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用于常规临床应用的[68Ga]Ga-FAPI-46 自动化放射合成

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DOI：

10.3791/66708

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2024年5月24日

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1Radiopharmaceutical Production and Development Centre (RAPID), Medical Technology and Physics Department, Sir Charles Gairdner Hospital, 2National Imaging Facility, Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis, University of Western Australia, 3Department of Nuclear Medicine, Sir Charles Gairdner Hospital, 4Medical School, University of Western Australia

本文内容

摘要

本研究描述了在iPHASE MultiSyn合成仪上自动化制备高达1.7 GBq的[68Ga]Ga-FAPI-46，用于成纤维细胞激活蛋白的PET显像。

摘要

[68Ga]Ga-FAPI-46 是一种有前景的新型示踪剂，可用于通过正电子发射断层扫描（PET）成像成纤维细胞活化蛋白（FAP）。标记的FAP抑制剂（FAPIs）已在多种癌症中显示出摄取，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和结直肠癌。与FDG-PET相比，FAPI-PET还具有实际优势，因其无需禁食和静息。[68Ga]Ga-FAPI-46 与早期报道的 [68Ga]Ga-FAPI-02 和 [68Ga]Ga-FAPI-04 相比，表现出更优的药代动力学特性、更佳的肿瘤滞留能力以及更高的图像对比度。尽管最初描述了 [68Ga]Ga-FAPI-46 的手动合成方法，但近年来已有采用不同商用合成仪的自动化合成方法报道。

本研究中，我们描述了使用iPHASE MultiSyn合成仪实现[68Ga]Ga-FAPI-46自动化合成以用于临床应用的过程。首先，优化了反应时间，并比较了四种不同固相萃取（SPE）小柱在终产品纯化中的性能。随后，基于这些优化参数，开展了0.6–1.7 GBq规模的[68Ga]Ga-FAPI-46制备工艺开发与验证。该产物在25分钟内实现的衰变校正产率为89.8 ± 4.8%（n = 6）。终产品符合所有推荐的质量控制标准，并在合成后3小时内保持稳定。

引言

成纤维细胞活化蛋白（FAP）已成为癌症成像和治疗的重要靶点1,2。FAP 是癌症相关成纤维细胞（CAFs）的特异性标志物，而 CAFs 是构成大多数实体瘤微环境的主要间质细胞类型。CAFs 在肿瘤生长、侵袭和转移过程中发挥关键作用3。它们存在于大多数实体瘤中，包括乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌1。通过使用标记有诊断性或治疗性放射性核素的小分子抑制剂靶向 FAP，可实现对这些癌症的选择性无创成像和治疗4,5,6。以喹啉为基础的 FAP 靶向分子，如用 68Ga 和 18F 标记的 FAPI-02、FAPI-04、FAPI-46 和 FAPI-74，是由德国海德堡大学医院和德国癌症研究中心（DKFZ）团队开发的一类 FAP 抑制剂（FAPI）分子7,8,9,10,11，其研发基于早期发现的具有高度应用前景的 N-(4-喹啉酰基)-甘氨酰-(2-氰基吡咯烷) 抑制 FAP 的骨架结构12,13。最近，环肽类 FAP 抑制剂如 FAP-228614 和 3BP-394015 也被开发用于成像和治疗。

[68Ga]Ga-FAPI-04 已在28种不同类型的癌症中显示出摄取，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和结直肠癌16。除了无需禁食和静息的实际优势9外，FAPI-PET 在胃肠道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌脑转移17以及FDG结果不明确的病例中，相较于FDG-PET表现出诊断优势或具有互补作用18。68Ga标记的FAPI还在免疫相关性炎症性疾病（如纤维化和类风湿关节炎）中展现出一些有趣的非肿瘤学应用19,20。近期报道的[68Ga]Ga-FAPI-46是[68Ga]Ga-FAPI-04的一种变体，其具有修饰后的十二烷四乙酸（DOTA）连接结构，表现出更优的药代动力学特性及更强的肿瘤滞留能力，从而获得比[68Ga]Ga-FAPI-02或[68Ga]Ga-FAPI-04更高的图像对比度6,10。标记的FAP抑制剂在诊断和治疗中的应用已受国际专利保护21，目前[68Ga]Ga-FAPI-46的使用已获得授权22。

已报道的[68使用回旋加速器生产的 Ga]Ga-FAPI-46 68Ga或 68Ga 从 68Ge/68镓发生器包括手动操作流程和自动合成仪的使用。[68Ga]Ga-FAPI-46 的制备方法已有报道，其基于先前报道的 [68Ga]Ga-FAPI-02 和 [68⁶⁸Ga]Ga-FAPI-0423,24尽管手动标记无需特殊设备，但该方法可能导致操作人员接受的辐射剂量增加，并在生产过程中产生潜在的变异性25；因此，为了满足常规临床应用的需求，有必要实现生产过程的自动化。此外，使用自动合成仪更符合国际GMP法规。[68Ga]Ga-FAPI-46 在多种商用合成仪上进行开发，采用 68不同发生器产生的 Ga26,27,28,29,30,31,32,33 或回旋加速器生产 68Ga34这些自动化方法的具体细节总结如下 补充表 S1 (补充文件 1）。其他物质的自动化合成方法 68镓和 177近年来也已发表过 Lu标记的FAP抑制剂35,36.

在查尔斯·盖尔德纳爵士医院RAPID中心，我们已开发并验证了在iPHASE MultiSyn合成仪（下文简称MS合成仪）上制备[68Ga]Ga-FAPI-46的方法。该合成仪在我们实验室以及澳大利亚其他生产机构中常规用于制备68Ga、177Lu和89Zr标记的放射性药物37,38,39。MS合成仪通过将Excel格式的步骤序列下载至其内部存储器进行操作，该步骤序列设计友好且易于修改。此外，该合成仪支持在生产过程中进行干预操作，例如重复步骤、返回前一步骤、跳过步骤以及在必要时暂停生产。仪器配备有 strategically placed 的辐射探测器，使用户能够实时监控生产过程。MS合成仪兼容所有商用68Ga发生器，支持单个或双发生器洗脱。本研究所描述的流程使用一个或两个68Ge/68Ga发生器产生的68Ga，并包含68Ga的预纯化及终产物的后纯化步骤。本研究还评估了最佳反应时间，并比较了三种不同类型后纯化固相萃取（SPE）小柱与供应商所提供 cassette 中小柱的性能。

方案

警告：本方案涉及放射性物质的操作。所有从事此项工作的人员必须经过非密封放射性同位素操作的充分培训，并获得所在机构辐射安全负责人的批准。自动合成仪必须置于专用的屏蔽热室中。手动实验必须在屏蔽热室中或辐射屏蔽后方进行。反应时间优化及各种固相萃取（SPE）小柱测试的初步实验详见补充部分1（补充文件1）。

1. 质谱合成仪的准备

  1. 打开热室的压缩空气、氮气供应、通风、照明，以及笔记本电脑和可编程逻辑控制器（PLC）的电源。检查模块废液瓶的液位，当液位达到四分之三满时，更换为一个空瓶。
  2. 开启计算机并登录合成仪软件，输入用户名和密码。
  3. 在合成仪软件中，点击下载方案，选择用于合成[68Ga]Ga-FAPI-46的Excel序列文件，然后点击打开。序列成功下载后，点击确定。
  4. 点击开始，在弹出窗口中输入批号、试剂盒批号以及任何备注信息，然后点击确定。
    注意：从此时起，用户界面将显示步骤信息，描述当前操作步骤和/或提示操作人员进行干预。
  5. 根据用户界面上的步骤提示，拆除旧的硬件组件包。然后在用户界面上点击下一步。
  6. 根据用户界面上的步骤提示，从合成仪上取下发生器洗脱注射器（HCl注射器1）：将注射器的推柄从注射器驱动槽中拉出，并将注射器从发生器入口管路中拧下。然后在用户界面上点击下一步。

2. 试剂的准备

注意：用于自动化生产[68Ga]Ga-FAPI-46的试剂（见表1）在生产前立即于洁净室环境中配制。

  1. 获取试剂盒及辅助组件套装，包括一个50 mL离心管，内含至少5 mL金属痕量浓度的水；0.1 M HCl袋装溶液；7 mg抗坏血酸小瓶（小瓶A）；5 mg抗坏血酸钠小瓶（小瓶B）；2个5 mL聚丙烯（PP）/聚乙烯（PE）注射器，不含乳胶、PVC和硅油（若采用双发生器洗脱则需三个）；以及50 µg FAPI-46玻璃小瓶（小瓶C；参见补充图S1A,B-补充文件1）。
  2. 将约2 mL水倒入50 mL离心管的管盖中。用5 mL注射器吸取1 mL水（标记为注射器A），并用针头盖紧。移液400 µL水加入7 mg抗坏血酸小瓶（小瓶A）中，轻轻振荡使其溶解。
  3. 打开试剂盒中提供的0.25 M乙酸钠缓冲液小瓶和50 µg FAPI-46玻璃小瓶。移液0.9 mL缓冲液加入50 µg FAPI-46玻璃小瓶（小瓶B）中，轻轻混匀。
  4. 将小瓶A和小瓶B的内容物吸入注射器A中，轻轻混匀。
  5. 将辅助组件套装中提供的5 mL注射器标记为注射器B。用注射器B从0.1 M HCl袋中抽取5 mL 0.1 M HCl，并用提供的分配针头盖紧。
    注意：若采用双发生器洗脱方式进行生产，需准备两支各含5 mL 0.1 M HCl的注射器。
  6. 将辅助组件套装中提供的3 mL注射器标记为注射器C。打开试剂盒中的酸化5 M氯化钠溶液小瓶，移液1 mL转移至注射器C中，并用提供的分配针头盖紧。
  7. 用5 mL注射器（注射器D）吸取1 mL 0.9%生理盐水，加入小瓶C中；保持注射器D为空。

3. 合成卡盒的准备及卡盒安装

  1. 获取一个专用的无菌[68Ga]Ga卡盒。
  2. 按照以下步骤组装卡盒：
    1. 打开卡盒包装，检查是否有任何损坏，并拧紧每个鲁尔接头。旋转并调整卡盒上的每个旋塞阀，确保其未卡住且能适配模块。取下所有穿刺盖帽。
    2. 对强阳离子交换预纯化固相萃取（SPE）柱进行活化处理，步骤如下：
      1. 将位于M3（第3号多通阀）位置的SPE柱从卡盒上取下。
      2. 在实验台上放置一个专用的敞口玻璃废液瓶。
      3. 将试剂盒中提供的含有2 mL 3 M HCl的注射器连接到SPE柱上，缓慢逐滴将SPE柱冲洗至玻璃废液瓶中。取下注射器，抽入5 mL空气，再用5 mL空气冲洗SPE柱。
        注意：步骤3.2.2.3涉及强酸（3 M盐酸）的操作。请佩戴适当的防护装备（手套、护目镜、实验服）。
      4. 将试剂盒中提供的含有5 mL水的注射器连接到SPE柱上，缓慢逐滴将SPE柱冲洗至玻璃废液瓶中。取下注射器，抽入5 mL空气，再用5 mL空气冲洗SPE柱。
      5. 将SPE柱重新安装回M3阀7位置的多通阀上。
    3. 在用户界面上按下NEXT。
    4. 按照用户界面所示（若采用双次洗脱，请参见图1A,B），在未添加任何试剂的情况下，根据图1C中描述的连接方式组装并安装新的卡盒
      1. 将辅助组件套装中的10 mL注射器连接至M2阀6。
      2. 安装四个多通阀，并使用合成仪的磁性锁固定卡盒。
      3. 将反应器放入加热炉中。
      4. 将管路连接至G1、W2、W1、R和G2端口。
      5. 将M1阀3右侧的管路连接至M3阀7上的阳离子交换柱。
      6. 在M2阀4上安装一个SPE后纯化柱。
        注：合成系统的最终组装示意图见补充图S1C（补充文件1）。
  3. 在用户界面上按下NEXT，以按以下顺序启动下列测试：
    1. 对M4处的惰性气体连接进行压力测试。
    2. 对M3与M4之间的连接进行压力测试。
    3. 对反应器进行压力测试。
    4. 对通向M3的废液连接进行压力测试。
    5. 对M3与M2之间的后纯化SPE柱进行压力测试。
    6. 对M2阀6上的注射器连接进行压力测试。
    7. 对通向M2的废液连接进行压力测试。
    8. 对M1处的惰性气体连接进行压力测试。
    9. 对M1与M3之间的预纯化SPE柱进行压力测试。
    10. 用惰性气体冲洗10、11和12号阀上的穿刺接口。
    11. 用惰性气体冲洗M3和M4。
    12. 用惰性气体冲洗预纯化和后纯化SPE柱。

4. 试剂、发生器管路及最终产物小瓶的安装（参见 图1A、C 和 图1B、C，若使用双发生器洗脱）

  1. 从试剂盒中取出乙醇（100%）、生理盐水和注射用水小瓶；拧下瓶盖，并用酒精棉片擦拭每个隔膜。
  2. 根据合成仪提示，将小瓶安装至模块套件的M4阀10、M4阀11和M4阀12位置；在用户界面上点击下一步。
  3. 取下注射器A的针头，并将活塞拉至5 mL刻度处。
  4. 断开反应器中端口的管路，通过反应器中端口将注射器A中的内容物转移至反应器小瓶中。
  5. 重新连接反应器中端口的管路；在用户界面上点击下一步。
  6. 将发生器出口管路安装至卡盒的M1阀2位置（若为双发生器洗脱，则同时安装至M1阀1）；在用户界面上点击下一步。
  7. 取下注射器C的分配针头，并将其安装至M1阀3位置；在用户界面上点击下一步。
  8. 取下注射器B的分配针头，将注射器B的鲁尔锁接头连接至发生器入口管路接头，推动注射器B，使活塞推杆的拇指托滑入注射器驱动槽中；在用户界面上点击下一步。
  9. 在II级生物安全柜或同等条件下准备最终产品小瓶，步骤如下：
    1. 将一个已标记的25 mL无菌小瓶放入钨屏蔽罐（或适当屏蔽的容器）中。
    2. 用酒精棉片擦拭小瓶隔膜，盖上容器盖，并插入带过滤的通气针。
    3. 将低蛋白吸附的0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）通气式无菌滤器的出口连接至一支无菌20 G皮下注射针头。用产品批号标记该滤器。
    4. 将针头插入25 mL带通气功能的最终产品小瓶中。
    5. 将小瓶C中的内容物（表1）抽入空的注射器D中（见步骤2.7），并加入4 mL空气。
    6. 将注射器D连接至0.22 µm通气式滤器的入口，推动注射器内容物，使其经0.22 µm滤器和针头进入最终产品小瓶中。
    7. 用5 mL空气冲洗滤器两次。将注射器从0.22 µm通气式滤器上移除。
      注意：冲洗过程应缓慢进行，以避免滤膜破裂。
  10. 将装有最终产品小瓶的屏蔽罐转移至热室中，将M2阀5位置的末端管路连接至产品小瓶的滤器，然后在用户界面上点击下一步。

5. 放射性标记前合成仪的初步步骤

  1. 等待合成器完成以下初步步骤：对乙醇瓶加压（M4，阀 10）；对生理盐水瓶加压（M4，阀 11）；对水瓶加压（M4，阀 12）；对酸化氯化钠注射器加压（M1，阀 3）；用乙醇平衡纯化后固相萃取柱；用水平衡纯化后固相萃取柱；重新对水瓶加压（M4，阀 12）。
  2. 按压 下一步 当合成器提示时，在用户界面上启动生产 准备洗脱 68Ga 发生器.

6. 自动化放射性标记制备 [68Ga]Ga-FAPI-46

注意：自动化合成通过执行步骤 5.2 启动。图 1D 描述了用于制备 [68Ga]Ga-FAPI-46 的放射性标记反应。图 1A、B 和 图 2 分别展示了合成仪界面的代表性截图和典型的放射性活度谱图。当使用双发生器淋洗进行生产时，合成仪将提示用户在第一个发生器淋洗完成后取下空的注射器 B，并在注射泵上安装另一个含有 5 mL 0.1 M HCl 的注射器，用于淋洗第二个发生器。

  1. 合成结束（EOS）时，观察合成仪上显示的合成完成信息。从最终产品瓶上取下灭菌用0.22 µm带通气孔滤器和带滤膜的通气针，并从热室内取出钨坩埚。

表1：[68Ga]Ga-FAPI-46 制备所用试剂的配制。 请点击此处下载该表格。

放射性标记示意图，包含多通道装置设置及反应过程；包括层析步骤。
图1：合成器用户界面示意图；用于[68Ga]Ga-FAPI-46 (A单发生器生产装置。B双发生器生产装置。C) 试剂位置用于自动化生产[68使用MS放射合成仪合成[68Ga]Ga-FAPI-46。D) [68Ga]Ga-FAPI-46 放射性标记示意图。缩写：FAPI = 成纤维细胞激活蛋白抑制剂；Mn = 多通接头 n；Wn = 废液出口 n；Vn = 阀门 n；R = 反应器真空；Gn = 气体入口 n 请点击此处查看该图的放大版本。

放射性标记过程图示：[68Ga]Ga3+ 洗脱、固相萃取柱捕获、放射性活度随时间变化分析。
图 2：全自动合成 [68Ga]Ga-FAPI-46 过程中典型的放射性活度曲线。 缩写：FAPI = 成纤维细胞活化蛋白抑制剂；SPE = 固相萃取。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 用于质量控制和运输的 [68Ga]Ga-FAPI-46 分装

  1. 将产品小瓶转移至适当的屏蔽分装系统，并倒置小瓶以混匀内容物。
  2. 采用无菌技术和辐射防护技术，从产品小瓶中抽取 1 mL 样品，并进行以下分装：
    1. 分装 150 µL 至低蛋白吸附的 1.5 mL 离心管（管 1）中，用于放行前质量控制检测及残留溶剂分析。
    2. 分装 50 µL 至低蛋白吸附的 1.5 mL 离心管（管 2）中，用于内毒素检测。
    3. 分装 300 µL 至 10 mL 无菌真空玻璃瓶中，用于无菌检测（待样品衰减至可接受水平 [10 个半衰期] 后送至外部合作单位）。
    4. 分装 500 µL 至 10 mL 无菌真空玻璃瓶中，用于留样。
    5. 将剩余产品分装至一个约 10 mL 的小瓶中，用于患者给药。

8. [68Ga]Ga-FAPI-46的质量控制

注意：下述质量控制测试均依照《欧洲药典》40 中所述的程序进行。

  1. 通过目视检查评估外观。
  2. 使用指示试纸测定 pH 值。
  3. 通过采集放射性核素的三次活度测量值来确定其半衰期 50 µL 使用电离室对样品进行检测。
  4. 使用基于多道分析仪（MCA）的NaI(Tl)伽马能谱仪评估放射性核素的种类和放射性核素纯度。
  5. 使用分析型放射性高效液相色谱法（radio-HPLC）评估放射化学身份，通过验证[68Ga]Ga-FAPI-46 样品及非放射性 [natGa]Ga-FAPI-46参比标准品的信号相似（允许放射性检测器与紫外检测器之间存在微小的延迟体积）。
  6. 使用分析型放射性高效液相色谱法（radio-HPLC），通过方程（1).
    放射化学纯度计算；公式；放射性检测器色谱图中放射性峰的峰面积（AUC）。 
  7. 使用方程（通过分析型放射性薄层色谱法测定放射化学纯度百分比）2).
    放射化学纯度计算公式；色谱法；[68Ga]Ga-FAPI-46 峰的峰面积（AUC）；溶剂前沿 
    注意：步骤 8.8、8.9 和 8.10 可根据当地监管要求在放行前或放行后执行。步骤 8.11 和 8.12 可在放行后执行。任何放行后的检测应在样品放射性衰变后尽快进行。
  8. 使用气相色谱法测定制剂中残留溶剂（乙醇）的含量。
  9. 使用基于卡盒的内毒素检测系统（动态显色法鲎试剂[ LAL ]法）测定细菌内毒素水平。
  10. 评估完整性 0.22 µm 通过气泡测试进行过滤。
  11. 使用γ能谱仪或γ计数器检测放射性核素纯度（锗-68穿透）。保留待测溶液至少48小时，使镓-68衰变至可检测杂质的水平。
  12. 评估产品的无菌性。

9. 稳定性测试

  1. 进行稳定性分析时，在放行终点（EOS）后立即从最终产品小瓶中取出 50 µL 的 [68Ga]Ga-FAPI-46，随后在 EOS 后每 1 小时取样一次，直至 3 小时。
  2. 通过放射性高效液相色谱法（radio-HPLC）在每个时间点测定放射化学纯度百分比。
  3. 通过放射性薄层色谱法（radio-TLC）在每个时间点测定放射化学纯度百分比。

结果

在95 °C反应5至20分钟时测定的放射标记效率见表2。纯化后使用的SPE小柱HLB 30 mg、Strata X 60 mg和Sep-Pak C18 Plus Short 360 mg的回收率非常接近（衰变校正后为94.3 ± 0.5%）（表3）。而在我们实验条件下，HLB 225 mg的回收率明显较低（衰变校正后为63.8 ± 3.5%）。

表2：通过薄层色谱法（TLC）测定的粗反应产物在反应时间为5、10、15和20分钟时的放射化学转化率汇总（n = 3）。 缩写：TLC = 薄层色谱法；Exp. = 实验。 请点击此处下载该表格。

表3：使用四种不同固相萃取小柱（n = 3）在合成结束时对[68Ga]Ga-FAPI-46的回收率百分比及薄层色谱和高效液相色谱放射化学纯度分析结果的总结。缩写：SPE = 固相萃取；FAPI = 成纤维细胞活化蛋白抑制剂；EOS = 合成结束；RSD = 相对标准偏差；TLC = 薄层色谱法；HPLC = 高效液相色谱法。请点击此处下载该表格。

[自动化生产68Ga]Ga-FAPI-46 采用10分钟反应时间及Strata X 60 mg固相萃取小柱制备。分别使用单次发生器洗脱和双次发生器洗脱进行两组各三批次的验证实验，所得终产品平均活度分别为0.60 GBq和1.6 GBq（表 4）。在这两个系列中，最终[68Ga]Ga-FAPI-46 产品通过了所有质量控制检测（表4）。[68通过TLC和HPLC分析评估[68Ga]Ga-FAPI-46产物的放射化学纯度图3 和 图4) 以进行长达3小时的后合成监测，六次制备的放化纯度分别大于98.0 ± 1.8%（n = 3）和99.1 ± 0.9%（n = 3）。总体而言，[68Ga]Ga-FAPI-46 的放化纯度经验证为 89.8 ± 4.8%（经衰变校正，n = 6）。目前该自动化生产方法已用于 [68Ga]Ga-FAPI-46 以支持临床试验。

表4：[68Ga]Ga-FAPI-46 验证运行（n = 6）的质量控制结果汇总：单次发生器洗脱获得的低活度（n = 3）与两次发生器洗脱获得的高活度（n = 3）。 请点击此处下载该表格。

放射性活度与距离关系图（针对 \[^{68}\text{Ga}\] 化合物）；色谱分离结果。
图 3：[68Ga]Ga-FAPI-46 的薄层色谱图：在合成结束时，使用 iTLC-SG 纸和 1 M 醋酸铵/甲醇（1:1 v/v）作为流动相，点样量为 5 µL。采用配备 PS Plastic 放射性检测器的放射性薄层扫描仪进行测量，以 1 mm/s 的速度逐 1 mm 积分读数。缩写：TLC = 薄层色谱；FAPI = 成纤维细胞活化蛋白抑制剂；EOS = 合成结束；iTLC-SG = 即时薄层色谱-硅胶。 请点击此处查看该图的放大版本。

色谱图；Ga-FAPI-46 的紫外和放射性检测；峰强度 vs. 时间。
图 4：[68Ga]Ga-FAPI-46 最终产品的 HPLC 分析。 HPLC RP-18 封端柱，流动相 A：0.1% 三氟乙酸，流动相 B：纯乙腈。梯度：0–0.5 分钟 2% B，0.5–10.0 分钟 2%–35% B，10.0–12.0 分钟 35% B，以及 12.0–15.0 分钟 35% B。紫外检测波长为 280 nm，流速为 2 mL/min。（A）[68Ga]Ga-FAPI-46 产品的紫外色谱图，包含 1.0 分钟处抗坏血酸钠的紫外信号，以及 4.5 和 4.8 分钟处的两个小峰，分别对应 [natGa]Ga-FAPI-46 和 FAPI-46 前体。10 mg/L [natGa]Ga-FAPI-46 标准品和 10 mg/L FAPI-46 前体的紫外色谱图见补充图 S2（补充文件 1）。（B）[68Ga]Ga-FAPI-46 的放射性色谱图（[68Ga]Ga-FAPI-46 的保留时间 Rt = 4.6 分钟，游离 [68Ga]Ga3+ 的保留时间 Rt = 1.1 分钟）。缩写：HPLC = 高效液相色谱；FAPI = 成纤维细胞活化蛋白抑制剂；Na+Asc- = 抗坏血酸钠。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：本文件包括：补充表 S1 — [68Ga]Ga-FAPI-46 的已报道自动化合成及质量控制细节，补充章节 1 — 初步实验：在 MS 放射合成仪上自动化制备 [68Ga]Ga-FAPI-46 的反应时间优化及纯化后固相萃取（SPE）柱的选择，补充图 S1 — 在 MS 合成仪上进行 [68Ga]Ga-FAPI-46 自动化合成所用试剂及最终装置的照片，补充图 S2 — [natGa]Ga-FAPI-46 与 FAPI-46 前体的紫外色谱图，以及 补充图 S3 — 反应器中不添加抗坏血酸条件下高放射活度标记（2.8 GBq）的 [68Ga]Ga-FAPI-46 放射色谱图。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究描述了在MS合成仪上可靠且高产率地制备用于临床应用的[68Ga]Ga-FAPI-46的方法。该方案的初步预实验在同一组实验中测试了[68Ga]Ga-FAPI-46合成的不同反应时间，以及四种不同的固相萃取（SPE）小柱用于最终产物的纯化。为了（i）降低操作人员的辐射剂量，以及（ii）模拟[68Ga]Ga-FAPI-46常规生产时的实际条件，这些初步实验尽可能在MS合成仪上进行。[68Ga]Ga-FAPI-46的合成程序采用了与[68Ga]Ga-PSMA-11和[68Ga]Ga-DOTA-TATE制备相似的参数，基于Excel表格中的简单逐步编程设计，可方便地进行修改。试剂盒和试剂仅装配了[68Ga]Ga-FAPI-46合成的第一阶段所需部分（68Ga的洗脱与纯化；标记反应），省略了后续步骤（SPE纯化和最终无菌过滤），因为这些初步实验是对手动处理的粗产物进行的。因此，无需安装用于纯化后处理的SPE小柱（Strata X 60 mg），以及 manifold 4 上的乙醇、水和生理盐水小瓶，也不需要最终产物小瓶。

关于[68Ga]Ga-FAPI-46制备的已发表文献中，描述了使用不同固相萃取（SPE）小柱对终产物进行纯化的方法：OASIS HLB 30 mg吸附剂23,29、OASIS HLB Plus 225 mg28、CM26,34、C18 Plus Sep-Pak30,32以及Sep-Pak Light C1831。本研究比较了文献中使用的三种不同SPE小柱（HLB 30 mg、C18 SepPak Plus Short和HLB 225 mg）与我们现有用于[68Ga]Ga-PSMA-11和[68Ga]Ga-DOTA-TATE纯化的试剂盒中所配备的Strata X 60 mg小柱。据我们所知，Strata X 60 mg SPE小柱此前尚未被评估用于[68Ga]Ga-FAPI-46的纯化。在捕获和洗脱效率方面，Strata X 60 mg的表现与文献中用于[68Ga]Ga-FAPI-46纯化的其他SPE小柱相比，相当（HLB 30 mg；C18 SepPak Plus Short）或更优（HLB 225 mg）（表3）。对HLB 225 mg额外使用1 mL乙醇进行洗脱并未带来显著改善（结果未显示）。因此，选择Strata X 60 mg小柱用于验证本方案中所述的全自动合成过程。

上述方案中所述的[68Ga]Ga-FAPI-46自动化合成过程可分为四个主要步骤。第一步是使用0.1 M HCl对一个或两个68Ge/68Ga发生器进行洗脱，并将洗脱出的[68Ga]GaCl3捕获于离子交换柱中。随后，使用酸化的5 M氯化钠溶液将[68Ga]Ga3+从离子交换柱洗脱至反应瓶中（反应瓶已预装含有50 µg FAPI-46前体、1.4 mL含痕量金属的水以及7 mg抗坏血酸的前体溶液）。标记反应的pH值为3.5–4。下一步为放射性标记反应，期间将反应器在95 °C加热10分钟，使[68Ga]Ga3+与FAPI-46前体中的DOTA基团发生络合。反应混合物冷却至40 °C后，进入第四步也是最后一步，即对[68Ga]Ga-FAPI-46进行纯化，具体包括：(i) 将反应混合物上样并捕获于纯化后处理用Strata X 60 mg固相萃取（SPE）柱中进行纯化，(ii) 使用注射用水冲洗Strata X 60 mg SPE柱，(iii) 用乙醇洗脱最终产物，(iv) 用生理盐水稀释，以及(v) 通过0.22 µm带通气口的除菌滤膜将产物转移至最终产品小瓶中。该反应过程可通过目视观察以及传感器读数（如温度、压力、真空度、放射性读数和倒计时）进行实时监测。用户界面的代表性截图见图1A、B。如图2所示的放射性活度分布图对于监控合成进程特别有用，可直观显示放射性在上述关键步骤中的转移情况。

共进行了六次验证运行，均通过了所有质量控制标准，使用了一个或两个68Ge/68Ga发生器（2.41 GBq）。其中三次运行使用单个发生器洗脱的68Ga，得到0.59–0.63 GBq的[68Ga]Ga-FAPI-46；另三次运行使用两个发生器洗脱的68Ga，得到1.54–1.71 GBq的[68Ga]Ga-FAPI-46。每次运行耗时约25分钟。单发生器方法的设计考虑了未来可能需要生产更高活度的需求。因此，在反应体系中加入了7 mg抗坏血酸稳定剂，以避免放射性标记过程中发生辐射分解，该方法此前由Mu等人报道用于[68Ga]Ga-DOTA-TATE的制备41。Da Pieve等人29和Alfteimi等人30也报道在[68Ga]Ga-FAPI-46的自动化生产中向反应体系添加0.3 mg抗坏血酸稳定剂（补充材料 表S1-补充文件1）。事实上，当反应体系中未添加抗坏血酸稳定剂时，我们观察到高活度合成（反应器中约2.8 GBq）出现明显的辐射分解现象（补充材料 图S3-补充文件1）。此外，为避免终产品发生辐射分解，通过除菌滤器手动向终产品小瓶中加入含1 mL 0.9%注射用生理盐水的5 mg抗坏血钠，最终产品体积为11 mL。每批产品在制备后3小时内进行检测，低活度（单发生器洗脱）和高活度（双发生器洗脱）生产均表现出优异的放射化学稳定性（HPLC和TLC检测结果均>95%）。需要特别强调的是，本方案的实施涉及非密封放射性物质的操作，必须由经过适当培训的人员进行。操作应在放射屏蔽条件下进行，最好在通风热室中完成。本方案合成[68Ga]Ga-FAPI-46的预期用途是用于患者诊断成像。因此，整个过程应严格遵守无菌操作技术。如上所述，对[68Ga]Ga-FAPI-46进行质量控制检测，对于确保终产品质量至关重要。

预计任何生产[68Ga]Ga-PSMA-11 或 [68MS合成仪上的Ga]Ga-DOTA-TATE应完全具备制备[68Ga]Ga-FAPI-46 采用此处所述方案制备，仅需对替代发生器或试剂的使用进行少量修改。由于对[68Ga]Ga-FAPI-46 以满足临床需求，本研究所设计的工作旨在适应不同机构在生产1至2例患者剂量的[68单发生器法每次合成可供1名患者使用，双发生器法每次合成可供4至5名患者使用，具体取决于PET扫描仪的可用情况。

披露

作者没有可能引起与本工作相关的实际或可感知利益冲突的商业合作关系或资金来源需要披露。

致谢

作者谨此致谢并感谢SOFIE Biosciences Inc. 提供FAPI-46化学前体及[natGa]Ga-FAPI-46标准品，感谢Charlies基金会提供的资金支持，感谢iPHASE Pty Ltd的Stan Poniger，以及Sir Charles Gairdner医院医学技术与物理科放射性药物生产团队（RAPID）在科学与技术方面给予的支持。作者同时感谢西澳大利亚国家影像设施节点（WA National Imaging Facility Node）提供的协助，该设施由西澳大利亚州政府与澳大利亚联邦政府通过国家协作研究基础设施战略（NCRIS）共同提供基础设施资金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 M 盐酸（HCl）超纯ABX advanced biochemical compound (Radberg, Germany)HCl-103-G用于发生器洗脱
乙酸铵Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)A1542-250G用于配制iTLC流动相
C18 SepPak Plus短柱（360 mg）WatersWAT020515纯化后硅胶固相萃取柱
Chromolith Performance RP-18 封端 100-4.6 整体柱Merck Pty Ltd (Victoria (Australia)1021290001高效液相色谱RP-18封端柱，用于HPLC质量控制
放射性活度计CapintecCRC-15PET用于校准和测量68Ga放射性活度
双通道扫描-RAM LabLogic Limited (VA, USA)SR-1A放射性薄层扫描仪，用于分析iTLC纸
FAPI-46前体（GMP级）ABX advanced biochemical compound (Radberg, Germany)3601.0000.050肽类前体
Fill ease 无菌真空瓶（10 mL）HUAYI iosotopesSVV-10C用于无菌和留样
Fill ease 无菌真空瓶（25 mL）HUAYI iosotopesSVV-25A用于最终产品
发生器预纯化Ga68肽类放射性标记试剂盒iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)MSR-120G-(RK-3296)试剂组 
发生器预纯化Ga68放射性标记试剂盒iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)MSH-120硬件卡盒+辅助组件套装 
气相色谱（GC）系统Agilent technologies (Vic, Australia)G2630A用于测定残留溶剂
GS标准源（Ba133）Global Medical Solutions Pty Ltd (Australia)D-102-19用于校准伽马能谱仪
GS标准源（Co60）Global Medical Solutions Pty Ltd (Australia)1559-84用于校准伽马能谱仪
高效液相色谱（HPLC）系统Shimadzu Scientific Instruments (NSW, Australia)LC-20HPLC设备
疏水性通气针Baldwin Medical (Victoria, australia)1088与最终产品小瓶配合使用
 IGG100 Eckert & Ziegler Isotope Products  (Berlin, Germany)IGG100-65M-NT68Ge/68Ga发生器
5 mL注射器（Injekt鲁尔锁单件式注射器）B Braun (Melsungen, Germany)4606710V聚丙烯（PP）/聚乙烯（PE）注射器，不含乳胶、PVC和硅油，用于试剂
iTLC-SG纸Agilent technologies (Vic, Australia)SGI0001用于iTLC分析
LabLogic软件（LAURA）LabLogic Limited (VA, USA)LAURA软件版本6.1用于放射性薄层色谱分析
L-抗坏血酸 痕量分析级Fluka Sigma05878-100G在反应体系中用作自由基清除剂
Lichrosolv乙腈（ACN）Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)1.00030.2500用于配制HPLC有机流动相
Lichrosolv水Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)1.15333.2500用于配制HPLC水相流动相
甲醇（MeOH）Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)1060182500用于配制iTLC流动相
Na+I-检测器LabLogic Limited (VA, USA)1"NaI / PMT用于放射性HPLC的放射性检测器
Oasis HLB（30 mg）Waters (Milford, MA, USA)WAT094225纯化后共聚物固相萃取柱
Oasis HLB Plus短柱（225 mg）Waters (Milford, MA, USA)186000132纯化后共聚物固相萃取柱
pH试纸Thermo Fisher Scientific Australia Tty Ltd90424用于测定产品pH值
PS 检测器LabLogic Limited (VA, USA)PS塑料/PMT用于放射性薄层色谱的放射性检测器
 Safe Lock管（1.5 mL）Eppendorf0030 120.086用于质量控制样品
(+)-L-抗坏血酸钠Merck Pty Ltd (Victoria (Australia)11140-250G最终产品的稳定剂
氯化钠（NaCl）溶液（生理盐水）PfizerPS1110.9%，注射用，符合美国药典标准
Sterican 100 针头B Braun (Melsungen, Germany)4667093用于最终产品
无菌注射器滤器（0.22 µm）Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)SLGSV255FMillex-GV
Strata SCX（包含在硬件卡盒套件中）Phenomenex，由iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)硬件套件提供MSH-120预纯化硅胶固相萃取柱，位于硬件卡盒内
Strata X（包含在硬件卡盒套件中）Phenomenex，由iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)硬件套件提供MSH-120纯化后硅胶固相萃取柱，位于硬件卡盒内
痕量分析专用水Honeywell Riedel-de-Haen95305-2.5L用于反应体系及预纯化固相萃取柱的预处理
三氟乙酸（TFA）Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)302031-10X1mL用于配制HPLC水相流动相
超细胰岛素注射器（0.5 mL）BD326769用于分装质量控制样品
带通气滤膜的Cathivex-GV滤器（0.22 µm），低蛋白吸附Durapore PVDF膜Merk Millipore (Cork, Ireland)SLGV02505用于过滤最终产品

参考文献

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镓-68 FAPI-46PET示踪剂成纤维细胞活化蛋白固相萃取临床放射化学质量控制SPE小柱肿瘤成像iPHASE MultiSyn
用于常规临床应用的[68Ga]Ga-FAPI-46 自动化放射合成
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