基于CRISPR的现场快速诊断技术及其预混冻干试剂

摘要

本文介绍了基于重组酶的等温扩增反应和基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）反应的预混、冻干试剂的逐步制备方法，可用于检测传染病病原体的核酸生物标志物或其他感兴趣的遗传标志物。

摘要

基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的分子诊断技术具有高诊断准确性，且具备适用于现场即时检测（point-of-care）的特点，例如结果周转时间短、读取方式简便直观，且无需复杂仪器。然而，由于该检测反应组分较多且需手动操作步骤繁杂，限制了其在即时检测场景中的便捷应用。本文提供了一种经过优化的、分步操作的实验方案，用于实现对疾病病原体和遗传标志物的稳定检测，该方案结合了基于重组酶的等温扩增技术和预混并冻干处理的CRISPR检测试剂，试剂以即用型、易储存的形式制备。预混并冻干的试剂可直接加水复溶后立即使用，并保持高效的扩增与检测性能。同时，我们还针对CRISPR诊断中预混冻干试剂在制备与使用过程中常见问题提供了故障排查指南，以提升该检测平台在更广泛的诊断与基因检测领域的可及性。

引言

基于CRISPR的核酸检测技术于2017年首次被报道^1,2,3,4，此后已被证实为新一代诊断方法，并在多个国家获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的检测应用，尤其用于严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA的检测^5,6,7,8。除2019冠状病毒病（COVID-19）外，该技术还被证明可有效检测多种病毒和细菌^{9,10,11,12,13}、遗传性疾病相关的突变与缺失，并可通过工程化设计用于检测蛋白质和小分子生物标志物^2,12。基于CRISPR的诊断技术通常将等温扩增方法——如重组酶聚合酶扩增（RPA）或环介导等温扩增（LAMP）^14,15——与基于CRISPR的检测相结合，后者利用RNA引导的CRISPR相关（Cas）酶在识别靶标后产生的“附带”核酸内切酶活性进行检测³。等温扩增与基于CRISPR的检测双重结合赋予了该技术多项理想特性，特别是诊断准确性接近金标准聚合酶链式反应（PCR），并具备多重检测能力以及识别微小序列差异（包括单核苷酸多态性）的能力^1,9。

然而，最精确的基于CRISPR的诊断方法包含多个组分和步骤，对于非专业人员或在即时检测（POC）条件下操作可能较为复杂。为解决将高精度CRISPR诊断技术推广至POC场景的难题，我们开发了预混、冻干、基于重组酶的等温扩增与基于CRISPR的检测反应体系的制备方案，这些方案易于使用和储存⁷。这些方案可作为现有优秀CRISPR诊断方案的补充¹⁴，后者包含了CRISPR诊断所需生化组分的制备方法⁷、设计指南¹，以及采用其他等温扩增技术^2,14,15,16和不同Cas酶¹²的配方。最终，我们希望基于CRISPR的诊断技术能够在需要便携式且无需仪器分析的场景中，实现快速、低成本且高灵敏度的核酸检测^1,9,17。

在我们的实验方案中，主要采用RPA与基于Cas13的检测相结合的方法。RPA在接近环境温度（37–42 °C）下进行，因此对能量和设备的要求较低。其他等温扩增反应则需要更高的温度（LAMP：60–65 °C；链置换扩增（SDA）：60 °C；指数扩增反应（EXPAR）：55 °C；解旋酶依赖性扩增（HDA）：65 °C）²。与LAMP引物相比，RPA引物的设计并不复杂，并且可扩展用于多重扩增^7,9,14。尽管在实际操作中实现两个以上目标的RPA多重扩增较为困难，但已有明确的指导原则，可用于设计多重RPA引物以最大程度减少相互干扰¹⁸。

尽管在两步法工作流程中残留污染仍然是一个严重问题，但RPA扩增产物片段较小，与LAMP产生的大片段串联重复扩增子相比，引发残留污染的可能性较低¹⁴。RPA引物的设计可遵循标准指南¹⁴：通常长度为25-35个核苷酸，熔解温度在54至67 °C之间，扩增子大小应小于200个碱基对。可在RPA反应中加入逆转录酶（RT），从而实现对RNA模板的扩增；在逆转录-RPA（RT-RPA）中，通常还需少量添加核糖核酸酶H（RNase H），以帮助解离形成的RNA:DNA杂合链，促进扩增反应的进行^5,19。为了实现基于Cas13检测的T7转录，可将T7 RNA聚合酶启动子序列置于正向RPA引物的5'端。

在通过RPA扩增出扩增子后，可利用crRNA编程的Cas酶进行检测。在可用于扩增子检测的多种Cas酶中，我们倾向于使用靶向RNA的Cas13变体，因其具有较高的切割活性¹以及已被充分表征的多核苷酸切割偏好性^7,9，后者可用于实现多重检测。Cas13的crRNA序列应设计为与扩增产物RNA中的靶位点互补（反向互补），并包含间隔序列和直接重复序列（DR）。crRNA序列与RPA引物不应重叠，以避免Cas酶对非靶标扩增产物产生非预期的检测信号，从而降低背景信号和假阳性结果¹⁴。

基于Cas的检测依赖于不同的检测方式来监测报告核酸分子的切割（基于Cas13的反应使用RNA报告分子）^1,2,14。不同的检测方式包括比色法、电化学读数、荧光、测序读数以及侧向流动试纸条²。我们重点关注荧光读数，因其可使用多种荧光染料和报告分子，如氰基5（Cy5）、罗丹明X（ROX）和羧基荧光素（FAM），这些染料可通过单一蓝色LED光源有效激发，并利用酶标仪或实时荧光定量PCR仪分析其荧光信号^7,14。此外，荧光读数系统搭建简便，且支持连续监测，从而实现实时定量分析。多重RPA预扩增与基于Cas酶的多重Cas13检测可结合多色荧光读数，用于同时检测多个遗传靶标^2,7。

在本实验方案中，我们首先通过将RNA样本加入冻干形式的RT-RPA试剂中，进行等温扩增（图1）。在RT-RPA过程中，所生成的双链DNA扩增子会带上T7启动子。随后，将RPA产物转移至含有T7 RNA聚合酶的冻干Cas13检测体系中。该检测反应利用T7 RNA聚合酶将DNA扩增子转录为RNA，进而可被crRNA编程的Cas13高效检测。当Cas13被靶标激活后，会切割报告分子，产生可检测的荧光信号^2,7,14。尽管本方案以Leptotrichia wadei（LwaCas13a）为基础进行检测，但也可拓展为利用正交的Cas13与Cas12酶实现最多四种靶标的同步多重检测^7,9。此外，RPA扩增与基于Cas的检测反应亦可合并于单管中进行，但灵敏度会有所降低¹⁴。

图1：基于CRISPR的检测流程。该流程展示了两个目标基因的检测过程。首先，利用RPA对DNA目标中的感兴趣区域进行等温扩增；当检测RNA目标时，该反应可通过逆转录（RT-RPA）进行。随后，T7转录将双链DNA扩增子转化为RNA，这些RNA可被Cas13-crRNA复合物识别，且在结合目标序列后可激活附带的RNase活性。淬灭型荧光报告分子的切割会产生荧光信号，可通过酶标仪监测、LED透射仪观察，或使用实时荧光定量PCR仪检测。缩写：CRISPR = 成簇规律间隔短回文重复序列；RT = 逆转录；RPA = 重组酶聚合酶扩增；Cas = CRISPR相关蛋白；LED = 发光二极管。 请点击此处查看此图的放大版本。

本文所介绍方案的关键特征在于冻干用预混制剂。预混可简化反应使用过程并提高可重复性，但RPA和基于Cas的检测体系中的许多组分——特别是逆转录组分以及某些不稳定的辅因子（如ATP）——在溶液中并不稳定。因此，我们设计的预混溶液可进行冷冻干燥，以便长期保存、便于运输和现场部署^1,9,20。预混并冻干的试剂还有助于提高检测灵敏度，因为在复溶反应时可加入更大体积的样本（从而实现更高的DNA/RNA投入量）¹⁰。在我们的制剂中，主要使用海藻糖²¹作为冻干RPA和基于Cas的检测反应中的冷冻保护剂⁷。除保护试剂外，海藻糖还可通过增强酶的稳定性^16,22,23,24以及降低双链DNA的熔解温度²³来促进反应进行。除海藻糖外，对其他稳定剂^5,7,21,25,26的探索可能为不同应用场景开发出更优的制剂方案。

方案

1. 冻干RT-RPA预混试剂的制备

1. 设备准备
   1. 准备一个液氮杜瓦瓶或托盘，用于反应体系的速冻。向杜瓦瓶或托盘中加入液氮。
   2. 冷冻干燥机
      1. 检查排水管和腔体内部是否有冷凝水；如有需要，请清除水分。
      2. 使用RNase去污染溶液清洁腔体内部及1.5 mL微量离心管金属架，随后用70%乙醇擦拭。
      3. 关闭腔体门和真空释放阀。
      4. 开启冷冻干燥机。
      5. 手动将搁板温度设置为-30 °C。
   3. 分子生物学设备
      1. 使用RNase去污染溶液清洁以下物品：移液器、移液器吸头架、涡旋混合器、小型离心机和永久性记号笔。
      2. 使用自来水清洁以下物品，然后用擦拭纸擦干：微量离心管塑料架和用于盛放冰的泡沫盒。
      3. 准备一个加热块（用于溶解/再溶解三甘氨酸溶液），先用RNase去污染溶液和70%乙醇清洁，然后打开并设定温度为60 °C。
2. 预混RPA反应体系的制备
   注意：此配方适用于10个反应（使用三个RPA冻干颗粒）。
   1. 使用前检查三甘氨酸溶液中是否存在沉淀。若存在沉淀，请在60 °C孵育并充分混匀以溶解沉淀。在加入其他热敏感试剂前，需先将三甘氨酸溶液冷却。
      注意：若试管长时间置于室温下，容易形成沉淀。
   2. 从冰箱中取出三管RPA冻干颗粒条带；轻轻敲击条带管，使其紧贴实验台面，以使白色颗粒脱落。
   3. 将三个颗粒全部转移至一个1.5 mL微量离心管A中。
   4. 用25 µL无核酸酶水冲洗条带管中残留的RPA粉末，并将冲洗液转移至一个新的1.5 mL微量离心管B中。
   5. 向主混合液管B中加入10 µL的0.57 M三甘氨酸溶液和10 µL引物混合液（各10 µM）。
   6. 涡旋混匀管B，然后短暂离心并置于冰上。
   7. 向主混合液管B中加入28.4 µL的5x RPA缓冲液（由500 µL 50% (w/v) PEG20000、250 µL 1 M Tris pH 7.4和100 µL 100 mM二硫苏糖醇（DTT）配制而成），并通过多次剧烈轻敲或振荡充分混匀。
      注意：我们采用这种方式配制溶液，以便在加入所有成分溶解RPA颗粒之前，有助于稀释/降低主混合液管中PEG的黏度。
   8. 将步骤1.2.3中收集于管A的颗粒转移至主混合液管B中，然后反复倒置主混合液管以混匀。观察溶液是否呈现均一、单相状态（溶液会略显浑浊），随后将管子置于冰上。
      注意：若混匀不充分，PEG可能导致溶液/悬浮液发生相分离。
   9. 向主混合液管中加入0.71 µL的200 Unit/µL逆转录酶（RT）和2.84 µL的5 Unit/µL RNase H。轻柔地多次轻敲或上下倒置主混合液管。短暂离心后置于冰上。
      注意：由于RT和RNase H对剪切力敏感，因此我们在前期剧烈混匀步骤之后才加入这些酶；加入RT/RNase H后不再进行涡旋混匀。
   10. 将主混合液分装至10个预冷的1.5 mL离心管中，每管8.4 µL，并将这些管子置于冰上。操作时，将移液器吸头插入主混合液中，缓慢而稳定地吸取液体，以防止气泡产生并确保体积准确。将主混合液分配至预冷的1.5 mL离心管中。
       注意：根据经验，当分装8.4 µL后，主混合液管中通常会残留约1–2 µL悬浮液。实验人员可略微调低分装体积，以确保所有10个反应均有足够的试剂。处理黏稠溶液时应采用正确的移液技术。
   11. 完成分装后，将离心管放入浸没于液氮中的金属架中，准备进行冻干。让离心管在液氮中浸没5分钟。
       注意：由于冻干可去除多余液体，使我们能够加入更多的DNA/RNA样本，从而提高检测灵敏度。冻干后的预混RPA反应体系可在-20 °C保存8个月。若同一实验使用同一批次制备的RPA主混合液，冻干有助于提高实验重复性，因此制备较大批次也有益处。
3. 冻干
   1. 在冷冻干燥机上检查冷阱和搁板温度。如有必要，请等待至冷阱温度达到-75 ± 5 °C，搁板温度达到-30 ± 1 °C。
   2. 用一张擦拭纸覆盖金属架上的开口离心管，将金属架连同开口管一起放入冷冻干燥机的搁板上，并关闭搁板门。
   3. 选择表1所示程序并按下开始。在二次干燥步骤（20 °C，<0.1 mbar；通过将该步骤时间设为"无限"使温度无限维持）进行30分钟后，按下停止程序。
      注意：我们让离心管在冷冻干燥机内自然升温，以防止水分冷凝。
   4. 通过打开真空释放阀释放压力，然后从搁板上取出金属架。立即盖紧管盖，并将冻干反应物在-20 °C保存。
      注意：冻干的RPA和CRISPR-Cas13a预混反应体系可在-20 °C保存8个月。

2. 冻干CRISPR-Cas13a预混检测试剂的制备

注意：按照步骤 1.1 进行设备准备。

1. CRISPR-Cas13a 预混反应体系的制备（10 个反应）
   1. 从储存条件中取出以下物品并置于冰上：10 µL LwaCas13a（实验室自制^7,8,14）（2 mg/mL）、Cas 储存缓冲液、10 ng/µL（225 nM）crRNA、25 mM rNTP、50 单位/µL T7 RNA 聚合酶、2 µM FAM 荧光报告探针。
   2. 将 10 µL 浓度为 2 mg/mL 的 LwaCas13a 加入 148.8 µL Cas 储存缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4，0.6 M NaCl，5% 甘油，2 mM DTT）中，配制成终浓度为 126 µg/mL（900 nM）的 LwaCas13a 工作液。
   3. 按如下组分配制 CRISPR-Cas13a 主混合液：71 µL 无 RNase 水、20 µL 400 mM Tris pH 7.4、20 µL 60%（w/v）海藻糖、10 µL 10 ng/µL（225 nM）crRNA（此处靶向 SARS-CoV-2 的 s 和 n 基因）、8 µL 100 mM rNTP 混合液（每种 25 mM）、6 µL 50 单位/µL T7 RNA 聚合酶、25 µL 2 µM FAM 荧光报告探针，以及 10 µL 126 µg/mL（900 nM）LwaCas13a。通过反复倒置混匀主混合液管，随后离心收集。
   4. 将 17 µL 主混合液分装至 10 个置于冰上的 1.5 mL 离心管中。将离心管放入置于液氮中的试管架内，使离心管在液氮中浸没冷冻 5 分钟。
2. 冻干处理
   1. 在冷冻干燥机上检查冷凝器和搁板温度，待冷凝器温度降至 -75 ± 5 °C，搁板温度降至 -30 ± 1 °C 后开始操作。
   2. 将离心管放入冷冻干燥机中。选择 表 1 所示程序并点击 开始。在二次干燥阶段（25 °C，<0.1 mbar；通过将该步骤时间设为 "infinite" 使温度无限维持）进行 30 分钟后，点击 停止 程序。
   3. 打开真空释放阀释放压力，并将试管架从搁板上取出。立即盖紧管盖，并将冻干后的反应体系于 -20 °C 保存。
      注：冻干后的 RPA 和 CRISPR-Cas13a 预混试剂可在 -20 °C 下保存 8 个月。

3. RT-RPA 核酸扩增

注意：为防止交叉污染，应将工作区域和移液器分别用于扩增前、加样和扩增后操作。我们建议使用带滤芯的移液器吸头。

1. 将温控振荡孵育器预热至 42 °C。
2. 向含有冻干预混 RT-RPA 反应颗粒（来自第 1 部分）的离心管管壁加入 1 µL 醋酸镁（Mg(OAc)₂）和醋酸钾（KOAc）溶液混合液（含 196 mM Mg(OAc)₂ 和 1.5 M KOAc）。
   注意：添加 Mg(OAc)₂ 和 KOAc 混合液的小技巧：将液滴加至离心管约 1 mL 刻度线处。此处液滴清晰可见，且在关闭管盖或其他操作时不易丢失。通过短暂离心使液滴沉降至管底后，扩增反应即开始。若同时处理多个反应，可同时启动扩增。
3. 加入 12.4 µL RNA 样本（或对照样本）以重悬 RT-RPA 反应颗粒。
   注意：加样顺序应为阴性样本/阴性对照、待测 RNA/DNA、阳性样本/阳性对照。
4. 为启动 RT-RPA 反应，使用台式小型离心机在室温下短暂离心 3 秒，使步骤 3.2 和 3.3 中加入的溶液沉降至管底。
5. 轻轻敲击离心管以混匀，再进行一次短暂离心，持续 3 秒。
6. 将反应体系置于预热的加热模块或温控振荡孵育器中，在 42 °C 下孵育 60 分钟。
7. 反应结束后，取出反应管并立即置于冰上，随后进行 CRISPR-Cas 检测步骤（第 4 部分）。
   注意：RPA 扩增产物可立即用于检测反应，也可在 4 °C 下保存数天，或在 -20 °C 下保存数月。

4. CRISPR-Cas13 核酸检测

1. 开启荧光酶标仪，将加热温度设置并预热至 37 °C，并选择 表 2 中所示的程序。
2. 将一块 384 孔板置于冰上。
3. 向冻干的 CRISPR-Cas 预混检测反应液（来自第 2 节）中加入 17 µL 的 8 mM 氯化镁溶液，重悬反应液；通过轻轻敲击管壁混匀，然后短暂离心 3 秒，并将管子放回冰上。
4. 将 18 µL 重悬后的反应混合液转移至冰上预冷的 384 孔板的每个孔中。
5. 向每个反应孔中加入 2 µL 在第 3 节中制备的 RPA 产物。
6. 将孔板从冰上取出，迅速放入预热的荧光酶标仪中，并按下 开始 按钮。
   注意：将 384 孔板置于冰上，是为了在将其转移至预热的荧光酶标仪时，能够同步启动各孔的反应。

结果

我们重点展示了针对SARS-CoV-2的s基因和n基因联合检测时FAM荧光信号生成的动力学特征，并说明如何利用这些信息确定冻干预混反应体系的最佳条件。在所有实验中，我们均包含了C_t值明显低于检测限（LoD）的样本（C_t ~31–33），以及C_t值处于检测限的样本（C_t ~35–37）⁷，以便区分灵敏度更优的检测方案。

对于冻干预混的RT-RPA体系，我们发现预混反应中加入KOAc会对反应灵敏度产生不利影响（图2A）。因此，我们未在预混反应中加入KOAc，而是在加入RNA样本后，随反应引发剂Mg(OAc)₂一同添加。我们还采用类似方法确定了冷冻保护剂海藻糖的最佳浓度（图2B），以及三甘氨酸⁷在冻干RT-RPA反应中的作用（图2C）。因此，优化后的冻干预混RT-RPA反应体系包含6%海藻糖，不添加KOAc（但在加入RNA样本后补加），并补充三甘氨酸，具体操作如方案第1节所述。

图 2：优化冻干预混的RT-RPA反应。 使用靶向SAR-CoV-2的n基因的引物制备RT-RPA反应。所有预混反应中均未添加Mg(OAc)₂。评估了在预混反应中添加（A）KOAc、（B）海藻糖和（C）三甘氨酸的影响。通过检测FAM荧光信号的变化来监测反应进程，检测使用实时荧光定量PCR仪或荧光微孔板读数仪进行。数据以三次重复实验的独立结果展示。缩写：RT = 逆转录；RPA = 重组酶介导的聚合酶扩增；CRISPR = 成簇规律间隔短回文重复序列；Cas = CRISPR相关蛋白；SAR-CoV-2 = 严重急性呼吸综合征冠状病毒2；C_t = 循环阈值；FAM = 羧基荧光素。 请点击此处查看该图的高清版本。

对于冻干预混的 Cas13a 反应体系，我们验证了使用合适冷冻保护剂的重要性：6% 海藻糖或 2% 蔗糖¹⁹ 均可有效维持反应活性，而 1% 蔗糖或 5% w/v PEG20000 则无法在冻干后保持反应效率（图 3）。所有冻干反应中均省略 MgCl₂，在复水步骤中再行添加。最优的冻干 Cas13 检测反应体系如方案第 2 节所述，采用 6% 海藻糖配制。

图3优化冻干预混的Cas13检测反应 检测反应在37 °C下使用SARS-CoV-2的RPA产物进行 n 基因。在冻干前后进行了检测。MgCl₂ 被排除在所有预混反应之外。（A海藻糖，（B) PEG20000，以及（C) 蔗糖在冻干后保持反应效率方面的作用进行了评估。通过检测生成的FAM荧光，使用实时荧光定量PCR仪监测反应。图中显示了冻干后三次重复测量的单个数据点，以及冻干前一次重复测量的数据。 图3A，B 来自 Patchsung 等人。⁷缩写：RPA = 重组酶聚合酶扩增；SAR-CoV-2 = 严重急性呼吸综合征冠状病毒2；FAM = 羧基荧光素 请点击此处查看此图的放大版本。

用于RT-RPA和基于Cas13反应的冻干预混试剂在-20 °C下至少可稳定保存8个月[图4]。

图4：冻干预混RPA与CRISPR-Cas13a试剂在-20 °C下的稳定性测试。 稳定性测试时间点分别为（A）30天，（B）45天，（C）3个月，（D）5个月，（E）8个月。显示了三次重复测量的独立数据。请点击此处查看此图的放大版本。

冻干RT-RPA与基于Cas13的反应检测SARS-CoV-2的s和n基因的检测限如图5所示。与仅检测单一基因相比，双基因检测可改善信号生成的动力学。

图5：单基因与双基因检测的分析灵敏度。（A）针对SAR-CoV-2的s基因的冻干单重RT-RPA与Cas蛋白介导检测的检出限（LoD）。（B）针对SAR-CoV-2的n基因的冻干单重RT-RPA与Cas蛋白介导检测的检出限（LoD）。（C）针对s和n基因的冻干多重RT-RPA与双Cas蛋白介导检测的检出限（LoD）。检出限通过系列稀释的SARS-CoV-2 RNA确定，其C_t值由靶向n基因的RT-qPCR检测测定。图中显示了3–6次重复测量的独立数据。缩写：LoD = 检出限（limit of detection）；RT = 逆转录（reverse transcription）；RPA = 重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification）；CRISPR = 成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）；Cas = CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein）；SAR-CoV-2 = 严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2）；C_t = 循环阈值（cycle threshold）；qPCR = 定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction）。请点击此处查看该图的高清版本。

除了病毒检测外，我们还展示了一种基于CRISPR诊断技术的即时检测（POC）基因分型工具原型，用于帮助识别泰国特有的毒蛇物种（图6）。通过从咬伤伤口采集的DNA样本快速且准确地鉴定蛇种，有助于及时使用抗蛇毒血清，提高患者的生存几率。我们针对包括泰国眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）在内的八种蛇类线粒体细胞色素b（cytb）基因的特定区域进行检测（图6A），结果表明，对O. hannah cytb基因的合成DNA替代物的检测灵敏度可达阿摩尔（attomolar）水平（图6B、C）。

图 6：基于 CRISPR 的检测原型，用于从蛇咬伤中毒样本中鉴定蛇类物种。（A）用于检测Ophiophagus hannah的cytb基因的 RPA 引物和 LwaCas13a crRNA 设计。T7 启动子（T7 悬臂）位于正向 RPA 引物的 5' 端。（B）60 分钟内 FAM 信号生成的动力学曲线，以及（C）LwaCas13a 介导检测合成 dsDNA 输入物的终点 FAM 荧光信号，该输入物对应于O. hannah的cytb基因片段。使用了不同的输入浓度（0、10^-9、10^-12、10^-15 和 10^-18 M）。数据为三次重复测量的平均值 ± 标准差。缩写：RPA = 重组酶聚合酶扩增；CRISPR = 成簇规律间隔短回文重复序列；Cas = CRISPR 相关蛋白；FAM = 羧基荧光素。请点击此处查看该图的放大版本。

CRISPR-Cas13a 预混检测试剂的冻干
步骤	升温速率	板层温度	时间（小时:分钟）	真空度
	（°C/min）	（°C）		（mbar）
冷冻 1	3	-30	关闭	-
干燥 1	3	-30	关闭	0
干燥 2	3	4	01:00	0
干燥 3	3	20	∞	0

表1：预混RT-RPA和CRISPR-Cas13a检测试剂的冻干参数。 缩写：RT = 逆转录；RPA = 重组酶聚合酶扩增；CRISPR = 成簇规律间隔短回文重复序列；Cas = CRISPR相关蛋白。

参数		设定值
温度		37 °C
动力学循环	持续时间	02:00 (mm:ss)
	间隔时间	02:30 (mm:ss)
振荡	持续时间	1 秒
	模式	线性
	振幅	1 mm
荧光强度	激发波长	488 nm
	发射波长	520 nm
	模式	顶部
	Z 位置	24470
	增益	71
	积分时间	20 µs
	闪光次数	25

表2：用于核酸检测的荧光酶标仪程序。

讨论

本实验方案中存在若干关键步骤。在区域划分方面，建议将核酸提取、预混液配制（扩增前区域）、加样以及扩增产物检测（扩增后区域）分别在独立的空间进行。每个区域应配备独立的工具和设备。严禁将某一区域的工具带入另一区域，尤其是禁止将扩增后区域的工具带入扩增前区域。工作区域的清洁至关重要：应使用RNase/DNase去污染溶液或3%次氯酸钠溶液，随后用70%乙醇或经高压灭菌的去离子水清洁工作台面、移液器、涡旋振荡器以及永久性记号笔。需清洗基础实验耗材及仪器的可拆卸部件，例如1.5 mL离心管塑料架和微型离心机的转子适配器。无核酸酶水既用作阴性对照，也作为反应组分，因此是一种易受污染的敏感试剂，若操作不当可能导致污染。因此，我们建议将无核酸酶水分装为小份，每份仅使用一次。

始终使用检测引物运行阴性对照反应，以检查是否存在污染。此外，为避免污染问题，我们建议在扩增前区域而非样品添加室中，通过加入无核酸酶水来制备阴性对照反应。乙酸镁-乙酸钾混合液应分装为小体积（约 20 µL/管），每管仅使用一次，以避免试剂被残留扩增产物污染。向冻干的RPA预混液中添加乙酸镁-乙酸钾混合液时，建议每次更换移液器吸头。实验操作流程应保持单向进行，从扩增前到扩增后实验区域移动。工作区应从"较洁净"（扩增前）区域向"较易污染"（扩增后）区域推进。

为避免扩增子的残留污染，对本方法进行改进和故障排查时，我们建议在空间上将实验的三个主要步骤分开：RPA反应的准备、样品添加以及扩增和检测步骤。配制预混液应在无模板的实验室区域进行。更换实验场所时，应同时更换手套和实验服。实验操作应严格遵循从扩增前到扩增后的单向流程。避免在不同步骤中使用同一支移液器。最好为以下各步骤分别配备专用的移液器：预混液的配制、模板DNA/RNA的添加以及扩增产物的转移。使用带滤芯的吸头，尽量减少气溶胶的产生，并在打开管盖时避免接触管内壁。若扩增实验中出现污染，应更换所有试剂。如有可能，应前往另一实验室使用新配制的试剂，检查污染是否仍然存在。除试剂外，不要将任何其他物品（包括移液器）带入该区域。若移液器可耐受高压灭菌，请尝试对其进行高压灭菌处理。

为了提高扩增效率（检测优化），首先应参考生产商的说明书，例如 TwistDx 提供的 RPA 手册，以确保引物和探针的最优设计。其次，可尝试对反应进行经验性优化，例如添加已知可增强 RPA 和 CRISPR 反应的反应添加剂⁷；延长反应时间（例如将 RPA 反应时间延长至 60 分钟）；或调整引物序列及浓度。我们还建议尽可能增加样本加入体积；使用冻干试剂有助于加入更多样本体积。为降低背景荧光，可在 RPA 反应完成后、进入检测步骤前，进行热失活处理（75 °C 反应 5 分钟），或优化报告分子的浓度——报告分子过多会导致背景信号升高。此外，添加 RNase 抑制剂有助于防止报告分子发生 Cas 非依赖性降解。

除了优化（RT）-RPA 和基于 CRISPR 的反应条件及其操作流程外，还应确保所用试剂质量良好，并且在所有反应之前的核酸提取步骤成功完成。冻干试剂具有高检测灵敏度、便于携带，可用于现场检测（POC），并可应用于多种临床样本。此外，冻干（RT）-RPA 可通过直接加入临床样本的核酸提取物实现即时复溶。先前的研究表明，在无体积限制的情况下增加核酸加样量，可有效提高目标核酸的总量，从而获得更高的检测灵敏度。

基于CRISPR的诊断技术已被用于通过采集临床样本（如鼻咽拭子和咽喉拭子、尿液以及血清）来检测病原体^7,8,11。该技术还可用于区分单核苷酸变异、鉴定耐药微生物中的抗生素耐药基因，以及检测与癌症相关的突变。该技术的应用价值在野外现场检测中可能最为显著，因为等温扩增的工程化生化反应与基于CRISPR的检测方法可结合便携式设备使用，例如手持式荧光仪或侧向层析试纸条进行结果读取。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
甜菜碱溶液	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC处理水	Invitrogen	AM9915G
二硫苏糖醇（DTT）	Merck	3870-25GM
EpiScript逆转录酶	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	实验室自制		菌株名称：Leptotrichia wadei，缩写：Lwa，蛋白名称：LwaCas13a
氯化镁溶液，1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA聚合酶	Lucigen	30223-2
聚乙二醇	Sigma-Aldrich	81300-1KG
乙酸钾溶液，5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
核糖核苷酸溶液混合物	NEB	N0466L
核糖核酸酶H	NEB	M0297L
蔗糖	TCI	TCI-S0111-500G
海藻糖二水合物	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐溶液，1M，pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic试剂盒	TwistDx	TABAS03KIT
设备
BluPAD双LED蓝光/白光透射仪	Bio-Helix	BP001CU
双模块干浴器	ELITE	4-2-EL-02-220	型号：EL-02
荧光微孔板读板仪	Tecan	30050303	型号：Infinite 200 Pro
冷冻干燥机	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad台式冷冻干燥机
384孔微孔板	Greiner	GDE0784076	F型底，小体积，Hibase，中等结合力，黑色
实时荧光定量热循环仪（CFX Connect Real-Time PCR系统）	Bio-Rad	185-5201	型号：CFX Connect光学模块
寡核苷酸
s基因正向RPA引物	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s基因反向RPA引物	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n基因正向RPA引物	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n基因反向RPA引物	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
靶向s基因的LwaCas13a-crRNA	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
靶向n基因的LwaCas13a-crRNA	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ报告探针	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA引物	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA引物	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC