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方法文章

光片成像揭示啮齿类动物心脏结构

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DOI：

10.3791/66707

⸱

2024年3月29日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Center for Imaging and Surgical Innovation, The University of Texas at Dallas, 3Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, UT Southwestern Medical Center

本文内容

摘要

该方案利用先进的光片显微镜技术，结合改良的组织透明化方法，用于研究啮齿类动物心脏中复杂的结构，在理解心脏形态发生及重塑过程方面具有重要意义。

摘要

光片显微镜（LSM）在理解心脏复杂的三维（3D）结构方面发挥着关键作用，为基本的心脏生理学和病理反应提供了重要见解。本文深入探讨LSM技术的开发与应用，以阐明小鼠模型中心脏的微细结构。该方法结合了定制的LSM系统与组织透明化技术，有效减少心脏组织内的光散射，实现大体积成像。通过将传统LSM与图像拼接及多视角去卷积方法相结合，可完整捕获整个心脏的图像。为解决轴向分辨率与视场（FOV）之间固有的权衡问题，我们进一步引入轴向扫描光片显微镜（ASLM）方法，以最小化离焦光的影响，并在传播方向上实现对心脏的均匀照明。同时，诸如iDISCO等组织透明化方法可增强光的穿透深度，有助于深层结构的可视化，确保对整个心脏心肌组织进行全面观察。所提出的LSM技术与组织透明化方法的结合，为研究人员解析啮齿类动物心脏结构提供了一个极具前景的平台，在理解心脏形态发生与重塑方面具有重要意义。

引言

心力衰竭仍然是全球死亡的首要原因，主要由于成熟心肌细胞缺乏再生能力1。心脏复杂的结构对其功能至关重要，并为理解心脏发育过程提供了线索。深入理解心脏结构对于阐明心脏形态发生的基本机制以及心肌梗死后心脏重塑过程具有重要意义。近期研究进展表明，新生小鼠在心脏损伤后能够恢复心脏功能，而成年小鼠则缺乏这种再生能力2。这一差异为研究小鼠模型中与结构和功能异常相关的信号通路奠定了基础。传统的成像方法（如共聚焦显微镜）存在技术局限性，包括穿透深度有限、点扫描速度慢以及长时间激光照射导致的光毒性损伤，这些因素限制了对完整心脏进行三维（3D）成像的全面性。在此背景下，光片显微镜（LSM）成为一种强有力的解决方案，具有成像速度快、光损伤小以及卓越的光学切片能力等优势3,4,5。LSM 的独特特性使其成为克服传统技术局限性的有前景方法，为研究心脏发育和重塑过程提供了前所未有的视角6,7,8。

在本实验方案中，我们介绍了一种成像策略，该策略结合了先进的激光扫描显微镜（LSM）与优化的组织透明化方法9，能够在无需特异性标记和机械切片的情况下实现对完整小鼠心脏的成像。我们进一步提出，传统的LSM成像可通过多视角去卷积10或轴向扫描光片显微镜（ASLM）技术11,12,13,14,15进行增强，以提高轴向分辨率。此外，将图像拼接技术与上述任一方法结合，可有效克服空间分辨率与视场（FOV）之间的权衡问题，从而推动成年小鼠心脏的成像研究。通过整合多种组织透明化方法，包括疏水性、亲水性以及基于水凝胶的方法，可实现更深的光穿透，用于获取完整心脏的形态学信息16,17,18,19。

尽管多种透明化方法均可与现有的激光扫描显微系统（LSM）兼容，但其目标是通过用折射率与组织相近的介质替代脂质，从而最大限度地减少光子散射并增强光在组织（如心脏）中的穿透能力。本方案选择iDISCO作为代表性方法20,21，并针对自发荧光成像进行了优化，因其处理速度快且透明效果高（图1A）。综上所述，将先进的LSM技术与组织透明化方法相结合，为解析啮齿类动物心脏复杂的解剖结构提供了一个极具前景的框架，在深化我们对心脏形态发生及病理机制的理解方面具有重要意义。

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方案

动物实验方案和操作已获得德克萨斯大学达拉斯分校机构动物照护与使用委员会（IACUC #21-03）的批准，并在其监督下进行。本研究使用了C57BL6小鼠，包括出生后第1天（P1）的新生鼠和8周龄的成年鼠。未观察到雄性和雌性之间存在差异。所有数据采集和图像后期处理均使用具有科研或教育许可的开源软件或平台完成。相关资源可在合理请求下向作者获取。

1. 样本制备与组织透明化（6 - 10 天）

  1. 在开始组织透明化实验前，先配制 材料表 中列出的组织透明化方法所需的所有化学溶液。
    注意：所有操作均应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备，尤其是在处理有毒化学品时。
  2. 在预定时间点（如出生后第1天和8周龄）将动物放入 CO2 室内，使用 CO2 实施安乐死，完整取出心脏，并将新鲜分离的心脏在室温（RT）下浸入 0.2 M KCl 溶液中，使其停搏于舒张状态16。
  3. 将心脏浸入含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中，在摇床上轻轻振荡，4 °C 下过夜固定，以保存心脏解剖结构，参见 表1。
    警告：PFA 为有毒化学品，操作必须在通风橱内进行。
  4. 在室温下用 1× PBS 洗涤心脏，每次 30 分钟，共洗涤 3 次。
    注意：可选步骤：如步骤 2 所述，可将心脏包埋于琼脂糖凝胶中，以构建适用于定制共聚焦显微镜系统（LSM）的心脏组件。
    1. 通过将琼脂糖溶解于 PBS 中制备 1% 琼脂糖溶液，并在微波炉中加热至完全溶解。将溶液倒入模具中形成底层，待溶液冷却至 40 °C。
    2. 将心脏放入模具中，并用琼脂糖凝胶填充模具直至凝固。去除琼脂糖凝胶中的所有气泡，以尽量减少成像伪影。
      注意：包埋样本可降低在安装过程中对心脏结构造成潜在损伤的风险。
      警告：应使用低熔点琼脂糖，避免将心脏直接放入加热的琼脂糖中，以降低样本暴露于高温的风险。
  5. 使用甲醇与去离子水配制的梯度溶液对心脏进行脱水（图1B），按照 表1 所列顺序依次经过 20%、40%、60%、80% 和 100% 的甲醇溶液。更换新鲜的 100% 甲醇再处理一次，以确保完全脱水。对新生小鼠心脏，在每种甲醇溶液中振荡孵育 1 小时。对于 8 周龄小鼠心脏和大鼠心脏，孵育时间应调整为 2 小时。
    警告：甲醇为易挥发、刺激性且易燃的化学品。
  6. 更换溶液，将心脏在 4 °C 下用新鲜的 100% 甲醇处理 10 分钟。
  7. 更换溶液，使用体积比为 1:5（30% H2O2 与 100% 甲醇）的 5% 过氧化氢（H2O2）甲醇溶液，在 4 °C 下避光过夜孵育，以去除色素。
    注意：去除色素有助于减少光子吸收，从而提高图像质量并减少伪影。
  8. 更换溶液，将心脏在室温下用 100% 甲醇孵育 1 小时。
  9. 使用含 66% 二氯甲烷（DCM）和 33% 甲醇的溶液对心脏进行脱脂处理，振荡孵育 3 小时。确保在此步骤结束时心脏沉入管底。若未下沉，应更换新溶液（66% DCM / 33% 甲醇）并延长孵育时间（例如再延长 1 小时），以实现完全脱脂。转移心脏时应迅速更换至新鲜溶液，以防止干燥，因为 DCM 极易挥发。
    警告：实验中应使用聚丙烯或玻璃器皿，因 DCM 与聚苯乙烯不相容。
  10. 使用二苄基醚（DBE）进行折射率匹配（RI = 1.56）。新生小鼠心脏需在轻微振荡条件下处理 2 天，8 周龄小鼠心脏则需 5 天。更换为新鲜 DBE 溶液，并延长孵育时间，直至心脏完全透明。
    警告：DBE 具有危害性，避免与皮肤接触。

2. 样品安装（1天）

注意：如果使用商用激光扫描显微镜（LSM）系统，请遵循厂商提供的特定方案进行心脏固定，并跳过步骤 2.1 - 2.9。

  1. 使用3D打印机和Onyx材料定制一个耐折射率匹配溶液（例如在改良的iDISCO方法中使用的DBE）的腔室和支架（图2A）16。
  2. 在腔室底部固定一个磁铁，以便在激光扫描显微镜（LSM）系统下实现快速连接和精确定位（图2B）。
  3. 使用透明硅胶将25 mm × 50 mm × 0.17 mm的盖玻片粘接到腔室上，并通过向腔室内注入DBE并静置1天后检查是否泄漏，验证腔室的防水完整性。
  4. 使用3D打印机定制一个夹具支架，并安装磁铁，用于将心脏组件固定在腔室内（图2C）；或通过将针插入琼脂糖凝胶中来固定心脏组件。
  5. 按照先前报道的方法16,22，使用柱面透镜和连续波二极管泵浦固体（DPSS）激光器构建自主开发的LSM系统。采用532 nm激发波长采集心肌组织的自发荧光信号（图2D）。
  6. 将腔室安装在六维平台上，并调整至最佳位置，使腔室方向垂直于激光传播方向。
  7. 使用磁性夹具支架将样品置于腔室中央，并将支架连接至四维电动平台（X、Y、Z和偏航方向；图2D）。
  8. 通过电动平台将心脏组件浸入充满DBE的腔室中，并确定沿检测轴（Z方向）的扫描范围。
  9. 根据图像的步长（S）和采集时间（T），利用以下公式计算电机在Z方向的扫描速度（Vz）：
    速度计算公式，Vz=S/T，方程。
    注意：步长与成像系统轴向分辨率之间的关系需符合奈奎斯特-香农采样定理。例如，根据先前报道16，轴向分辨率为2.91 µm时，步长设定为1 µm。
  10. 为验证空间分辨率并最小化不同深度下可能存在的浑浊问题，通过成像直径为0.53 µm的荧光微球（稀释于1%低熔点琼脂糖凝胶中，浓度为1:1.5 × 105）测量系统的点扩散函数（PSF）。通过测量半高全宽（FWHM）16，计算整个样品范围内的PSF。

3. 图像拼接（4-8 小时）

  1. 根据有限的视场（FOV）计算覆盖整个小鼠心脏所需的图块数量。每个图块的尺寸对应于激光扫描显微镜（LSM）系统的视场。例如，横截面尺寸为 3 × 3.6 mm2 的新生小鼠心脏在定制的 LSM 中需要 2 × 2 个图块进行覆盖（图 3A）。相比之下，尺寸为 5 × 8 mm2 的 8 周龄小鼠心脏则需要 3 × 4 个图块以覆盖整个心脏结构（图 3B）。
    注意：若传统 LSM 的视场不足以成像整个心脏，则需要进行图像拼接。
  2. 从第 1 个图块开始，即心脏的左上角图块，采集心脏图像（图 3A-B）。
  3. 依次采集其余图块的图像，相邻图块之间保持 10% 的重叠区域，直至覆盖整个心脏，如 图 3C 所示。
  4. 下载并安装开源软件 Fiji23。下载并安装 Fiji 插件 BigStitcher24。
  5. 进入 Help 菜单，选择 Update，点击 Manage update site，并勾选 BigStitcher。随后点击 Close，再点击 Apply changes。完成插件下载后，重启 Fiji 软件。
  6. 打开 BigStitcher 插件，并通过图像文件目录导入所有必要的图块。将数据集保存为 HDF5 文件。
  7. 选择 Move Tile By Regular Grid 对图块进行排列，选择用于移动心脏的图块排列模式，并设置各图块之间 10% 的重叠区域。使用“Stitching Wizard”选项对图块进行拼接。
  8. 使用 Image Fusion 导出拼接后的数据，生成 tiff 文件。

4. 多视角去卷积（5 天）

  1. 利用荧光微珠进行心脏多视角重建的图像配准（图 3D）。
    1. 通过按体积比 4:1:1 混合双酚A二缩水甘油醚（D.E.R. 332）、异佛尔酮二胺、5-氨基-1,3,3-三甲基环己烷甲胺（IPDA）和聚丙二醇二缩水甘油醚（D.E.R 736）来制备树脂25。
    2. 将 10 µL 荧光微珠在 161 x g 条件下离心 5 分钟，并加入 20 µL 甲醇以替换微珠的保存液。重复此步骤 3 次。
    3. 将甲醇中的微珠溶液与步骤 4.1.1 制备的树脂混合，配制成总体积为 10 mL、微珠浓度为 1:1 x 105 的溶液。
    4. 将溶液置于真空室中脱气 3 小时，以去除气泡和空气 pockets。
    5. 将溶液倒入硅胶模具或塑料吸管中，静置 2 至 3 天直至完全固化。在树脂固化前约 1 天，将玻璃管插入模具中，等待其与树脂结合。随后将附着有玻璃管的树脂从模具中取出（图 3D）。
    6. 将心脏放入玻璃管中，用 DBE 填充，并将玻璃管安装在盛满 DBE 的成像腔室中。
  2. 通过沿检测轴（Z 轴）扫描心脏组件，获取来自照明区域的心脏及微珠的连续图像（图 3E-F）。
    注意：若心脏尺寸超过视场（FOV），请在步骤 3 中实施图像拼接，以生成单独的图像堆栈。
  3. 将小鼠心脏沿 Y 轴旋转 60°，从多个角度采集后续图像堆栈，即 0°、60°、120°、180°、240° 和 300°（图 3E-F）。
  4. 打开 BigStitcher 插件，通过图像文件目录导入所有图像，并将数据集保存为 HDF5 文件。
  5. 选择检测兴趣点，并手动选取用于配准的感兴趣微珠。
  6. 选择仿射变换模型进行配准。选择点扩散函数，并将 PSF 分配至所有视角。
  7. 点击多视角去卷积，选择迭代类型为高效贝叶斯。设定迭代次数为 10，并执行该操作26。
  8. 点击图像融合以导出 tiff 文件。
    注意：有关多视角去卷积的更多详细信息，可参考其他研究报告或实验方案24,27,28。

5. 轴向扫描光片系统硬件（1 天）

  1. 在柱面透镜（CL）的傅里叶平面安装电动可调透镜（ETL）27（图2D），以实现激光束的轴向扫描14。确保ETL中的液体界面保持水平，以避免重力引起的波前畸变。精确对准ETL，以最小化光束偏心和高阶光学像差30。
  2. 在工作站中安装数据采集卡（DAQ卡），并将BNC电缆连接至DAQ卡，以同步相机曝光与ETL扫描。
  3. 打开ETL驱动器外壳并移除盖板（图4）。
  4. 将BNC电缆的信号线焊接到PCB板底部标示为“Analog in B”的引脚上（图4）。
  5. 将BNC电缆的接地线焊接到GND引脚；随后将BNC电缆的另一端连接至DAQ卡的AO（模拟输出）端口（图4）。
  6. 将ETL驱动器插入工作站的USB端口，使用Hirose电缆将驱动器与ETL连接，并安装透镜驱动控制器软件。
  7. 在透镜驱动控制器软件中，将操作模式更改为“Analog”，以便通过DAQ卡生成的触发信号控制ETL。
  8. 在sCMOS相机的软件中，将采集模式切换为“External（Light-sheet）”。确保有源像素扫描方向与激光扫描方向垂直，以辅助同步。
  9. 使用BNC电缆将sCMOS相机背面的外部触发端口连接至DAQ卡的AO端口（图4）。

6. 轴向扫描光片系统的同步（7 天）

  1. 根据可接受的信噪比（SBR）确定曝光时间，本研究建议的SBR至少为10。若SBR低于10，则增加曝光时间。
    注意：在本项目中，曝光时间在10至50毫秒范围内可提供可接受的信背比（SBR）。
  2. 定义图像的采集时间（T）以及行间距（L）根据曝光时间（E）用于相机和ETL频率（f）使用以下公式：
    周期公式 T=1/2f；描述数学关系；教育性公式解释。
    静态平衡；公式 L=(T−E)/P；简洁方程；用于教学。
    何处 P 表示相机传感器上的像素列数。参考的代表性参数为 f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 毫秒，且 L = 243 µs分别。
  3. 在 LabVIEW 程序 Trigger Generator.vi 中，生成用于同步的方波和三角波触发信号图5).
    注意：定制的 LabVIEW 程序可应合理要求向作者索取。
  4. 将稀释的荧光微球加入1%低熔点琼脂糖凝胶中16 浓度为1:1 × 103 以确定图像中光束腰的位置（图6A).
  5. 在程序中，通过改变扫描方向上的电压来确定视场内激光束的起始点和终止点。
  6. 为了同步sCMOS相机与ETL，沿X轴扫描激光束，并沿Y轴激活像素以生成二维图像（图6B图像中对角线上更亮且更清晰的光点表明 sCMOS 与 ETL 之间实现了精确同步。
    注意：ETL 扫描速度与 sCMOS 像素激活的同步对图像质量至关重要。各种常见的异步误差总结于 图6C- F.
  7. 在确定最佳同步参数后，旋转 sCMOS 相机 90° 绕Z轴旋转，使活性像素方向与激光扫描方向对齐。
  8. 重复步骤 2.10，测量点扩散函数（PSF）的半高全宽（FWHM）。采用与之前报告中所述相同的方法16，ASLM 的平均横向和轴向分辨率分别为 2.18 µm 和 2.88 µm，分别（图7).
    注意：在理想条件下，整个视场（FOV）内的均匀照明和分辨率是可行的（图7A-B）。ETL与sCMOS相机的异步运行，以及照明与检测光路的未对准，可能导致空间分辨率不均匀（图7C- D).
  9. 进行心脏成像时，在校准系统并确定系统同步的最佳参数后，继续执行步骤 2.6 至 2.9。

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结果

由于共聚焦显微镜（LSM）具有光损伤风险极低、空间分辨率高以及具备光学切片能力，相较于明场成像和点扫描等其他光学成像方法6,8,38,39,40，已被证明可有效促进心脏研究31,32,33,34,35,36,37。因此，为了更深入地理解心肌的三维结构，我们...

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讨论

成像技术、计算方法和组织透明化技术的进步为深入研究心脏结构与功能提供了前所未有的机会，这对于利用完整啮齿类动物心脏模型加深对心脏形态发生和发病机制的理解具有重要意义。与采用类似方法研究斑马鱼心脏的体内研究相比40,41,42,43，先进光片显微技术（LSM）与组织透明化方法的结合使我们能够克服在啮齿类模型成像过程中空间分辨率与穿透深度之间的矛盾9,44。组织透明化技术通过去除脂质及其他散射光的成分使心脏在光学上变得透明，从而实现更深的成像穿透45。当与LSM结合时，我们能够对心肌进行成像，这种组合增强了成像深度，并允许观察复杂的心肌微结构。尽管已有多种透明化方法被建立...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们谨此致谢 我们感谢德克萨斯大学西南医学中心Eric Olson博士团队慷慨提供动物模型。感谢德克萨斯大学达拉斯分校D孵化室成员提供的所有建设性意见。本研究由美国国立卫生研究院R00HL148493（Y.D.）、R01HL162635（Y.D.）以及德克萨斯大学达拉斯分校STARS项目（Y.D.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 琼脂糖
低熔点琼脂糖Thermo Fisher16520050
去离子水--
组织透明化试剂 
5-氨基-1,3,3-三甲基环己烷甲胺（顺式与反式混合物）Sigma-Aldrich118184
D.E.R.™ 332Sigma-Aldrich31185
D.E.R.™ 736Sigma-Aldrich31191
二苄醚（DBE）Sigma-Aldrich33630
二氯甲烷（DCM）Sigma-Aldrich270997
荧光微珠SpherotechFP-0556-2
过氧化氢（H2O2）Sigma-Aldrich216736
甲醇Sigma-Aldrich439193
多聚甲醛（PFA）Thermo Fisher47392
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-Aldrich79383
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP3911
软件与算法
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
BigStitcherHörl 等人22
Fiji-ImageJSchindelin 等人201.54f
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
定制光片成像系统的关键组件
0.63 - 6.3X 变倍体OlympusMVX-ZB10 
10X 照明物镜NikonMRH00105
1X 检测物镜OlympusMV PLAPO 1X/0.25 
473 nm DPSS 激光器Laserglow TechnologiesLRS-0473-PFM-00100-05
532 nm DPSS 激光器Laserglow TechnologiesLRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS 激光器Laserglow TechnologiesLRS-0589-GFF-00100-05
BNC 连接器National InstrumentBNC-2110
柱面透镜ThorlabsACY254-050-A
四轴直流电机控制器Physik InstrumenteC-884.4DC
ETLOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL 电缆OptotuneCAB-6-300
ETL 镜头驱动器OptotuneEL-E-4i
滤光片ChromaET525/30
滤光片ChromaET585-40
滤光片ChromaET645-75
滤光轮 Shutter InstrumentLAMBDA 10-B
电动平移台Physik InstrumenteL-406.20DG10
电动平移台Physik InstrumenteL-406.40DG10
电动平移台Physik InstrumenteM-403.4PD
NI 多功能 I/O 设备National InstrumentPCIe-6363
sCMOS 相机HamamatsuC13440-20CU
步进电机Pololu1474
管镜OlympusMVX-TLU

参考文献

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