的动物种类13,14,15,16。另一种可能的解释是，我们观察到单后肢足底注射卡拉胶的小鼠经常抬起注射侧足或轻踏热板，以避免热刺激。而痛阈的评估需观察小鼠对注射侧足的典型伤害性反应，如舔舐或抖动足部。因此，我们得到了阴性结果，表明单后肢足底注射卡拉胶模型的痛阈并未显著降低。双后肢足底注射卡拉胶的小鼠则无法通过抬起足部或轻踏热板来规避热刺激。此时，痛阈的判断标准为任一后肢出现舔舐或抖动反应，更能真实反映小鼠的伤害性感受反应。
为了验证改良后炎症性疼痛模型的优越性，分别对单侧后肢足底或双侧后肢足底注射卡拉胶的小鼠给予口服塞来昔布治疗。与本研究的假设一致，塞来昔布在改良的炎症性疼痛模型中表现出镇痛作用，但在单侧后肢足底注射卡拉胶的模型中则未显示出任何效果。该结果表明，改良的炎症性疼痛模型可用于潜在镇痛药物的可靠筛选。
本研究存在一些局限性。在热板试验中已使用了多种不同的小鼠品系。不同小鼠品系对热刺激的反应可能存在差异。本实验仅采用ICR小鼠来验证假设。因此，该改良方法是否能够准确且一致地检测其他小鼠品系在热板试验中的痛阈，仍有待进一步确定。此外，我们未设计预实验来评估小鼠的痛阈，因而未排除痛阈较高的个体。然而，这一局限性也可能被视为本改良方法的一项优势：它不仅简化了镇痛试验的操作流程，而且更真实地反映了小鼠在热板试验中的反应范围。另外，后肢足爪体积的测量有助于确认炎症的诱导效果，并验证非甾体抗炎药（NSAIDs）的镇痛作用。但根据我们的经验，小鼠足爪体积的测量并不容易。由于小鼠足爪过小，难以获得精确的测量值。因此，本研究未设计针对炎症后足爪体积变化的考察。
综上所述，通过上述步骤建立的双后足注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型，能够可靠地测定小鼠的热伤害感受阈值。此外，在给予镇痛药物后，疼痛阈值的升高具有统计学意义。该改良的炎症性疼痛模型适用于潜在镇痛药物的筛选。同时，该方法还可用于疼痛生物学研究、新药开发及临床治疗，为疼痛管理提供新的思路和解决方案。
披露
作者无任何潜在的利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Liwen Bianji（Edanz）（www.liwenbianji.cn）的 Lesley McCollum 博士对本稿件初稿的英文文本进行编辑。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AL204 电子天平 | 余恒电池有限公司 | YH-400A | |
| 羧甲基纤维素 | 天津化学有限公司 | 20210326 | |
| 卡拉胶 | Sigma，密苏里州，美国 | 29H0715 | |
| 塞来昔布 | 辉瑞公司 | 8142838 | |
| 热板仪 | UGO 公司，意大利 | PB-200 | |
| ICR 雌性小鼠 | 济南朋悦有限公司 | SCXK20220007 | |
| 生理盐水 | 科伦药业有限公司 | H51021157 |
参考文献
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Front Mol Neurosci. 10, 284(2017).
- Menéndez, L., Lastra, A., Hidalgo, A., Baamonde, A. Unilateral hot plate test: a simple and sensitive method for detecting central and peripheral hyperalgesia in mice. J Neurosci Methods. 113 (1), 91-97 (2002).
- Li, T., et al. Rotigotine-loaded microspheres exerts the antinociceptive effect via central dopaminergic system. Eur J Pharmacol. 910, 174443(2021).
- Kambur, O., et al. Inhibitors of catechol- O -methyltransferase sensitize mice to pain. Br J Pharmacol. 161 (7), 1553-1565 (2010).
- Micheli, L., et al. Efficacy of Posidonia oceanica extract against inflammatory pain: In vivo studies in mice. Mar Drugs. 19 (2), 48(2021).
- McCarson, K. E. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Curr Protoc Pharmacol. 70, 5.4.1-5.4.9 (2015).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of Inflammation: Carrageenan- or Complete Freund's Adjuvant (CFA)-Induced Edema and Hypersensitivity in the Rat. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5 (Unit 5.4), (2012).
- Asl, M. K., Nazariborun, A., Hosseini, M. Analgesic effect of the aqueous and ethanolic extracts of clove. Avicenna J Phytomed. 3 (2), 186-912 (2013).
- Wang, Y. Analgesic effects of glycoproteins from Panax ginseng root in mice. J Ethnopharmacol. 148 (3), 946-950 (2013).
- Zia, F. Z., et al. Are psychedelic medicines the reset for chronic pain? Preliminary findings and research needs. Neuropharmacology. 233, 109528(2023).
- Sałat, K., Furgała, A., Sałat, R. Evaluation of cebranopadol, a dually acting nociceptin/orphanin FQ and opioid receptor agonist in mouse models of acute, tonic, and chemotherapy-induced neuropathic pain. Inflammopharmacology. 26 (2), 361-374 (2018).
- Wang, J., et al. Anti-inflammatory and analgesic actions of bufotenine through inhibiting lipid metabolism pathway. Biomed Pharmacother. 140, 111749(2021).
- Gong, L., et al. Antinociceptive and anti-inflammatory potentials of Akebia saponin D. Eur J Pharmacol. 845, 85-90 (2019).
- Deng, J., et al. Comparison of analgesic activities of aconitine in different mice pain models. PloS One. 16 (4), e0249276(2021).
- Penn, N. W. Potentiation of morphine analgesic action in mice by beta-carotene. Eur J Pharmacol. 284 (1-2), 191-193 (1995).
- Akkol, E. K., Güvenç, A., Yesilada, E. A comparative study on the antinociceptive and anti-inflammatory activities of five Juniperus taxa. J Ethnopharmacol. 125 (2), 330-336 (2009).
重印与许可
标签
