基于CRISPR的现场快速诊断技术及其预混冻干试剂

摘要

本文介绍了基于重组酶的等温扩增反应和基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）反应的预混、冻干试剂的逐步制备方法，可用于检测传染病病原体的核酸生物标志物或其他感兴趣的遗传标志物。

摘要

基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的分子诊断技术具有高诊断准确性，且具备适用于现场即时检测（point-of-care）的特点，例如结果周转时间短、读取方式简便直观，且无需复杂仪器。然而，由于该检测反应组分较多且需手动操作步骤繁杂，限制了其在即时检测场景中的便捷应用。本文提供了一种经过优化的、分步操作的实验方案，用于实现对疾病病原体和遗传标志物的稳定检测，该方案结合了基于重组酶的等温扩增技术和预混并冻干处理的CRISPR检测试剂，试剂以即用型、易储存的形式制备。预混并冻干的试剂可直接加水复溶后立即使用，并保持高效的扩增与检测性能。同时，我们还针对CRISPR诊断中预混冻干试剂在制备与使用过程中常见问题提供了故障排查指南，以提升该检测平台在更广泛的诊断与基因检测领域的可及性。

引言

基于CRISPR的核酸检测技术于2017年首次被报道，用于检测核酸生物标志物^1,2,3,4，此后已在多个国家被证实为新一代诊断技术，并已有获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的检测方法，尤其适用于严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA的检测^5,6,7,8。除2019冠状病毒病（COVID-19）外，该技术还被证明可有效检测多种病毒和细菌^{9,10,11,12,13}，以及遗传性疾病相关的突变和缺失，并可通过工程化手段用于检测蛋白质和小分子生物标志物^....

方案

1. 冻干RT-RPA预混试剂的制备

1. 设备准备
   1. 准备一个液氮杜瓦瓶或托盘，用于反应体系的速冻。向杜瓦瓶或托盘中加入液氮。
   2. 冷冻干燥机
      1. 检查排水管和腔体内部是否有冷凝水；如有需要，请清除水分。
      2. 使用RNase去污染溶液清洁腔体内部及1.5 mL微量离心管金属架，随后用70%乙醇擦拭。
      3. 关闭腔体门和真空释放阀。
      4. 开启冷冻干燥机。
      5. 手动将搁板温度设置为-30 °C。
   3. 分子生物学设备
      1. 使用RNase去污染溶液清洁以下物品：移液器、移液器吸头架、涡旋混合器、小型离心机和永久性记号笔。
      2. 使用自来水清洁以下物品，然后用擦拭纸擦干：微量离心管塑料架和用于盛放冰的泡沫盒。
      3. 准备一个加热块（用于溶解/再溶解三甘氨酸溶液），先用RNase去污染溶液和70%乙醇清洁，然后打开并设定温度为60 °C。
2. 预混RPA反应体系的制备
   注意：此配方适用于10个反应（使用三个RPA冻干颗粒）。
   1. 使用前检查三甘氨酸溶液中是否存在沉淀。若存在沉淀，请在60 °C孵育并充分混匀以溶解沉淀。在加入其他热敏感....

结果

我们重点展示了针对SARS-CoV-2的s基因和n基因联合检测时FAM荧光信号生成的动力学特征，并阐述如何利用这些信息确定冻干预混反应体系的最佳条件。在所有实验中，我们均包含了C_t值明显低于测定检测限（LoD）的样本（C_t ~31–33），以及C_t值处于检测限的样本（C_t ~35–37）⁷，以区分不同方案的灵敏度差异。

对于冻干预混的逆转录重组酶介导的扩增（RT-RPA）反应，我们发现预混体系中加入KOAc会降低反应的灵敏度（图2A）。因此，我们从预混反应体系中省略了KOAc，并在加入RNA样本后，随反应引发剂Mg(OAc)₂一同添加。我们还采用类似的检测方法确定了保护剂海藻糖的最佳浓度（图2B），以及三甘氨酸⁷在冻干RT-R.......

讨论

本实验方案中存在若干关键步骤。在区域划分方面，建议将核酸提取、预混液配制（扩增前区域）、加样以及扩增产物检测（扩增后区域）分别在独立的空间进行。每个区域应配备独立的工具和设备。严禁将某一区域的工具带入另一区域，尤其是禁止将扩增后区域的工具带入扩增前区域。工作区域的清洁至关重要：应使用RNase/DNase去污染溶液或3%次氯酸钠溶液，随后用70%乙醇或经高压灭菌的去离子水清洁工作台面、移液器、涡旋振荡器以及永久性记号笔。需清洗基础实验耗材及仪器的可拆卸部件，例如1.5 mL离心管塑料架和微型离心机的转子适配器。无核酸酶水既用作阴性对照，也作为反应组分，因此是一种易受污染的敏感试剂，若操作不当可能导致污染。因此，我们建议将无核酸酶水分装为小份，每份仅使用一次。

始终使用检测引物运行阴性对照反应，以检查是否存在污染。此外，为避免污染问题，我们建议在扩增前区域而非样品添加室中，通过加入无核酸酶水来制备阴性对照反应。乙酸镁-乙酸钾混合液应分装为小体积（约 20 µL/管），每管仅使用一次，以避免试剂被残留扩增产物污染。向冻干的RPA预混液中添加乙酸镁-乙酸钾混合液时，建议每次更换移液器吸头.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
甜菜碱溶液	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC处理水	Invitrogen	AM9915G
二硫苏糖醇（DTT）	Merck	3870-25GM
EpiScript逆转录酶	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	实验室自制		菌株名称：Leptotrichia wadei，缩写：Lwa，蛋白名称：LwaCas13a
氯化镁溶液，1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA聚合酶	Lucigen	30223-2
聚乙二醇	Sigma-Aldrich	81300-1KG
乙酸钾溶液，5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
核糖核苷酸溶液混合物	NEB	N0466L
核糖核酸酶H	NEB	M0297L
蔗糖	TCI	TCI-S0111-500G
海藻糖二水合物	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐溶液，1M，pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic试剂盒	TwistDx	TABAS03KIT
设备
BluPAD双LED蓝光/白光透射仪	Bio-Helix	BP001CU
双模块干浴器	ELITE	4-2-EL-02-220	型号：EL-02
荧光微孔板读板仪	Tecan	30050303	型号：Infinite 200 Pro
冷冻干燥机	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad台式冷冻干燥机
384孔微孔板	Greiner	GDE0784076	F型底，小体积，Hibase，中等结合力，黑色
实时荧光定量热循环仪（CFX Connect Real-Time PCR系统）	Bio-Rad	185-5201	型号：CFX Connect光学模块
寡核苷酸
s基因正向RPA引物	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s基因反向RPA引物	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n基因正向RPA引物	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n基因反向RPA引物	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
靶向s基因的LwaCas13a-crRNA	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
靶向n基因的LwaCas13a-crRNA	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ报告探针	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA引物	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA引物	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC