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长期小鼠脊髓器官型切片培养作为验证脊髓损伤后细胞移植的平台

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DOI：

10.3791/66704

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2024年4月12日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Pisa

本文内容

摘要

本文中，我们提供了一种可重复的方法，用于生成并长期维持移植了神经干细胞的脊髓组织切片 离体 用于测试细胞替代疗法的模型。

摘要

由于脊髓损伤（SCIs）具有复杂的病理生理机制，目前仍缺乏有效的治愈方法。其中一种最有前景的再生治疗策略是通过干细胞移植来替代受损组织并促进功能恢复。在开展成本更高且耗时更长的动物实验之前，应首先在体外（in vitro）和离体（ex vivo）条件下更深入地评估该策略的安全性和有效性。在本研究中，我们建立了基于小鼠脊髓（SC）器官型切片并移植人源神经干细胞的长期研究平台，用于测试针对脊髓损伤的细胞替代疗法。

标准的脊髓类器官培养物通常维持培养约2至3周 体外在此，我们描述了一种优化后的方案，可用于脊髓（SC）组织切片的长期维持培养（≥30天，最长可达90天）。用于脊髓切片长期培养的培养基也经过优化，适用于将神经干细胞移植到该类器官模型中。将携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的人源脊髓来源神经上皮干细胞（h-SC-NES）移植至小鼠脊髓切片中。移植30天后，移植细胞仍可检测到GFP表达，且凋亡率较低，表明优化后的培养环境能够支持细胞在组织内的存活与整合。该方案为在脊髓组织中高效评估细胞替代疗法提供了可靠的参考依据。该技术平台将使研究人员能够开展一系列 离体 不同细胞移植疗法的预筛选，帮助他们在推进之前选择最合适的策略 体内 实验。

引言

创伤性脊髓损伤（SCI）对患者和护理人员造成严重的身体、心理和经济后果1。已有多种方法尝试促进SCI后轴突再生2,3,4，其中通过细胞替代疗法在损伤部位近端与远端神经元之间建立神经元中继连接，已显示出一定的治疗效果。由于移植细胞具有多种作用功能，包括提供神经营养支持、免疫调节、通过诱导可塑性重建缺失的神经环路、细胞替代以及轴突再髓鞘化6，因此人们对细胞治疗的兴趣仍在持续增长5。

近年来，该领域的研究主要集中在人神经干细胞/祖细胞（NSCs/NPCs）上7多项研究表明，神经干细胞/神经前体细胞可调节星形胶质细胞的反应8，促进促再生因子的分泌9,10，并在脊髓损伤中替代缺失的神经元细胞11,12然而，支持移植细胞分化为功能性神经元的研究仍然较少。此外，移植细胞在损伤的脊髓（SC）中的存活率和分化能力较低13，这可能是因为移植的细胞需要数周甚至数月时间才能分化 体内此外，目前的研究尚未完全阐明细胞替代疗法的许多生化、分子、细胞及功能层面的问题。因此，迫切需要建立简单、快速且经济高效的模型，以研究细胞移植的机制、移植细胞的增殖能力、向特定类型或亚群细胞分化的能力，以及与宿主神经元形成突触连接的能力。

将组织学研究整合到电生理记录以及转录组和蛋白质组分析中，对于全面理解细胞移植后发生的分子级联反应至关重要。这无疑将加速新细胞替代疗法在临床前模型和临床研究中的设计与验证。事实上，迄今为止，啮齿类动物、大型动物和非人灵长类动物的使用已成功阐明了许多细胞移植后的细胞过程14。然而，由于成本高昂、伦理影响较大以及生物体本身的复杂性，这些模型往往难以应用，或不足以揭示特定的生化和分子机制。此外，它们可能存在诸多与生物学差异相关的缺点，包括种间差异（如代谢）和种内变异（如性别、年龄）。这些因素，加上应激等外部环境因素，可能改变实验结果，并影响其向人类治疗转化的可预测性15,16,17。

因此，许多研究团队采用二维 体外 细胞培养和 离体 器官型切片离体 培养物）以及动物模型。二维细胞培养是研究单细胞和/或细胞群体水平特定生物过程最常用的体系。然而，单层细胞培养无法反映完整生物体中存在的复杂性。其缺乏组织结构以及 生理环境使得二维培养系统无法完全模拟所研究组织的关键结构、形态和功能特征18,19,20. 器官型培养可克服其中一些问题。器官型模型基于组织或器官片段的外植体培养并加以维持 离体 在有限的时间内21,22. 特别是，通过制备具有精确厚度的移植组织切片，可使营养物质轻松到达切片中几乎所有的细胞。 可来源于中枢神经系统的多个区域，例如海马体、下丘脑、小脑、丘脑、大脑皮层、黑质和纹状体，以及脊髓23. 器官型培养物可保留组织结构、细胞的空间分布、细胞多样性以及微环境（即器官来源的细胞外基质组成。此外，它们在组织块移植后仍能保持原有的神经活动、细胞间的连接，尤其是短距离神经环路。

这些特点使得离体（ex vivo）培养相较于单层细胞培养和动物模型具有一些优势。它们保留了体内（in vivo）所存在的关键组织特征，同时降低了实验成本，并可在精确调控培养环境参数的条件下，开展多种分子、细胞及功能实验24,25,26,27,28,29。器官型脑片还可用于构建多种神经系统疾病模型，以模拟特定疾病的關鍵组织病理学特征30。此外，由于保留了原始的多细胞组织环境，这类模型成为药物筛选以及测试神经保护性和神经再生性分子与材料的适宜平台。

在本研究中，我们提出利用脊髓（SC）器官型培养作为优化神经干细胞（NSC）移植的模型。这并非易事，因为需要数周时间维持最佳培养条件，以确保宿主（脊髓组织）和移植物（NSCs）的存活。不同的研究团队已在脑源性和脊髓源性器官型培养体系中移植了多种类型的细胞。多数研究报道了间充质干细胞31,32,33、嗅鞘细胞34或神经干细胞35,36,37,38,39,40的移植，并评估了移植细胞与宿主细胞之间的相互作用、整个系统的存活情况，以及移植细胞是否在离体（ex vivo）组织环境中分化为神经元或类神经元细胞32,33,41。部分研究进一步评估了移植后细胞的再生潜能，例如观察其在组织内的轴突生长37,40,41、移植的少突胶质前体细胞的髓鞘形成能力42、移植细胞向宿主组织的迁移情况43，以及移植细胞是否释放促进再生微环境形成的因子31。当前研究的一个局限性在于，尚未对移植后的长期定植效果进行深入探索。

考虑到神经干细胞（NSCs）在体内分化似乎需要数周时间in vivo44,45，本研究重点在于如何生成并维持长达90天的小鼠脊髓（SC）组织切片（≥30天）。研究发现，这些切片能够长期保持其原有的解剖结构，细胞凋亡率低且稳定，并具有较高的细胞活力。我们观察到神经元标志物RNA结合蛋白fox-1同源物3（RBFOX3）和神经丝轻链（NFL）呈弥散性表达，其中后者随时间推移在切片周围表现出轴突 sprouting（出芽）增加的趋势，表明切片处于良好的生理状态。此外，我们将表达绿色荧光蛋白（GFP）的人源脊髓来源神经上皮干细胞（h-SC-NES）在神经元分化的早期阶段成功移植至脊髓切片中。移植后，神经干细胞移植物在培养中维持了30天，且在整个培养期间均持续表达GFP。在移植后第30天（DPT 30），细胞的凋亡率与同批细胞在DPT 7时所观察到的凋亡率相当40。这些细胞似乎成功植入组织微环境中，并可存活数周之久。

总之，我们的数据表明，可以在培养中将脊髓器官型切片维持长达3个月，同时不破坏其原有的细胞结构和组织微环境。最重要的是，这些切片可用于在开展进一步研究之前测试细胞治疗策略 体内 实验，从而降低实验成本和时间。本文详细阐述了制备小鼠脊髓（SC）器官型切片的全部步骤，以及如何将切片长期维持（≥30天）。此外，我们还深入说明了如何将神经前体细胞（NPC）移植到切片中，并如何维持切片以进行后续分析。

方案

动物实验严格遵循意大利公共卫生部和比萨大学当地伦理委员会批准的协议，并符合欧盟指令2010/63/EU（项目许可证编号：39E1C.N.5Q7，签发于2021年10月30日）。C57BL/6J小鼠饲养于受控环境（23℃） ± 1 °摄氏度，50 ± 5% 湿度）条件下，12 小时光照-黑暗循环，自由摄食和饮水 随意.

所有与人源脊髓神经上皮干细胞（h-SC-NES细胞）相关的工作均依照美国国立卫生研究院（NIH）关于用于生物医学研究的人体组织获取与分发的指南进行，并获得了各样本提供机构的人体研究委员会及机构伦理委员会的批准。最终批准由比萨大学生物伦理委员会（审查编号：29/2020）授予。去标识化的人体样本由英国医学研究理事会（MRC）/惠康信托基金联合资助项目（099175/Z/12/Z）及人类发育生物学资源库（www.hdbr.org）提供。已获取适当的知情同意，且记录了每份样本所有可获得的非识别性信息。组织样本的处理严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）（http://bioethics.od.nih.gov/humantissue.html）和世界医学协会《赫尔辛基宣言》（http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html）所制定的人脑组织用于科研的伦理指南与法规。      

1. 脊髓（SC）分离与培养所需溶液和设备的准备

  1. 用于包被的溶液 膜插件
    1. 制备包被溶液（表1）：含 0.1 mg/mL 的水溶液-1 胶原蛋白，0.01 mg/mL-1 poly-L-lysine 和 0.01 mg/mL-1 层粘连蛋白
    2. 将每个膜插件放入一个35 mm培养皿或6孔板中。
    3. 在膜的上层加入1 mL包被液：室温（RT）孵育4小时；然后移除包被液，让膜插件过夜（ON）干燥。将膜插件于4℃保存 °C，直至使用。
      注意：所有操作均需在无菌条件下进行。膜包被物在4℃下最多可保存1周。 °使用前需将温度降至 C，以避免蛋白质降解及组织切片在膜上的黏附效果不佳。
  2. 培养基制备：器官型培养基、解剖培养基、移植培养基
    1. 制备器官型培养基（OM， 表1).
    2. 按照所述方法制备解剖培养基 表1.
    3. 配制移植培养基（GM，优化自 Onorati 等人）46, 表1).
      注意：溶液应在无菌条件下制备，并在使用前（实验前一天或当天）进行配制。
  3. 手术所需材料的准备
    1. 在生物安全柜中，准备好以下物品以备使用：解剖体视显微镜和手术器械：两把显微剪刀、两把直镊子和两把弯镊子。
    2. 在生物安全柜中，通过安装刀片来准备切片仪，以将脊髓切成片状。旋转切片仪的螺丝，抬起用于安装刀片的金属臂。将刀片放置在指定位置，降低带刀片的金属臂直至其接触切割平台，并使用六角扳手拧紧紧固螺丝，将刀片牢固固定。旋转微调螺丝至所需的切片厚度（通常为350） μm) 检查刀片是否精确地垂直于切割平台放置。
      ​注意：刀片相对于切割台必须精确垂直放置，才能正确完成切割。
    3. 在生物安全柜中准备：两根塑料巴斯德吸管（用于转移分离的脊髓和切片）、至少四个35 mm和两个60 mm培养皿，以及一盒新鲜冰块。
    4. 使用前用70%乙醇和紫外线（一个20分钟循环）对所有器械进行灭菌，以保持培养环境的无菌状态。

2. 小鼠脊髓的分离与切片制备

  1. 小鼠脊髓的分离
    1. 根据项目许可证处死出生后第3天（P3）的小鼠幼崽。
    2. 使用显微剪刀经正中腹切口分离小鼠躯体，取出腰段脊柱并置于35 mm培养皿中的冷解剖液中。
    3. 在解剖体视显微镜下，使用显微剪刀沿矢状轴切开脊柱，并用直头镊子轻轻将脊髓从脊柱腔中取出。
    4. 使用直头镊子小心剥离分离出的脊髓腰段区域的脑膜。
    5. 将分离出的脊髓腰段区域转移至新鲜冷解剖液中，孵育10–15分钟，随后进行下一步操作。
  2. 切片制备
    1. 使用一次性塑料巴斯德吸管将分离的脊髓腰段区域从解剖液中取出，垂直于刀片方向放置于切片机的切割台上。
      注：脊髓相对于刀片的正确位置（垂直）对于成功制备脊髓切片至关重要。
    2. 借助巴斯德吸管和无菌吸水纸，清除切割台上脊髓周围的残余解剖液，随后进行脊髓的自动切片。
    3. 切片完成后，用巴斯德吸管向切割台上的切片加入新鲜解剖液，然后将切片收集至盛有新鲜解剖液的35 mm培养皿中，孵育15分钟。
    4. 在切片孵育期间，使用塑料巴斯德吸管用OM 洗涤膜插件表面3次。随后在每个膜插件底部加入1 mL OM。
    5. 在解剖体视显微镜下检查切片，使用塑料巴斯德吸管将所需数量的切片转移并接种至预处理的膜插件上。
    6. 借助直头镊子将切片在膜插件上调整至理想方向和位置，用巴斯德吸管吸除多余液体，以促进切片更好地贴附于膜表面。
      注：使用直头镊子移动和调整切片时应轻柔操作，避免损伤组织或膜插件。
    7. 在37 °C孵育30分钟后，将插件转移至新的培养皿中。
      注：更换培养基时仅触碰塑料环，避免接触膜表面。
    8. 在膜插件底部加入1 mL新鲜OM，并补充胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）至终浓度100 ug mL-1 。
    9. 将切片置于37 °C继续孵育。将体外培养的第一天记为DEV 0（day ex vivo 0）。

3. 器官型脑片的长期培养

  1. 将切片在37℃培养条件下维持培养 °C 直至预定的时间点。
  2. 在DEV 1时，按照步骤2.2.7–2.2.8所述，用新鲜的OM更换培养基。
  3. 在第3天，更换为GM培养基，以在移植干细胞的前一天创建适宜的环境。每48小时更换一次新鲜GM培养基（例如., DEV 5, DEV 7…).
  4. 加入新鲜的 GDNF（终浓度 100） µg/mL-1每天向培养基中添加，直至 DEV 7。DEV 7 之后，仅在更换培养基时添加（步骤 3.3）。

4. h-SC-NES 细胞培养

注意：h-SC-NES 细胞在含有生长因子的培养条件下维持培养（NES 培养基，步骤 4.1.1）。在移植前，将细胞置于预分化条件中培养 7 天，即从培养基中去除生长因子（预分化培养基：不含成纤维细胞生长因子 2（FGF-2）和表皮生长因子（EGF）的 NES 培养基，步骤 4.1.2）。随后，在移植前将细胞置于分化条件下培养 2 天（分化培养基，步骤 4.1.3）。分化过程通过在分化培养基中添加神经营养补充物（脑源性神经营养因子，BDNF）予以支持。h-SC-NES 细胞的维持、传代、预分化及分化过程12,46将在下文详细描述。

  1. 培养基制备：NES培养基、预分化培养基和分化培养基
    1. 配制人脊髓神经上皮干细胞维持培养基（NES培养基， 表1).
    2. 制备人脊髓神经上皮干细胞预分化培养基（预分化培养基， 表1).
    3. 制备人脊髓神经上皮干细胞分化培养基（分化培养基， 表1加入BDNF时需新鲜配制，每次更换培养基或细胞首次接种于分化条件时均应添加。
      注意：所有培养基均需在无菌条件下配制，并使用 0.22 μm 滤器过滤。 µm 滤光片
  2. 人脊髓神经上皮干细胞（h-SC-NES细胞）包被溶液
    注意：h-SC-NES 细胞维持在 POLFN 包被的培养载体上（POLF = 多聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白）。
    1. 在离心管中配制包被液：含层粘连蛋白的多聚-L-鸟氨酸溶液（5 µg/mL−1）和纤维连接蛋白（1 µg/mL−1).
    2. 将制备好的包被液转移至细胞培养支持物中，注意加入足量液体以完全覆盖细胞培养支持物的整个表面。在37℃孵育包被1小时。 °C 或在 4℃ 下过夜 °C.
    3. 从细胞培养支持物中移除包被液。
      注意：POLFNS 溶液可再循环使用两次，但每次需新鲜添加层粘连蛋白（Laminin）和纤连蛋白（Fibronectin）。
    4. 用细胞培养级无菌水洗涤包被材料3次。将包被材料于4℃保存。 °C 或使用它。
      注意：包被液应在1周内使用。超过该时间后，由于所添加蛋白质的降解，包被液被视为已过期。
  3. h-SC-NES 细胞培养维持
    1. 在 NES 培养基中培养 h-SC-NES 细胞。每天在显微镜下观察细胞，以监测其达到汇合状态的时间。
    2. 每2天更换一半培养基：移除一半的条件培养基，并加入新鲜培养基（考虑20%的蒸发率）。
    3. 如果细胞达到汇合状态，则按照步骤 4.4 所述进行传代。
  4. h-SC-NES 细胞传代
    注意：细胞按如下方式分装12:
    1. 移除培养基，并用不含 Ca 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次2+/Mg2+.
    2. 移除 DPBS，并向细胞中加入胰蛋白酶/EDTA 溶液以进行酶解分离。将细胞在 37 °C，30 秒至 1 分钟。
    3. 孵育后，在显微镜下观察细胞：若细胞未脱落，可轻轻敲击细胞培养载体以进行机械性解离，并将其在37 °C，再持续30秒。
    4. 孵育后，向含有细胞和胰蛋白酶/EDTA的细胞培养支持物中加入4倍体积的DPBS/胎牛血清（FBS）（10% vol/vol）溶液，以灭活胰蛋白酶/EDTA。轻轻吹打细胞培养支持物表面的溶液，上下反复吹吸，以促进所有细胞脱落。收集细胞悬液至离心管中。
    5. 将细胞悬液在200 × g下离心 × g 3 分钟后弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜的 NES 培养基中。
    6. 计数细胞，并以每平方厘米的密度将它们接种到每个新的POLFN包被的培养载体上 ̴0.5-1 × 105 细胞/厘米²2.
    7. 加入 Y-27632（10 µM）并将细胞置于37 °C. 每天观察细胞，直至达到汇合度，然后再次传代用于维持/扩增或细胞保种。
  5. h-SC-NES 细胞预分化
    1. 按照步骤 4.4 中所述方法对细胞进行分装。
    2. 将细胞以一定密度接种于POLFN包被的细胞培养支持物上 ̴0.5-1 × 105 细胞/厘米²2 在预分化培养基中. 加入 Y-27632（10 µM）消化后。将预分化阶段的第一天称为第1天 体外 （体外培养天数）0
    3. 每2-3天更换一半培养基（见步骤4.3.2）。
    4. 将细胞维持在预分化条件下至DIV 7，然后进行步骤4.6。
  6. h-SC-NES 细胞分化
    1. 在预分化第7天（DIV 7），按照步骤4.4所述方法对细胞进行传代。
    2. 将细胞以一定密度接种于POLFN包被的细胞培养支持物上 ̴1-1.5 × 105细胞/厘米²2在分化培养基中. 加入 Y-27632（10 µM) 和 BDNF（30 ng/mL）−1分裂后）
    3. 在分化2天后（DIV 10），将细胞分割并移植至切片中。

5. 利用携带GFP的慢病毒载体转导h-SC-NES细胞

注意：细胞转导在 h-SC-NES 细胞的维持阶段进行。当细胞成功转导后，可进行扩增，并应用此前描述的预分化和分化方案（步骤 4.5 和 4.6）。

  1. 细胞转导培养基的制备
    注意：细胞转导培养基是通过将特定体积的 NES 培养基与精确体积的慢病毒载体原液（LVS）根据不同的参数混合而制备的：所需的感染复数（MOI，multiplicity of infection = 感染体系中病毒颗粒数量与宿主细胞数量的比值）；接种细胞的数量；LVS 原液的初始浓度（= LVS PFU，空斑形成单位）；所用培养容器的表面积。
    1. 根据所选的 MOI，使用公式（1）和（2）计算需加入 NES 培养基中的 LVS 原液的正确体积。
      (每 cm2 接种的细胞数) × 细胞培养支持面积（cm2 ） × MOI = 所选 MOI 对应的 LVS PFU   （1）
      LVS PFU : LVS 初始总体积（µL） = 所选 MOI 对应的 LVS PFU : 需加入培养基的 LVS 体积（µL）（2）
      注意：LVS PFU（LVS 初始 PFU）和 LVS 初始总体积 由生产商提供。所选 MOI 对应的 LVS PFU 按公式（1）计算得出。因此，可根据公式（2）计算出为达到所选 MOI，需加入总 NES 培养基体积（基于细胞培养支持面积）的 LVS 原液体积。
      示例：我们根据以往实验室经验选用 MOI 为 3（MOI 可能因所用细胞系和病毒制备条件不同而变化）。若目标 MOI 为 3，接种细胞数为 0.5 × 105/cm2，培养支持为 1 个 MW24 孔板中的单孔（2 cm2），假设初始 LVS PFU/TU（空斑形成单位/转导单位）为 25 × 106  PFU/1 mL（1,000 μL = 初始 LVS 体积），则计算如下：
      1 孔 MW24（2 cm2）中接种的细胞数 = 0.5 × 105  细胞 × 2 cm2  = 1 × 105  细胞
      1 × 105  细胞 × 3（MOI）= 3 × 105  PFU = MOI 3 对应的 LVS PFU
      25 × 106  PFU : 1,000 µL = 3 × 105 PFU : x µL
      x µL = 12 µL = 需加入培养基的 LVS 体积
      因此，为在 1 孔 MW24 中以 MOI 3 使用 细胞转导培养基 转导细胞，需将 12 µL 的初始 LVS 原液加入为 MW24 单孔准备的 NES 培养基（238 µL）中。最终总体积为 250 µL。
      注意：该培养基通常在转导当天于无菌条件下新鲜配制。
  2. h-SC-NES 细胞转导方案
    1. 将低代次的 h-SC-NES 细胞以 0.5 × 105/cm2 的密度接种于 POLFN 包被的 24 孔板（或任何其他培养支持）中的 NES 培养基内。
    2. 次日，收集细胞接种孔中的条件培养基。根据所选的培养支持，向细胞中加入能均匀覆盖接种表面所需的最少体积的新鲜细胞转导培养基（例如，24 孔板每孔 250 µL）。
    3. 随后，将 h-SC-NES 细胞在 37 °C 下孵育 6 小时。之后，将先前收集的条件培养基加入细胞中（24 孔板每孔 200 µL），并在 37 °C 下继续孵育过夜（ON）。
    4. 次日，用 DPBS 对 h-SC-NES 细胞洗涤一次，并更换全部培养基（NES 培养基）。
    5. 后续几天，在荧光显微镜下观察细胞以检测 GFP 表达情况。
    6. 扩增 h-SC-NES 细胞用于细胞库建立和移植。

6. 细胞移植至脊髓切片及共培养

  1. 玻璃微针的制备
    1. 使用拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中制备精细针头。拉针仪设置如下： HEAT 990，PULL 350.
      注意：从一根毛细管可制备出两根细针。
  2. 用于移植的细胞制备
    1. 按照第4.4步所述方法对细胞进行分装。
      注意：如果细胞不表达荧光报告基因，则需使用细胞示踪染料对其进行标记，以便在移植后及长期培养期间通过荧光显微镜进行监测。标记步骤请遵循所选厂商提供的操作说明。
    2. 消化后计数细胞，并在200 × g下离心 × g 3分钟。用新鲜培养基 + Y-27632（10）重悬所得沉淀 µM）以获得所需细胞浓度（通常为 30,000–50,000 个细胞） µL-1).
    3. 将细胞悬液转移至 500 µL 或 1.5 mL 离心管中，置于冰上。细胞已准备好用于移植。
  3. 将细胞移植至器官型脑片
    注意：使用空气微注射器和玻璃微针将h-SC-NES细胞移植到小鼠脊髓器官型切片中。
    1. 用玻璃微量移液管加载 4 µ使用微量移液器和微量加样器吸头吸取细胞悬液。
      注意：避免针头中产生气泡，因为气泡可能妨碍显微注射过程。如果产生气泡，需用微量移液器将其去除。
    2. 将针头放入显微注射仪的指定支架中，并使用直头镊子折断针头尖端。
      注意：将玻璃针在靠近尖端处折断，以避免形成较大的孔洞。
    3. 移植到切片前，设定显微注射参数。设定 压力 在 10 psi.
      注意：压力值可根据显微注射仪型号及操作者观察进行调整：压力应足以完成细胞悬液的显微注射，同时避免对组织造成损伤。
    4. 在已校准的玻璃载片上，用巴斯德吸管滴加一滴矿物油，并将细胞悬液显微注射至油滴中。细胞悬液在油滴中形成的液滴直径与特定的显微注射体积相对应。根据需要调整显微注射参数，使细胞悬液形成的液滴直径达到0.2 mm，以实现4 nL的注射体积。
    5. 设定正确体积后，迅速将细胞悬液微量注射到切片中。在荧光体视显微镜下观察切片中是否存在细胞，以确认微量注射/移植是否成功。
      注意：细胞悬液有时可能会堵塞针头：此时，可通过调整注射参数或更换新针头并加载新鲜细胞悬液来清除堵塞。
    6. 移植后，将切片置于37 °C 和 5% CO2直至达到预期时间点，并按照步骤 2.2.7-2.2.8 所述每隔一天更换培养基。

7. 免疫荧光染色

  1. 第1天
    1. 从插入膜底部移除培养基，并用预热的DPBS洗涤切片3次。
    2. 用预热的4%多聚甲醛（FA）固定切片：吸除DPBS，于膜插件底部加入1.5 mL 4% FA，室温孵育15分钟；随后在膜插件上表面再加入1 mL 4% FA，继续室温孵育15分钟。总固定时间为室温下30分钟。
    3. 移除4% FA，并用DPBS洗涤切片3次，每次10分钟。
    4. 使用手术刀沿环形方向切割插入膜边缘，将带有切片的膜从插入件的塑料部分分离，随后进行免疫荧光步骤。
      注意：此步骤后，带有切片的膜将漂浮于培养皿中的DPBS内。
    5. 每张膜加入1 mL含0.7% Triton的DPBS溶液，室温透化处理10分钟。
    6. 移除透化液，每张膜加入1 mL封闭液（含0.5% Triton和10% FBS的DPBS溶液），4 °C孵育4小时。
    7. 移除封闭液，每张膜加入1 mL抗体稀释液（含0.5% Triton和1% FBS的DPBS溶液），并按工作浓度加入一抗，例如：小鼠抗神经丝蛋白（NFL）抗体，1:500；兔抗NFL抗体，1:500；兔抗RBFOX3（NeuN）抗体，1:400；兔抗活化型caspase-3（aCASP3）抗体，1:400；小鼠抗人源细胞核抗体（Hu-Nu），1:400；兔抗Hu-Nu抗体，1:400；小鼠抗GFP抗体，1:400（如表1所示）。4 °C过夜孵育。
  2. 第2天
    1. 用1–2 mL DPBS洗涤膜3次，每次10分钟。
    2. 每张膜加入1 mL抗体稀释液（含0.5% Triton和1% FBS的DPBS溶液），并加入二抗（例如：山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488，1:500；山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 568，1:500；山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647，1:500；山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647，1:500，如表1所示）以及用于标记细胞核的Hoechst/DAPI，室温避光孵育3小时。
      注意：在孵育及后续步骤中需小心保护样品免受光照，以防二抗发生荧光淬灭。
    3. 移除抗体溶液，并用DPBS（1–2 mL）洗涤3次，每次10分钟。
    4. 更换为新鲜DPBS，置于4 °C避光保存。
    5. 免疫荧光程序完成后，将膜安装至载玻片上。在载玻片上滴加200 µL封片液。使用直头镊子将漂浮的膜从35 mm培养皿转移至盖玻片，再将其转移至含有封片液的载玻片上。
    6. 在新的盖玻片上滴加100 µL封片液，覆盖于膜上，并固定在载玻片上。在化学通风橱中避光条件下过夜干燥。
    7. 将样品置于4 °C黑暗环境中保存，或直接进行成像分析。

8. 活/死细胞检测

  1. 通过分装新鲜培养基，每皿700 µL，制备工作液，并按正确的使用稀释比例加入Sytox（例如组分B，1:2,000）和Calcein AM（例如组分A，1:2,000）。
    注意：由于试剂对光敏感，请避免工作液暴露于光照下。
  2. 评估膜底部的培养基体积，并按照步骤8.1中所述的相同工作稀释比例加入Sytox和Calcein AM。
  3. 在步骤8.1中制备的工作液表面，每片组织上滴加2滴，每滴30 μL 。
    注意：将培养皿置于避光环境中，防止光照。
  4. 在室温下孵育30分钟。
  5. 孵育结束后，使用手术刀沿插入物边缘环形切割膜：随后，带有组织切片的膜将漂浮于工作液中。
  6. 借助直头镊子将未加封片液的膜反面朝下放置于盖玻片上，并在膜上方加入100 µL DPBS，以保持其湿润。
  7. 尽快使用共聚焦显微镜采集活体图像。
    注意：在图像采集过程中，每隔30分钟在膜表面滴加2滴DPBS，每滴40 µL，以防止膜干燥。

9. 成像

  1. 固定样品的共聚焦成像
    1. 对于定性分析，使用共聚焦显微镜并按照以下采集参数获取图像：设置 大图选项 （选择： 4 × 4），使用 10倍物镜, 无堆叠，以及一个 分辨率 的 3,634 × 3,634 像素.
    2. 对于定量分析（切片的aCASP3、Calcein和Sytox，以及细胞的aCASP3），使用共聚焦显微镜并按照以下采集参数获取图像： 20倍物镜，分辨率 的 1,024 × 1,024 像素 与一个 Z步进 的 3 μm.
  2. 使用体视显微镜对移植组织切片进行活体成像
    注意：使用体视显微镜在明场和落射荧光模式下采集图像。
    1. 利用 明场 在设定条件下，获取切片的图像（10倍物镜 与 3倍变焦 此处使用）。
      注意：根据所用显微镜调整光照，必要时使用光纤。
    2. 使用 荧光 在相同设置下，使用与切片相同的物镜和缩放倍数对移植细胞进行成像（参见步骤 9.2.1）。图像采集时使用以下参数： 增益1，曝光时间200-500毫秒，偏移-10.
  3. 活/死染色后利用共聚焦显微镜进行活细胞成像
    1. 使用共聚焦显微镜并按照以下采集参数获取图像： 20倍物镜，分辨率1,024 × 1,024像素 与一个 Z步进 的 3 μm.

10. 使用 ImageJ 进行图像分析

  1. NFL、RBFOX3 和 DAPI 面积分析
    1. 打开 ImageJ 软件（https://imagej.net/software/imagej/）。
    2. 单击打开文件图像 文件 | 打开 | 选择文件 | 打开.
    3. 在弹出窗口中，选择 堆栈视图 | 超级堆栈 和 颜色模式 | 默认（带自动缩放）.
    4. 在工具栏中，选择 图像 | 颜色 | 拆分通道.
    5. 选择要分析的通道： 绿色通道 用于 NFL（轴突标志物），红色通道 用于 RBFOX3（神经元标志物），以及 蓝色通道 用于 DAPI（细胞核染色）.
    6. 进行 NFL 分析时，执行以下步骤：在工具栏中选择 图像 | 调整 | 阈值 选择 参数 （深色背景，算法，例如默认设置）将光标移至数值条（下方/上方），覆盖并圈定所有神经突区域（在深色背景下，神经突以白色高亮显示） 设置 | 应用.
    7. 从工具栏中选择 描边工具 Wand 并利用它自动定义 NFL 覆盖的白色区域。 新闻报道 分析 | 测量 | 面积值 μm2.
    8. 对于 DAPI 和 RBFOX3 分析，请执行以下步骤：在工具栏中选择 图像 | 调整 | 阈值 选择 参数 （白色背景，算法， 例如，默认设置），将光标移至值条（下方/上方）以覆盖并圈定所有 RBFOX3 或 DAPI 区域 | 设置 | 应用.
    9. 在工具栏中，选择 流程 | 快速傅里叶变换 | 带通滤波器. 使用 阈值条 调整被 RBFOX3 或 DAPI 荧光信号覆盖的白色区域。
    10. 从工具栏中选择 描边工具 Wand 并利用它自动定义 RBFOX3 或 DAPI 染色覆盖的区域。 新闻 分析 | 测量 | 面积值 μm2.
  2. 通过 ImageJ 分析细胞凋亡
    1. 打开 ImageJ 软件（https://imagej.net/software/imagej/）。
    2. 单击以打开Z轴堆栈文件图像 文件 | 打开 | 选择文件 | 打开.
    3. 在弹出窗口中，选择 堆栈视图 | 超级堆栈 以及 颜色模式 | 默认（带自动缩放）.
    4. 在工具栏中，选择 图像 | 颜色 | 拆分通道.
    5. 选择所需的通道： 红色通道 用于 aCASP3 (凋亡标志物 用于分析）和 蓝色 或 青色 用于 DAPI 或 人-鼠 用于细胞核染色。然后，在工具栏中选择叠加通道 图像 | 颜色 | 合并通道 | 创建复合图像.
    6. 拖动图像底部的Z轴滑块浏览图像的Z轴层切序列，并在切片中央区域中识别显示aCASP3阳性的层切序列。
    7. 在工具栏中，选择 插件 | 分析 | 细胞计数器.
    8. 在弹出的窗口中，选择 初始化 为计数准备图像；然后，选择一个 计数类型 （例如，1型) 并将其重命名为待计数对象（例如.，活化型半胱天冬酶3+ 细胞）。按照上述方法重命名其他计数类型，以计数其他对象（例如.DAPI+ 或 Hu-Nu+ 细胞总数中的细胞数）。
    9. 在弹出窗口中，选择与待计数对象对应的计数器类型 (例如，aCASP3+ 细胞），然后选择 点工具 在工具栏中开始手动计数已打开图像中呈 aCASP3 阳性的凋亡细胞数量，逐一点击每个阳性细胞。
    10. 在细胞计数器窗口中选择另一种计数模式，开始计数细胞总数（DAPI）+ 细胞，用于切片；Hu-Nu+ 细胞（用于移植的细胞）
  3. 通过 ImageJ 分析活/死细胞检测
    1. 打开 ImageJ 软件（https://imagej.net/software/imagej/）。
    2. 单击以打开Z轴堆栈文件图像 文件 | 打开 | 选择文件 | 打开.
    3. 在弹出窗口中，选择 堆叠观察 | 超堆栈 以及 颜色模式 默认（含自动缩放）.
    4. 在工具栏中，选择 图像 | 颜色 | 拆分通道.
    5. 选择所需的通道： 绿色通道 用于 钙黄绿素 （用于分析的活力标记物）和 青色通道 用于 Sytox （死亡标记）。然后，在工具栏中选择叠加通道 图像 | 颜色 | 合并通道 | 选择创建复合图像.
    6. 拖动图像底部的Z轴滑块，浏览图像的Z轴层切序列，并在切片中央区域中识别出具有Calcein和Sytox阳性的层切图像。
    7. 在工具栏中，选择 插件 | 分析 | 细胞计数器.
    8. 在打开的弹出窗口中，选择 启动 以准备进行计数；然后选择一个 计数类型 （例如，1型) 并将其重命名为待计数对象（例如，Calcein）+ 细胞）。如有必要计数其他对象（例如.Sytox+ 细胞
    9. 在弹出窗口中，选择与待计数对象对应的计数器类型；然后选择 点工具 在工具栏中开始手动计数Calcein的数量+ 细胞，在打开的图像中点击每一个阳性细胞。
    10. 在细胞计数器窗口中选择另一种计数模式，然后对Sytox进行计数+ 细胞，如Calcein所述。

11. 图表与统计分析

  1. 使用选定的软件进行所有统计分析并绘制图表。

结果

本方法可实现从小鼠P3阶段获取脊髓（SC）器官型切片，并在健康条件下长期体外培养。此外，我们展示了将细胞移植至切片中并进行长达30天共培养的实验方案（图1）。首先，我们优化了培养条件，并建立了一种适用于移植细胞后脊髓切片长期培养的方案（图2A）。切片在发育第0天（DEV 0）至发育第2天（DEV 2）期间于OM培养基中制备并维持培养，该培养基最初被提出为维持脊髓切片的最佳培养体系47。然而，由于OM含有血清蛋白，可能不利于移植的神经前体细胞的神经元分化与成熟。因此，在DEV 3时，我们测试了从OM转换为GM培养基的方案，GM由Neurobasal加B27组成，可支持神经元存活，且不含抑制正常神经元分化、反而促进胶质细胞命运的血清成分48,49。

图2B 显示了在发育第3天（DEV 3）将培养基从OM切换为GM所获得的结果，与未进行培养基切换的脊髓切片（对照组切片在OM中培养）相比。我们采用切片内神经丝轻链（NFL）信号的分布作为神经元完整性的指标。图2B, C）。在DEV 7时，两种培养条件下的脑片均保持良好状态，神经丝蛋白（NFL，绿色）在组织内呈弥散分布。在DEV 10时，GM培养条件下的脑片相较于OM培养的对照组脑片显示出更佳的健康状态，这可通过NFL染色分布情况得到证实。我们还对NFL进行了定量估算+ 面积（% NFL）+ 面积/DAPI+ 代表性图像中所示切片的面积 图2B. 估算的 NFL+ 该区域在直方图中表示为 图 2C，证实在这两种条件下，DEV 7 时 NFL 信号在切片中呈弥散分布。然而，在 DEV 10 时，OM 培养条件下的 NFL 染色覆盖面积估计值有所减少。

这些数据表明，在DEV 3时转换为GM对SC脑片的长期培养（DEV 10）具有良好的耐受性。接下来，我们进一步在更长时间点（DEV 30、DEV 60和DEV 90）测试了GM的效果。如图所示 图3A，B，脑片在培养中保持健康状态直至DEV 90。在各个时间点，脑片中均广泛存在NFL染色，且从中部区域向外周出现弥漫性神经突起芽生。事实上，我们估算了NFL+ 所示切片的区域 图3A 随着时间的推移而增加，如直方图所示 图 3B我们还观察到神经元标志物 RBFOX3 呈阳性，为脑片的神经元分化提供了另一条证据。在每个时间点，我们通过检测不同脑片中 aCASP3 阳性细胞的数量来评估细胞凋亡率。图4A，B）。分析按照第10.2节实验方案所述进行。凋亡率（% aCASP3+ 细胞/DAPI总细胞数+ 细胞）在各个时间点均处于极低水平（DEV 30、60 和 90 分别为 0.85 ± 0.52%、0.71 ± 0.27%、0.66 ± 0.45%），且三个时间点之间无显著差异（p值 > 0.05, 图4B）。这些数据表明，与aCASP3相关的凋亡率在时间过程中保持稳定，且与NFL在切片中的广泛分布相结合（图4A)，在每个时间点确认切片的存活状态。

为了进一步支持先前的数据，我们还进行了活/死细胞检测，以评估三个不同时间点脑片的存活情况。我们使用Calcein（绿色染色）标记存活且具有代谢活性的细胞，使用Sytox（青色染色）评估细胞死亡。如图4C的柱状图所示，代谢活性细胞的比例从DEV 30到DEV 90略有上升（DEV 30、60和90分别为93.17 ± 5.21%、96.43 ± 3.02%和96.33 ± 3.10%），在最后两个时间点之间趋于稳定（DEV 30 与 DEV 60 的 p 值 = 0.018；DEV 30 与 DEV 90 的 p 值 = 0.027；DEV 60 与 DEV 90 的 p 值 = 0.99）。我们发现细胞死亡水平较低，且随时间逐渐下降（DEV 30、60和90分别为6.83 ± 5.21%、3.57 ± 3.02%和3.66 ± 3.10%），DEV 30与后续时间点（DEV 60和DEV 90）之间的差异具有统计学意义（DEV 30 与 DEV 60 的 p 值 = 0.018；DEV 30 与 DEV 90 的 p 值 = 0.027；DEV 60 与 DEV 90 的 p 值 = 0.99）。这些数据结合凋亡率结果，证实了脑片在培养期间的长期存活，支持所采用的长期培养方案的有效性。

在确定脊髓切片长期培养的可行性后，我们进一步通过移植处于神经元分化早期阶段的人源脊髓神经上皮干细胞（h-SC-NES细胞）来验证该系统的应用潜力。我们选择测试h-SC-NES细胞，是因为其在脊髓损伤（SCI）治疗中已显示出良好的前景12。将h-SC-NES细胞移植至小鼠脊髓切片的具体操作步骤详见方案第6部分。脊髓切片及移植的h-SC-NES细胞被持续培养至移植后第30天（DPT 30）。细胞在体外分化第10天（DIV 10，即神经前体细胞阶段）被移植至胚胎发育第4天（DEV 4）的器官型脊髓切片中，如图5A所示的方案示意图。移植后的细胞在体外培养中持续监测其绿色荧光蛋白（GFP）的表达，最长达到30天。图5B展示了在不同移植后时间点（DPT），携带移植GFP+细胞的脊髓切片的代表性活细胞成像图像。GFP表达随时间保持稳定（图5B和图6A），表明在先前优化的培养条件下，移植细胞能够在脊髓组织内存活。我们还按照方案第10.2节所述方法检测了移植细胞的凋亡率。结果显示，在移植后第30天（DPT 30），凋亡率（aCASP3+细胞占Hu-Nu+细胞总数的百分比）极低（0.44 ± 0.34%）（图6B）。此外，DPT 30时的凋亡率与此前报道的同类型细胞在DPT 7时的水平相当40，表明培养体系随时间逐渐趋于稳定。

小鼠脊髓切片制备及NES细胞移植示意图；存活率评估方法。
图1：实验方案的工作流程。 代表性示意图展示本实验方案的整体操作流程。(A) 左侧为从小鼠幼崽（P3阶段）分离脊髓并制备脊髓组织切片及长期培养脊髓器官型切片的流程示意图。(B) 右侧为将表达GFP的人源脊髓来源神经上皮干细胞（h-SC-NES）移植至小鼠脊髓器官型切片中的流程示意图。移植后的细胞在移植后第30天（DPT）进行维持培养。缩写：h-SC-NES = human spinal cord-derived neuroepithelial stem；GFP = green fluorescent protein；DEV = day ex vivo；DPT = day post-transplant；NFL = neurofilament light chain；RBFOX3 = RNA binding fox-1 homolog 3；aCASP3 = active Caspase-3；SC = spinal cord。请点击此处查看该图的放大版本。

神经突起发育过程、显微镜图像、图表；器官型培养基与移植物培养基的影响，DEV 7、10。
图 2：长期培养条件的优化。 （A）测试器官型培养基（OM）与移植物培养基（GM）方案的代表性示意图。对照组在DEV 7-10期间维持使用OM。处理组切片在DEV 3时更换为GM；随后在DEV 7-10时固定，以与对照组进行比较。（B）比较不同培养条件下小鼠脊髓（SC）器官型切片在DEV 7和DEV 10时的代表性图像。切片经细胞骨架标记物神经丝轻链蛋白（NFL，绿色）染色。使用GM培养的切片中NFL染色分布广泛，提示整体细胞存活与分化良好。细胞核经DAPI复染。比例尺 = 500 µm。（C）基于图 1B所示切片中NFL覆盖面积估算的代表性直方图。在DEV 10时，OM培养条件下的NFL表面积减少。缩写：DEV = 离体培养天数（day ex vivo）；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；NFL = 神经丝轻链蛋白；OM = 器官型培养基；GM = 移植物培养基；SC = 脊髓。请点击此处查看该图的放大版本。

使用NFL、RBFOX3标记物的神经元发育阶段；显微镜图像、数据图表、神经突生长。
图3：长期培养的小鼠脊髓（SC）器官型切片。 （A）切片在体外培养中维持至第90天（DEV 90）。免疫荧光检测显示细胞骨架标记物神经丝轻链（NFL，绿色）和核内神经元标记物RBFOX3（红色）广泛分布，表明经过长期培养后切片仍保持良好的健康状态并具有明确的神经元特性。值得注意的是，随着时间推移，NFL+轴突从切片周围广泛出芽生长。细胞核用DAPI复染。比例尺 = 500 µm。（B）面板A所示切片中NFL+面积随时间变化以及RBFOX3+面积的代表性直方图。NFL+神经突面积随时间逐渐增加。缩写：DEV = 体外培养天数（day ex vivo）；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；NFL = 神经丝轻链；SC = 脊髓；RBFOX3 = RNA结合fox-1同源物3。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞凋亡分析；活化型半胱天冬酶3与DAPI染色；显微镜图像；神经元细胞；细胞凋亡定量
图4：随时间评估脊髓切片中细胞的存活率。 (A) 在DEV 60时对aCASP3（红色）和NFL（绿色）染色的器官型脑片代表性图像。比例尺 = 100 µm.NFL 呈弥漫性分布模式。极少细胞对凋亡标志物 aCASP3 呈阳性（插图：1-2-3）。(B) 不同时间点切片中凋亡率的分析。均值 ± 标准差，N（重复次数）= 6 个切片，n（总细胞数） > 每片1,000 Kruskal-Wallis 检验，多重比较，p 值 > 0.05。细胞凋亡率随时间保持稳定。在面板的插图1-2-3中 A可以观察到aCASP3阳性细胞的细节（红色染色，白色箭头所示）。微小的红色斑点标记细胞碎片和固缩核。比例尺 = 50 µm. (C在DEV 90天时对脊髓切片进行的活/死细胞染色代表性图像：代谢活跃的细胞通过Calcein标记呈绿色，而死亡和受损细胞通过Sytox标记呈浅蓝色（青色）。两个直方图分别显示Calcein阳性细胞（左侧）和Sytox阳性细胞（右侧）占总细胞数的百分比。数据以均值±标准差表示，N（重复样本数）= 6个切片，n（总细胞数） > 每片1,000 Kruskal-Wallis 检验，多重比较 DEV 30 与 DEV 60 的 p 值 = 0.018；DEV 30 与 DEV 90 的 p 值 = 0.027；DEV 60 与 DEV 90 的 p 值 > 0.99缩写：DEV = 天 离体；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；NFL = 神经丝轻链；SC = 脊髓；aCASP3 = 活化型半胱天冬酶-3。 请点击此处以查看此图的放大版本。

神经分化过程示意图及GFP慢病毒转导与成像结果
图5人SC-NES细胞移植至小鼠器官型脑片 (A) 移植方案的代表性示意图。细胞在分化第10天（DIV 10）以神经前体细胞形式移植至发育第4天（DEV 4）的器官型脑片中。B代表性图像显示了随时间推移至移植后第30天（DPT 30），将表达GFP的h-SC-NES细胞移植到小鼠器官型脑片中的情况。细胞通过携带相应基因的慢病毒载体进行转导 GFP 基因。随时间推移的GFP表达证实了它们的存活能力及其对脑片环境的适应性。比例尺 = 500 µm缩写：DIV = 前分化第一天；h-SC-NES = 人脊髓来源神经上皮干细胞；GFP = 绿色荧光蛋白；DEV = 天 离体；OM = 器官型培养基；GM = 移植培养基；DPT = 移植后天数 请点击此处以查看此图的放大版本。

神经元中aCASP3、Hu-Nu的荧光染色；aCASP3+细胞百分比的饼状图。
图6：移植后30天评估移植的h-SC-NES细胞的凋亡率。（A）移植表达GFP的h-SC-NES细胞的小鼠脑片代表性图像。通过携带GFP基因的慢病毒载体转导细胞，以便在移植后追踪其在脑片中的分布。随时间推移的GFP表达证实了这些细胞的存活能力及其对脑片环境的适应性。图中所示时间为移植后第30天（DPT 30）；细胞经人源细胞核（cyan）和aCASP3（红色）染色。比例尺 = 150 µm。（B）左侧为DPT 30时移植至脑片中的细胞凋亡分析代表性饼状图（N（重复数）= 5个脑片，n（细胞数）= 5,000），右侧为Hu-Nu+细胞的放大图及aCASP3阳性细胞的细节（白色箭头所示）。比例尺 = 75 µm。小的红色点代表细胞碎片和浓染核。缩写：h-SC-NES = 人脊髓来源的神经上皮干细胞；GFP = 绿色荧光蛋白；DPT = 移植后天数；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；NFL = 神经丝轻链；aCASP3 = 活化型caspase-3；Hu-Nu = 人源细胞核。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：本实验方案中所用溶液的组成。 请点击此处下载该表格。

讨论

目前尚无针对脊髓损伤（SCI）患者的有效治疗方法。已尝试多种治疗策略，其中最具前景的方法之一是基于再生策略的细胞替代疗法。当前，再生医学领域的进展亟需新型平台，以评估单独或联合其他方法的细胞移植的有效性和安全性。这些方法的临床前验证对于推进后续临床研究至关重要。脊髓器官型培养是一种有用的平台，可用于研究神经退行性变、神经再生和神经发育的各个方面，并评估新型治疗策略的有效性23。 特别是，器官型培养具有保持原有组织结构以及细胞和微环境组成等特定优势，有助于揭示细胞移植过程中的动态变化，如细胞植入、整合、分化和成熟。

与已发表的实验方案一致，脊髓（SC）器官型切片在健康条件下可在培养中维持约2-3周，这限制了其在细胞治疗测试方案所需的长期研究和功能筛选中的应用。要探索移植细胞在脊髓组织内向正确命运分化的关键过程（如分化与成熟），需要进行长期监测。这些细胞过程在动物模型的常规移植中至关重要。一种可长期维持脊髓组织活性的 离体 模拟多种现有特征的系统 体内 在临床前筛选阶段将具有帮助作用。

因此，在本研究中，我们提出了一种优化的长期（≥30天）脊髓（SC）器官型培养方法，可将活性脊髓组织切片的存活时间延长至90天，使其常规培养周期延长三倍。此外，我们展示了人源脊髓神经前体细胞（h-SC-NES细胞）在脊髓切片内的稳定移植，并实现了移植后培养体系长达30天的维持。我们通过监测绿色荧光蛋白（GFP）的表达随时间变化情况，评估了移植细胞的存活状态，证实其可存活至移植后第30天（DPT 30）。在移植后第30天（30 DPT），我们进一步评估了细胞的凋亡率。据文献报道，已有研究在移植后第7天（7 DPT）对h-SC-NES细胞在脊髓切片中的凋亡情况进行过评估。40在此，我们将细胞凋亡分析延伸至DPT 30，以比较相对于早期时间点（DPT 7）的凋亡率。我们发现，实验结果与已有文献一致，表明若维持本研究中优化的培养条件，移植的h-SC-NES细胞在较晚的时间点也能存活。这一改进显著提升了长期 离体 单独使用该平台以及在移植配置中使用该平台，将有助于研究人员对基于干细胞的脊髓损伤（SCI）移植进行临床前筛选。这将使他们能够鉴定出最适合进一步研究的细胞候选者 体内 促进移植成功的研究。此外，在初步筛选后，SC类器官切片还可与 体内 用于验证和佐证在动物模型中观察到的长期细胞动态与行为，或支持机制性研究。

本方案详细描述了如何建立这种长期的类器官模型，但也需讨论一些关键步骤。在脊髓类器官培养的制备过程中，手术操作及培养初期存在若干挑战。成功的手术操作对于获得能够维持原有组织结构的脊髓切片至关重要。若在分离过程中损伤脊髓，切片可能失去典型的解剖结构，组织损伤还可能引发过度的促炎反应，导致不良的培养状态和细胞死亡。手术过程中最具挑战性的环节是从脊柱中取出脊髓以及去除分离后脊髓表面的脑膜。这些步骤的成功与否很大程度上依赖于操作者的经验，因此建议在正式开展实验前进行一段时间的培训练习。

通过切片机对脊髓进行冠状面切片也是一项具有挑战性的步骤。分离出的脊髓应准确地垂直放置于切片台上，操作者也应将刀片垂直于切片台放置。这些注意事项对于确保在同一实验及不同实验间获得可重复的切片至关重要。另一个重要问题是手术时间有限：整个切片制备过程必须在约30分钟内完成。若操作者在手术和切片过程中耗时过长，脊髓组织将受到损伤，从而影响后续培养的成功率及实验的后续步骤。

一旦将脑片放置在培养膜上，正确喂养就非常重要。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对于维持组织的恢复和存活至关重要。使用切片机切割对组织具有创伤性，因此切片后应立即将其放入冰冻的解剖液中，以清除过量的促炎性和促死亡分子。随后，将脑片转移至含有新鲜培养基的培养膜（细胞培养插入物）上，培养基中需添加GDNF，以促进组织更快恢复并增强脑片与膜的贴附。由于GDNF半衰期较短，在培养的第一周内应每天向培养基中添加GDNF50,51。我们观察到，在培养初期，脑片需要持续存在GDNF，以促进组织恢复和维持活性。无论如何，由于在整个培养期间GDNF的存在均十分重要，因此强烈不建议在后续任何时间点中断GDNF的供给。

在培养的第一周内，通过肉眼和显微镜对脑片或脊髓片进行宏观检查也非常重要。组织呈半透明状态以及边缘清晰透明，是组织切片与膜良好黏附且细胞活性良好的表现。坏死组织在肉眼观察下最初呈现明显的白色，而在显微镜下坏死区域则呈现深灰色。经过数周培养后，组织形态可能发生改变：细胞迁移以及组织与膜的黏附均可能影响这一过程。例如，我们观察到部分被细胞填充的切片中央管腔消失，以及背角和腹角结构形态的丧失。这种情况主要出现在较小的切片中，而大多数切片仍能维持接近原始状态的解剖结构。通常选择来自腰段或胸段的组织制备切片，因为这些区域的切片具有合适的尺寸，能够长期维持其原有的组织架构：若切片过小，则容易丧失组织结构；若过大，则中央区域可能发生坏死。因此，我们采用幼鼠的腰段组织制备适合长期培养的切片，但原则上其他节段也可考虑使用。此外，我们选择腰段还因为其背侧与腹侧区域 彼此之间更易于区分。同时，该区域含有较高比例的运动神经元和灰质，是脊髓损伤（SCI）中细胞替代治疗 研究的关键靶区。 关于向切片中移植细胞，主要问题之一是玻璃微针尖端容易断裂。若用于细胞通过的孔径过大，可能在显微注射过程中对脊髓组织造成损伤；若孔径过小，则细胞堆积可能堵塞针头，阻碍移植过程的进行。移植操作应在1小时内完成，以最大程度减少细胞所受的损伤和死亡。

本方案为多种类型的研究提供了一种优化且通用的工具。在此，我们应用长期培养平台，验证将处于分化早期阶段的人脊髓神经上皮干细胞（h-SC-NES细胞）移植至小鼠脊髓组织切片中并维持30天的可行性。本方法的主要创新之处在于对共培养方案进行了优化。培养基（GM）能够维持脊髓组织切片及移植的h-SC-NES细胞的长期神经元存活。事实上，GM是一种无血清培养基，相较于先前用于器官型组织切片培养的培养基47，更有利于移植细胞向神经元命运的分化。

关于脊髓损伤（SCI）的拟议模型，实验通常在成年小鼠上进行。迄今为止，新生小鼠与成年小鼠脊髓之间最重要的差异在于，新生小鼠相较于成年小鼠具有更高的再生潜能52然而，这些差异对我们所提出的实验方案类型并无影响，因为本研究关注的是移植细胞对宿主组织微环境的响应，而非内源性神经元的再生能力。新生小鼠与成年小鼠在损伤后另一差异在于 脊髓损伤（SCI）与成年后胶质瘢痕的形成相关。然而，所提出的模型未考虑这一方面，也未涵盖由原发性和继发性损伤引起的复杂病理生理过程。

在应用方面，该平台还可用于研究移植细胞与脊髓（SC）器官型模型中固有神经环路之间的整合情况。遗传工程工具此前已在中枢神经系统（CNS）中用于评估突触连接性，在此方面亦可加以利用53,54,55。特别是可通过评估移植细胞与脊髓ex vivo组织之间突触的形成，来研究并验证其整合效果。 这些长期维持的器官型培养体系还可用于测试神经保护剂、神经再生剂、新型分子或材料，或用于研究涉及脊髓的神经退行性疾病。为研究特定的神经退行性疾病，需对本方案进行调整，以适应来自相关模型（例如携带特定病理相关突变的转基因小鼠）在相应病理阶段（即新生期、幼年期或成年期）所获取的脊髓切片的培养。总之，本研究方案以及广义上的器官型培养体系，作为特定器官的离体组织外植体，兼具二维细胞培养与in vivo模型之间的优势，证实其在基础研究和临床前测试中均具有不可替代的价值。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由 Wings for Life 基金会（WFL-IT- 20/21）、欧盟下一代欧盟-国家复苏与韧性计划（NRRP）任务4 组件2、投资编号 1.4-CUP 编号 B83C22003930001（托斯卡纳健康生态系统-THE，Spoke 8）以及 Marina Romoli Onlus 提供资助。本稿件仅反映作者的观点和意见，欧盟或欧洲委员会均不对此承担责任。数据和元数据可在 Zenodo 上获取 10.5281/zenodo.10433147. 图像使用 Biorender 生成 https://www.biorender.com/。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗裂解型 Caspase-3，  (Asp175) (5A1E) (兔源)Cell Signaling Technology9661S1:400
抗 GFP 抗体（小鼠源）- 单克隆Sigma/MerckG65391:400
抗人核抗体（小鼠源）- 单克隆，克隆号 235-1 Sigma/MerckMAB12811:400
抗人核抗体（兔源）NeoBiotechnologiesRBM5-346-P11:400
抗 NeuN (RBFOX3) 抗体（兔源）- 多克隆Sigma/MerckABN781:400
抗 NFL 抗体（小鼠源）Sigma/MerckMAB16151:400
抗 NFL 磷酸化抗体（兔源）- 多克隆Biologend8408011:500
Aqua PolymountPoly-sciences18606-20
B-27Gibco17504-044
BDNFGibcoPHC7074
刀片Leica118364227
细胞培养级水Sigma/MerckW3500-500ML
大鼠尾胶原蛋白Sigma/MerckC7661
共聚焦显微镜 - A1 共聚焦显微镜（Eclipse Ti）Nikon 
D(+)-葡萄糖Sigma/MerckG7021
解剖镊World Precision Instruments15915
DMEM/F12Gibco31330
DPBSSigma/MerckD8537
EGFSigma/Merckgf144
FBSGibco10270-106
FGF-2Stemgent03-0002
GDNFSigma/MerckSRP3200
玻璃毛细管，3.5" Drummond Scientific Company3-000-203-G/X
GlutamaxGibco35050-038
山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11029
山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA212361:500
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA110111:500
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA212441:500
Graph Pad-PrismDotmatics统计分析软件
HBSSGibco14025-0501:500
HEPESGibco15630-056
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
马血清Gibco16050-122
胰岛素Sigma/MerckI9278
层粘连蛋白Sigma/MerckL2020
慢病毒制备物Addgene17446-LV
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030024
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒Thermo Fisher ScientificL32250
McIlwain 组织切片机World Precision Instruments
MEMGibco11090-081
微量移液器加样头（Microloader tips）Eppendorf5242956003用于将细胞装入移植针头
显微镜载玻片VWR631-0909
Millicell 细胞培养膜Sigma/MerckPICM0RG50
显微镜盖玻片VWR ECN 631-1572
N-2Gibco17502-048
NeurobasalGibco21103-049
青霉素/链霉素Thermo Fisher Scientific15140122
培养皿（35 mm）VWR734-2317
多聚甲醛（PFA）Sigma/MerckP6148-500G
塑料巴斯德吸管Sarstedt86.1171.010
气动 PicoPumpWorld Precision InstrumentsPV830用于移植的微量注射器
聚-L-赖氨酸Sigma/MerckP4707
10 号无菌不锈钢手术刀片VWR InternationalSWAN3001
3 号手术刀柄World Precision Instruments500236
弹簧剪刀World Precision Instruments501235
用于成像和图像采集的体视显微镜Nikon SMZ18
用于手术的体视显微镜VWR
吐温 X-100（Triton X-100）MerckT8787
镊子-Dumont #5-不锈钢World Precision Instruments501985
Vannas 剪刀，8.5 cmWorld Precision Instruments500086
垂直微量移液器拉制仪Shutter InstrumentP-30
Y-27632R&D Systems1254/50

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神经干细胞离体平台细胞替代治疗长期培养组织整合功能恢复
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