研究小鼠镇痛作用的改良炎症性疼痛模型

摘要

在这里，我们提出了一种使用双后爪角叉菜胶注射的改良炎症性疼痛模型，以评估镇痛效果。

摘要

热板试验广泛用于评估镇痛对小鼠炎症性疼痛的影响。一种常用的炎症性疼痛模型是通过在一个后爪中足底内注射角叉菜胶来诱导的。然而，我们实验室的结果表明，在热板测试期间，单后爪注射角叉菜胶的小鼠会抬起爪子以避免热伤害感受。由于这种反应，以前的注射方法无法准确反映热痛阈值。因此，我们研究了一种避免此问题的新方法。在本研究中，我们修改了之前的方法，将角叉菜胶注射到双侧后爪中，以建立炎症性疼痛的模型。结果表明，使用热板试验时，双后爪注射卡拉胶是敏感的，并且是比单只后爪注射更好的诱发炎症性疼痛的方法。基于这些发现，我们设计了进一步的实验，其中双后爪或单后爪注射角叉菜胶的小鼠用塞来昔布 （30 mg/kg） 胃内治疗。热板试验的结果显示，塞来昔布在双后爪注射角叉菜胶的小鼠中增加了热痛阈值，但在单后爪注射角叉菜胶的小鼠中没有增加。总之，我们开发了一种优越的方法来诱导炎症性疼痛模型来评估镇痛效果。

引言

疼痛是世界范围内的一个公共卫生问题。它是由有害的热、机械或化学刺激触发的。由于伦理问题，很难对人类进行疼痛研究。因此，使用动物疼痛模型是了解疼痛机制和研究治疗方法的关键方法¹。热板试验已广泛用于评估热伤害感受和痛觉过敏²。目前，用于热板测试的炎症性疼痛模型是通过在一个后爪中足底内注射角叉菜胶来诱导的。例如，为了研究负载罗替高汀的微球的抗伤害作用，通过单后爪注射制备了炎症性疼痛的动物模型³。为了评估儿茶酚-o-甲基转移酶抑制剂对小鼠热伤害感受的影响，将角叉菜胶注射到右后爪的足底区域⁴。为了研究 Posidonia oceanica （L.） Delile 提取物的镇痛作用，通过在右后爪足底内注射角叉菜胶在小鼠中制备了炎症性疼痛模型⁵。然而，我们实验室的结果表明，单后爪注射角叉菜胶的小鼠会抬起爪子以避免热伤害感受，这在热板测试中不准确地延长了动物对热刺激的反应。因此，我们假设单后爪注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型不能准确反映热痛阈值。因此，我们通过将角叉菜胶注射到双侧后爪中来优化该方法，以建立改良的炎症性疼痛模型。

双后爪注射角叉菜胶的小鼠无法同时避免双侧后爪的热刺激。疼痛阈值定义为从将鼠标放在热板上到鼠标舔任一后爪的时间。结果证实，改良的炎症性疼痛模型更适合评估伤害性温度阈值。这可能会提高热板试验对镇痛药研发的疗效。

方案

该实验方案得到了烟台大学机构动物护理和使用委员会的批准（No.YTDX20220425）。这些程序遵循美国国立卫生研究院 （National Institutes of Health） 的实验动物使用指南。

1. 动物

1. 使用体重为 20-25 g 的 ICR 雌性小鼠进行实验。
2. 在开始实验之前，让动物适应实验室的环境 3 天。
3. 以 12 小时的光暗循环维护实验室，并为小鼠提供免费的水和食物。

2. 角叉菜胶溶液的制备

1. 称取 0.1 克角叉菜胶。向试管中加入 10 mL 消毒的生理盐水。
2. 向试管中加入 0.1 g 角叉菜胶，并将试管涡旋 30 秒。
3. 收集 1% 灭菌的卡拉胶溶液。
4. 实验前准备角叉菜胶溶液。

3. 角叉菜胶的足底内注射

1. 使用注射器（0.05 mL、29G x 1/2 英寸、0.33 mm × 12.7 mm）注射 1% 角叉菜胶溶液。
2. 摇晃角叉菜胶溶液，然后将其吸入注射器中。确保注射器中没有气泡。
3. 用 75% 的酒精对注射部位（后爪）进行消毒。
4. 将 30 μL ^6,7 的 1% 角叉菜胶溶液皮下注射到后爪的足底表面。对于对照组小鼠，注射 30 μL 生理盐水。
   1. 将针头对对角向上插入后爪脚垫。保持注射器的稳定性。
   2. 注射后，缓慢拔出注射器并按压注射部位 2 秒，以防止泄漏。

4. 热板测试

1. 足底内注射后 3 小时进行热板试验。
2. 对热板表面进行清洁和消毒。
3. 启动热板装置。单击 Temperature Mode 按钮。单击 CONSTANT（常数 ）将温度设置为 55 ± 0.2 °C。
4. 单击 Start experiment 按钮，然后单击 REACH。从住宿集装箱中取出一只老鼠。轻轻抓住它的树干。将鼠标放在热板的中央。单击 START。
5. 观察并记录响应热刺激而舔左后爪（对于单后爪注射的小鼠）或后爪（对于双后爪注射的小鼠）的时间。踩下热板的踏板，查看热板屏幕上的时间。将疼痛阈值定义为从将鼠标放在热板上到舔后爪的时间。
6. 为热板测试 ^4,8,9 设置 60 秒的限制。如果达到限制，请记录 60 秒的疼痛阈值。
   注意:在放置下一只鼠标之前，请用 75% 酒精清洁热板装置，以避免由于前一只鼠标的残留气味而可能产生的偏差。

5. 1.5 mg/mL 塞来昔布混悬液的制备

1. 服用 1 粒含有 200 毫克塞来昔布的胶囊。获取胶囊内容物并将其研磨成粉末。
2. 添加 0.5% 羧甲基纤维素钠。最终体积为 13.3 mL。这是塞来昔布的停店情况。
3. 取 1 mL 储存悬浮液塞来昔布。加入 9.0 mL 的 0.5% 羧甲基纤维素钠，得到 1.5 mg/mL 的塞来昔布悬浮液。
4. 向小鼠灌胃内施用 0.2 mL/10 g 塞来昔布混悬液。
   注:对于体重为 4.0-4.5 g 的小鼠，请选择长度为 20-25 cm 的管饲针。

6. 评估改良的炎症性疼痛模型

1. 将 ICR 雌性小鼠随机分为三组:对照组、模型组和塞来昔布组。
2. 将 30 μL 的 1% 角叉菜胶溶液皮下注射到后爪的足底表面（单个后爪或两个后爪）的足底表面。对于对照组小鼠，注射 30 μL 生理盐水。
3. 注射角叉菜胶或生理盐水后，立即进行治疗。对塞来昔布组的小鼠以 30 mg/kg 的剂量灌胃施用塞来昔布。对于对照组和模型组的小鼠，胃内施用 0.5% 羧甲基纤维素钠。
4. 在注射角叉菜胶后 3 小时进行热板试验（第 2 部分）。

7. 统计方法

1. 将实验结果表示为平均值±标准差。使用 Kolmogorov-Smirnov 统计拟合优度检验进行正态分布检验。
2. 使用未配对的 t 检验分析两组之间的比较。使用单因子方差分析，然后进行 Dunnett 检验执行多组比较。考虑 p 的值< 0.05 具有统计意义。

结果

炎症性疼痛模型中的疼痛阈值
单后爪注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型的疼痛阈值为 32.23 ± 11.11 s，而对照组的疼痛阈值为 27.73 ± 7.08 s。与对照组相比，单后爪注射模型的疼痛阈值没有显示出显着降低 （p > 0.05， 图 1A）。双后爪注射卡拉胶的炎症性疼痛模型的疼痛阈值为 21.84 ± 5.63 s，而对照组的疼痛阈值为 28.21 ± 8.61 s。与对照组相比，双后鹌注射模型的疼痛阈值显着降低 （p < 0.05， 图 1B）。

塞来昔布在不同炎症性疼痛模型中的镇痛作用
在单后爪注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型中，塞来昔布组的疼痛阈值 （27.01 ± 10.98 s） 与模型组 （29.77 ± 13.97 s， p > 0.05） 相比没有显示出显着增加。与上述结果一致，与对照组相比，模型组的疼痛阈值没有显示出显着降低 （30.94 ± 14.54 s），这表明单后爪注射卡拉胶不会诱导炎症性疼痛模型（图 2A）。在双后爪注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型中，模型组的疼痛阈值 （15.61 ± 4.85 s） 与对照组 （23.55 ± 3.96 s，p < 0.05） 相比显著降低。与模型组相比，塞来昔布组的疼痛阈值 （20.29 ± 3.10 s） 显着降低 （图2B）。

图 1:炎症性疼痛模型中的疼痛阈值。 （平均值±标准差，n = 15）。（A） 单后爪注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型的疼痛阈值。（B） 双后爪注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型的疼痛阈值，（^#P<0.05）。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:塞来昔布在不同炎症性疼痛模型中的镇痛作用 （平均值±标准差，n = 14）。（A） 塞来昔布在单后爪注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型中的镇痛作用。（B） 塞来昔布在双后爪注射角叉菜胶炎症性疼痛模型中的镇痛作用，（^{#P<0.05，*P<0.05）。请单击此处查看此图的较大版本。}

讨论

疼痛是由组织损伤或损伤引发的保护性反应。然而，它也对生活质量有负面影响¹⁰。因此，有效镇痛药的开发和疼痛机制的探索仍然是活跃的研究领域。评估疼痛的方法在镇痛药的开发中起着关键作用。单后爪注射角叉菜胶是热板试验的经典方法。我们在这里介绍的由双后爪注射角叉菜胶诱导的改良模型提供了一种可靠的方法来研究潜在治疗剂缓解疼痛的疗效。

在本研究中，我们发现单后爪注射角叉菜胶的小鼠没有表现出疼痛阈值的降低。然而，在其他研究中，这种方法导致热板测试中疼痛阈值显着降低^11,12。先前研究与本研究之间结果的差异可能是由实验中使用的不同动物物种^{13、14、15、16} 来解释的。另一种可能的解释是，我们观察到单后爪注射角叉菜胶的小鼠经常抬起注射的爪子或轻轻踩在板上，以避免热刺激。评估疼痛阈值需要观察舔或摇晃注射爪子的典型伤害性反应。因此，我们得到了一个阴性结果，表明单后爪注射卡拉胶的模型的疼痛阈值没有显着降低。双后爪注射角叉菜胶的小鼠无法通过抬起爪子或轻轻踩踏板来避免热刺激。疼痛阈值被认为是舔或摇晃任一后爪，反映了小鼠的实际伤害性反应。

为了验证改良炎症性疼痛模型的优越性，单后爪或双后爪注射角叉菜胶的小鼠接受塞来昔布的胃内给药治疗。与本研究的假设一致，塞来昔布在改良的炎症性疼痛模型中发挥镇痛作用，但在单后爪注射角叉菜胶的模型中未显示任何效果。这一发现表明，改良的炎症性疼痛模型对于筛选潜在的镇痛药是可靠的。

这项研究存在局限性。许多不同的小鼠品系已被用于热板测试。不同的小鼠品系可能对热刺激表现出不同的反应。本实验仅使用 ICR 小鼠来检验该假设。因此，修改后的方法是否在热板测试中准确一致地检测其他小鼠品系的疼痛阈值仍有待确定。此外，我们没有设计一个试点实验来评估小鼠的疼痛阈值，因此没有排除任何具有高疼痛阈值的动物。然而，这一限制也可以被认为是当前修改方法的一个优点。它不仅简化了镇痛试验的过程，而且反映了小鼠在热板试验中的反应范围。此外，后爪体积的测量将有助于确认炎症的诱导并验证非甾体抗炎药 （NSAID） 的镇痛作用。然而，我们的经验表明，测量小鼠爪子的体积并不容易。鼠标的爪子太小，无法获得确切的值。因此，本研究并非旨在调查炎症后爪子体积的变化。

总之，按照上述步骤，双后爪注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型可以可靠地确定小鼠的热伤害感受阈值。此外，在给予镇痛药后，统计学上检测到疼痛阈值的增加。改良的炎症性疼痛模型可用于筛选潜在的镇痛药。此外，该方法可用于疼痛生物学研究、新药开发和临床治疗，以及为疼痛管理提供新的思路和解决方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AL204 电子天平	宇衡电池有限公司	YH-400A
羧甲基纤维素	天津化工有限公司
卡拉胶	Sigma， MO， USA	29H0715
塞来昔布	辉瑞公司
热板	意大利 UGO Ltd. Co. Co.， Italy	PB-200
ICR雌性小鼠	济南彭月有限公司
生理盐水	科伦药业有限公司