在此，我们介绍一种结合了 体内 颅顶耳长肌（LAL）的电穿孔与去神经支配。该操作可用于研究肌肉来源蛋白在神经肌肉突触再生中的潜在作用。
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本文内容
摘要
摘要
神经肌肉接头（NMJ）是控制骨骼肌纤维收缩的外周突触，使多种生物能够实现协调运动。在NMJ处，突触前运动神经元轴突末梢与肌肉的突触后区域相接触，并被终末施万细胞所覆盖。在多种情况下，如衰老、神经肌肉疾病以及创伤性损伤，NMJ的完整性和功能会受到损害。为了分析肌肉来源蛋白在NMJ维持与再生中的潜在作用，已将一种体内基因转导策略与机械性神经损伤后颅顶耳前长肌（LAL）的去神经支配相结合。先前的研究结果表明，强制表达对照荧光蛋白不会改变NMJ的结构或神经传递功能。本实验旨在详细描述一种对LAL肌肉进行体内电穿孔的方法，随后切断或压榨支配颅部肌肉的面神经特定分支，从而分别导致NMJ的去神经支配和再神经支配。在便于操作的LAL肌肉中结合使用这些实验策略，构成了一种高效的方法，可用于研究肌肉蛋白过表达或沉默在短期NMJ再神经支配过程中的潜在作用。
引言
神经肌肉接头（NMJ）是控制肌肉收缩并间接调控生物体协调运动的外周突触1。它由突触前运动神经元轴突末梢、富含乙酰胆碱受体（AChRs）的肌肉突触后区，以及覆盖轴突末梢的非髓鞘化终末施万细胞共同构成2,3,4。当因外周神经创伤性损伤、疾病或药物干预导致NMJ失神经支配时，肌肉的收缩活动将丧失5,6。由于某些允许性微环境可促进及时且有效的功能恢复，因此寻找能够促进再生过程的蛋白质始终是一项迫切需求。本文结合了两种实验方法，旨在特异性评估在神经损伤后短期内调控肌肉蛋白表达对NMJ再生潜力的作用。
位于颅骨背侧表面的耳前肌（LAL）是一块薄而扁平的肌肉，负责控制耳廓的运动。LAL肌肉由头侧带和尾侧带组成，每条带包含两到三层肌纤维7,8面神经的耳后支支配LAL肌，形成一种已有明确描述的支配模式，包括五个头侧支配区（R1-R5）和两个尾侧支配区（C1-C2）。8,9,10。LAL 是一种位置表浅且易于接触的肌肉，因此其使用仅需微创操作。这使得能够利用实时显微镜观察神经肌肉接头（NMJ），并进行药物递送以及对完整肌肉标本的干预 体内 和 离体11,12这些特征使LAL肌肉成为研究神经肌肉接头（NMJ）行为与功能的理想模型10,13.
体内电穿孔是一种基因转移技术，可通过施加电场后短暂增加细胞膜通透性并促进DNA在细胞内的移动，从而将外源DNA导入组织中14,15。该操作具有局部性，可在动物发育的任何阶段进行。鉴于LAL肌肉的独特特性，对其实施体内电穿孔是一种微创、高效且快速的方法16，电穿孔后两到三天即可观察到强烈的蛋白表达。
面神经挤压手术在研究中被广泛应用，因其具有多种优势5,17,18。该方案此前已被改进，可特异性地针对支配头颅肌肉（包括LAL肌）的面神经耳后支，从而避免面瘫；因此，小鼠在术后无需特殊护理（例如因眨眼反射丧失而需使用眼部润滑药膏）。由于LAL肌的神经肌肉接头再支配在损伤后7至9天开始6，与常用的坐骨神经挤压损伤模型（用于去神经支配后肢肌肉，其再支配过程约在神经损伤后三周发生）18相比，是一种理想的短期再支配模型。
组合 体内 电穿孔结合LAL肌肉的面神经损伤将使研究人员能够评估在神经肌肉接头再生的不同阶段（包括短期和长期形态学效应）中，突触组分对肌肉来源蛋白调控的行为变化6,16通过多种技术，包括免疫组织化学、组织学和功能检测。
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方案
所有实验程序均经智利 Austral 大学生物伦理委员会批准（方案编号 503/2023），并遵循智利国家研究与开发署（ANID）生物伦理委员会所规定的要求，以及欧洲理事会关于实验动物护理的指导方针。本研究使用成年（3-6 月龄）CF-1 小鼠，雌雄均有（体重 30-45 g）。安乐死采用吸入性麻醉剂过量后放血的方法实施。研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 在体 LAL 肌肉电穿孔
- 准备
- 在符合机构批准的方案下，将小鼠置于亚克力诱导室中，吸入含2.5%异氟烷和0.8 L/min氧气的混合气体，使其轻度镇静。随后，在解剖体视显微镜下，通过连接吸入麻醉机的鼻罩维持小鼠的镇静状态。
注意：在开始操作前需确认小鼠已进入睡眠状态；可用镊子轻轻夹捏小鼠一只脚趾以测试其触觉反射（每次麻醉诱导后均需执行此步骤）。 - 使用2%葡萄糖酸氯己定对颅骨矢状缝水平的颈部区域进行消毒，并用Hamilton注射器在皮下注射20 µL含2 mg/mL透明质酸酶的PBS溶液，以促进质粒DNA进入肌肉表面。
- 关闭异氟烷气流，让小鼠吸入纯氧1分钟。
- 称量 小鼠体重，以计算合适的美洛昔康 剂量（参见步骤1.3.2）。
- 将动物放置于无垫料的空笼中，使其从麻醉状态中恢复。
- 30分钟后将动物恢复至 常规饲养环境16。
- 在符合机构批准的方案下，将小鼠置于亚克力诱导室中，吸入含2.5%异氟烷和0.8 L/min氧气的混合气体，使其轻度镇静。随后，在解剖体视显微镜下，通过连接吸入麻醉机的鼻罩维持小鼠的镇静状态。
- 手术操作
- 按照机构批准的方案，通过吸入2.5%异氟烷与0.8 L/min氧气的混合气体重新麻醉小鼠，并在整个手术过程中使用吸入麻醉机维持镇静状态，操作在解剖体视显微镜下进行。
- 使用双面剃刀片剃除颈部区域毛发，并用氯己定和70%乙醇重复消毒三次。
- 沿颅骨矢状缝做一条8 mm长的切口，用剪刀或镊子轻轻去除皮下脂肪和结缔组织，暴露LAL肌。
注意：皮肤切开后，LAL肌是颅部最表层的肌肉。其肌纤维走向从颅骨中线斜向耳廓方向，易于辨认8,16。 - 使用Hamilton注射器将10 µL commercially obtained DNA（0.8–1 µg/µL）溶于PBS中，注射至分布于肌肉表面的筋膜内，形成可见的隆起泡状结构。
- 将两根金针电极平行插入，间距5 mm，置于肌纤维上方，覆盖整个LAL肌长度（图1A）。
- 使用电穿孔仪施加5次脉冲，每次100 V/cm，持续20 ms，频率为1 Hz。
- 在对侧LAL肌重复相同操作（重复步骤1.2.4–1.2.6）。
- 缝合与恢复
- 使用可吸收性聚乙醇酸缝线（5/0线径，HR15针）缝合皮肤。
- 皮下注射镇痛药美洛昔康，剂量为1–2 mg/kg体重，以减轻术后疼痛。
- 关闭异氟烷气流，让小鼠吸入纯氧1分钟。
- 将动物置于无垫料的空笼中，使其从麻醉中恢复。
- 术后将动物放回常规饲养环境，并持续监测2天或直至完全恢复。观察疼痛或应激迹象，根据先前描述的人道终点标准对各项参数进行评分19。
注意：手术期间应将小鼠置于覆盖手术垫的加热板上，防止体温下降。手术操作时间应控制在30分钟以内，避免因麻醉过量导致死亡。若目标蛋白表达的荧光信号较弱，建议以1:5的比例共电穿孔一种示踪蛋白（如tdTomato或GFP）（示踪物:目标DNA）。
2. 压迫性神经损伤诱导的去神经支配
注意：本方案是对先前所述方案的一种修改17。该操作应与电穿孔操作相隔至少3天进行。根据具体的研究问题，该操作可在电穿孔之前或之后执行。
- 麻醉与动物体位
- 在丙烯酸诱导室中，通过吸入2.5%异氟烷（氧气流速0.8 L/min）对动物进行镇静（遵循机构批准的实验方案）。
- 称量小鼠体重以计算美洛昔康 剂量（见步骤2.3.2）。
- 在解剖立体显微镜下，使用连接至吸入麻醉机的鼻罩维持小鼠镇静状态。
- 将小鼠置于左侧体位（以去神经支配右侧LAL肌肉）。用胶带将右耳向鼻部方向固定，以暴露耳廓后部区域。
- 手术操作
- 使用双刃剃须刀片剃除耳廓后部的毛发，并用氯己定和70%乙醇消毒3次。
- 定位耳后静脉，在其尾侧约2 mm处，使用弹簧剪刀做一条长约5 mm的皮肤切口。避免损伤血管和/或肌肉组织。
- 使用镊子和剪刀剪除脂肪及结缔组织。找到副神经（脊髓副神经）；继续分离直至暴露二腹肌肌腹及耳软骨性外耳道（半透明的浅白色组织）（图2A）。
- 定位面神经在二腹肌下方的起始分支处。
- 追踪面神经的耳后支（面神经最背侧的分支），并轻柔地去除其周围结缔组织，注意避免直接接触神经。
- 使用尖端呈45°角的镊子，对面神经耳后支施加恒定压力，夹压30秒以实现神经损伤。
- 缝合与恢复
- 使用可吸收性聚乙醇酸缝线（5/0线径，HR15针）进行皮肤缝合。
- 皮下注射镇痛药美洛昔康，剂量为1–2 mg/kg体重，以减轻术后疼痛。
- 移除耳部胶带，关闭异氟烷气流，让小鼠吸入纯氧1分钟。
- 将动物置于空笼（无垫料）中，使其从麻醉中恢复。
- 恢复后将小鼠放回常规饲养笼，并在术后监测2天或直至完全恢复。
- 恢复后，观察小鼠患耳运动是否出现障碍，作为去神经支配有效的标志。
注：对于假手术对照动物，仅做皮肤切口，暴露面神经但不直接触碰，随后进行缝合。
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结果
tdTomato蛋白的高荧光量子产率20 使其成为评估电穿孔效率的合适示踪剂。因此，通过LAL肌肉中tdTomato蛋白的表达 体内 电穿孔被评估（图1。电穿孔后21天解剖分离LAL肌肉。整体装片显示LAL肌肉的细长尾侧带（cLAL，青色多边形）及其两个神经支配区域，以及较粗的头侧带（rLAL，黄色多边形）及其五个神经支配区域8,10 (图1B）。根据DNA注射部位及电极的位置，有较高比例的肌纤维（特别是来自rLAL区域）呈tdTomato表达阳性（图1B。横向冷冻切片按所述方法进行16 评估该操作步骤的效率（图1C定量结果显示，tdTomato 表达的阳性纤维占 66.7...
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讨论
组合 体内 肌肉电穿孔与去神经支配是研究神经肌肉接头再生微环境的一种有价值的实验方法4由于LAL肌位于浅层，这些联合操作可轻松结合探针或药物递送，以影响蛋白质的表达或活性12此外，将报告基因电转染至LAL肌肉可为研究神经损伤和/或神经肌肉接头再生过程中信号通路的激活或抑制提供一种有价值的工具。
两种操作均快速、高度可重复，并可通过可识别的标记轻松辨别，尤其在仔细重复某些实验细节时更为明显。例如，对面神经特定的耳后支进行准确的神经损伤，依赖于识别上述解剖标志。我们还发现，神经挤压损伤的可重复性取决于挤压时间的精确性，本方案中为30秒，因为神经挤压时间的微小变化都可能改变再支配模式和功能恢复进程。同样，为实现LAL肌肉的高效电穿孔，必须观察到质粒溶液在LAL肌筋膜下形成的气泡，并正确放置电极，以实现细胞膜的瞬时通透化及DNA向肌纤维内部的迁移。值得注意的是，NMJ去神经支配的成功可轻易通过耳廓运动的缺失来判断，而电穿孔效率则可通过观察 体内 使用荧光显微...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 NeSt 实验室成员提供的高度协作且富有启发性的工作环境，以及对本研究提出的有益讨论和意见。NeSt 实验室的工作目前由 FONDECYT 1221213 项目资助。图1A 中的示意图使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #5/45 Dumont 镊子 | Fine Science Tools | 11251-35 | 使用前需灭菌 |
| anti 2H3 | DSHB | 稀释比例 1 : 300 | |
| anti S100 即用型 | Dako | IR504 | 稀释比例 1 : 5 |
| anti SV2 | DSHB | 稀释比例 1 : 50 | |
| 2% 葡萄糖酸氯己定 | DifenPharma | ||
| 冷光源解剖体视显微镜 | Motic | 型号 SMZ-171 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 稀释比例 1 : 100 |
| Dumont #5SF 镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | 使用前需灭菌 |
| Dumont 微型镊子 –5 型 | Fine Science Tools | 11200-14 | 使用前需灭菌 |
| ECM 830 电穿孔仪 | BTX Harvard Apparatus | ||
| 金针型电极 | Genetrodes, BTX | 45-0114 | 直型，10 mm |
| Hamilton 注射器 | Hamilton | 80400 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| 吸入式麻醉机 | SciVerma Scientific | M3000 台式型号 | |
| 异氟烷 | Baxter | 218-082 | |
| 小鼠 | Instituto de Salud Publica - Chile | 成年（3–6 月龄）CF-1 小鼠，两性均有（30–45 g） | |
| 剃须刀片 | Schick | ||
| 5/0 号 Glicosorb 缝合线 | TAGUM | GS0812.J | 可吸收聚乙醇酸缝线 |
| tdTomato 质粒 | Addgene | 54642 | 由 CMV 启动子驱动的 tdTomato 质粒 |
| 5% 盐酸曲马多（Triamcol） | Drag Pharma | ||
| Vannas 弹簧剪 | Fine Science Tools | 91500-09 | 使用前需灭菌 |
| WGA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | W7024 | 稀释 |
| α-BTX Alexa Fluor 488 | Invitrogen | B13422 | 稀释比例 1 : 500 |
参考文献
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