本研究描述了在iPHASE MultiSyn合成仪上自动化制备高达1.7 GBq的[68Ga]Ga-FAPI-46，用于成纤维细胞激活蛋白的PET显像。
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摘要
摘要
[68Ga]Ga-FAPI-46 是一种有前景的新型示踪剂，可用于通过正电子发射断层扫描（PET）成像成纤维细胞活化蛋白（FAP）。标记的FAP抑制剂（FAPIs）已在多种癌症中显示出摄取，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和结直肠癌。与FDG-PET相比，FAPI-PET还具有实际优势，因其无需禁食和静息。[68Ga]Ga-FAPI-46 与早期报道的 [68Ga]Ga-FAPI-02 和 [68Ga]Ga-FAPI-04 相比，表现出更优的药代动力学特性、更佳的肿瘤滞留能力以及更高的图像对比度。尽管最初描述了 [68Ga]Ga-FAPI-46 的手动合成方法，但近年来已有采用不同商用合成仪的自动化合成方法报道。
本研究中，我们描述了使用iPHASE MultiSyn合成仪实现[68Ga]Ga-FAPI-46自动化合成以用于临床应用的过程。首先，优化了反应时间，并比较了四种不同固相萃取（SPE）小柱在终产品纯化中的性能。随后，基于这些优化参数，开展了0.6–1.7 GBq规模的[68Ga]Ga-FAPI-46制备工艺开发与验证。该产物在25分钟内实现的衰变校正产率为89.8 ± 4.8%（n = 6）。终产品符合所有推荐的质量控制标准，并在合成后3小时内保持稳定。
引言
成纤维细胞活化蛋白（FAP）已成为癌症成像和治疗的重要靶点1,2。FAP 是癌症相关成纤维细胞（CAFs）的特异性标志物，而 CAFs 是构成大多数实体瘤微环境的主要间质细胞类型。CAFs 在肿瘤生长、侵袭和转移过程中发挥关键作用3。它们存在于大多数实体瘤中，包括乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌1。通过使用标记有诊断性或治疗性放射性核素的小分子抑制剂靶向 FAP，可实现对这些癌症的选择性无创成像和治疗4,5,6。以喹啉为基础的 FAP 靶向分子，如用 68Ga 和 18F 标记的 FAPI-02、FAPI-04、FAPI-46 和 FAPI-74，是由德国海德堡大学医院和德国癌症研究中心（DKFZ）团队开发的一类 FAP 抑制剂（FAPI）分子7,8,9,10....
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方案
警告：本方案涉及放射性物质的操作。所有从事此项工作的人员必须经过非密封放射性同位素操作的充分培训，并获得所在机构辐射安全负责人的批准。自动合成仪必须置于专用的屏蔽热室中。手动实验必须在屏蔽热室中或辐射屏蔽后方进行。反应时间优化及各种固相萃取（SPE）小柱测试的初步实验详见补充部分1（补充文件1）。
1. 质谱合成仪的准备
- 打开热室的压缩空气、氮气供应、通风、照明，以及笔记本电脑和可编程逻辑控制器（PLC）的电源。检查模块废液瓶的液位，当液位达到四分之三满时，更换为一个空瓶。
- 开启计算机并登录合成仪软件，输入用户名和密码。
- 在合成仪软件中，点击下载方案，选择用于合成[68Ga]Ga-FAPI-46的Excel序列文件，然后点击打开。序列成功下载后，点击确定。
- 点击开始，在弹出窗口中输入批号、试剂盒批号以及任何备注信息，然后点击确定。
注意：从此时起，用户界面将显示步骤信息，描述当前操作步骤和/或提示操作人员进行干预。 - 根据用户界面上的步骤提示，....
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结果
在95 °C反应5至20分钟时测定的放射标记效率见表2。纯化后使用的SPE小柱HLB 30 mg、Strata X 60 mg和Sep-Pak C18 Plus Short 360 mg的回收率非常接近（衰变校正后为94.3 ± 0.5%）（表3）。而在我们实验条件下，HLB 225 mg的回收率明显较低（衰变校正后为63.8 ± 3.5%）。
表2：通过薄层色谱法（TLC）测定的粗反应产物在反应时间为5、10、15和20分钟时的放射化学转化率汇总（n = 3）。 缩写：TLC = 薄层色谱法；Exp. = 实验。 请点击此处下载该表格。
表3：使用四.......
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讨论
本研究描述了在MS合成仪上可靠且高产率地制备用于临床应用的[68Ga]Ga-FAPI-46的方法。该方案的初步预实验在同一组实验中测试了[68Ga]Ga-FAPI-46合成的不同反应时间，以及四种不同的固相萃取（SPE）小柱用于最终产物的纯化。为了（i）降低操作人员的辐射剂量，以及（ii）模拟[68Ga]Ga-FAPI-46常规生产时的实际条件，这些初步实验尽可能在MS合成仪上进行。[68Ga]Ga-FAPI-46的合成程序采用了与[68Ga]Ga-PSMA-11和[68Ga]Ga-DOTA-TATE制备相似的参数，基于Excel表格中的简单逐步编程设计，可方便地进行修改。试剂盒和试剂仅装配了[68Ga]Ga-FAPI-46合成的第一阶段所需部分（68Ga的洗脱与纯化；标记反应），省略了后续步骤（SPE纯化和最终无菌过滤），因为这些初步实验是对手动处理的粗产物进行的。因此，无需安装用于纯化后处理的SPE小柱（Strata X 60 mg），以及 manifold .......
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披露
作者没有可能引起与本工作相关的实际或可感知利益冲突的商业合作关系或资金来源需要披露。
致谢
作者谨此致谢并感谢SOFIE Biosciences Inc. 提供FAPI-46化学前体及[natGa]Ga-FAPI-46标准品，感谢Charlies基金会提供的资金支持，感谢iPHASE Pty Ltd的Stan Poniger，以及Sir Charles Gairdner医院医学技术与物理科放射性药物生产团队（RAPID）在科学与技术方面给予的支持。作者同时感谢西澳大利亚国家影像设施节点（WA National Imaging Facility Node）提供的协助，该设施由西澳大利亚州政府与澳大利亚联邦政府通过国家协作研究基础设施战略（NCRIS）共同提供基础设施资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 M 盐酸（HCl）超纯 | ABX advanced biochemical compound (Radberg, Germany) | HCl-103-G | 用于发生器洗脱 |
| 乙酸铵 | Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia) | A1542-250G | 用于配制iTLC流动相 |
| C18 SepPak Plus短柱（360 mg） | Waters | WAT020515 | 纯化后硅胶固相萃取柱 |
| Chromolith Performance RP-18 封端 100-4.6 整体柱 | Merck Pty Ltd (Victoria (Australia) | 1021290001 | 高效液相色谱RP-18封端柱，用于HPLC质量控制 |
| 放射性活度计 | Capintec | CRC-15PET | 用于校准和测量68Ga放射性活度 |
| 双通道扫描-RAM | LabLogic Limited (VA, USA) | SR-1A | 放射性薄层扫描仪，用于分析iTLC纸 |
| FAPI-46前体（GMP级） | ABX advanced biochemical compound (Radberg, Germany) | 3601.0000.050 | 肽类前体 |
| Fill ease 无菌真空瓶（10 mL） | HUAYI iosotopes | SVV-10C | 用于无菌和留样 |
| Fill ease 无菌真空瓶（25 mL） | HUAYI iosotopes | SVV-25A | 用于最终产品 |
| 发生器预纯化Ga68肽类放射性标记试剂盒 | iPHASE Technologies (Melbourne, Australia) | MSR-120G-(RK-3296) | 试剂组 |
| 发生器预纯化Ga68放射性标记试剂盒 | iPHASE Technologies (Melbourne, Australia) | MSH-120 | 硬件卡盒+辅助组件套装 |
| 气相色谱（GC）系统 | Agilent technologies (Vic, Australia) | G2630A | 用于测定残留溶剂 |
| GS标准源（Ba133） | Global Medical Solutions Pty Ltd (Australia) | D-102-19 | 用于校准伽马能谱仪 |
| GS标准源（Co60） | Global Medical Solutions Pty Ltd (Australia) | 1559-84 | 用于校准伽马能谱仪 |
| 高效液相色谱（HPLC）系统 | Shimadzu Scientific Instruments (NSW, Australia) | LC-20 | HPLC设备 |
| 疏水性通气针 | Baldwin Medical (Victoria, australia) | 1088 | 与最终产品小瓶配合使用 |
| IGG100 | Eckert & Ziegler Isotope Products (Berlin, Germany) | IGG100-65M-NT | 68Ge/68Ga发生器 |
| 5 mL注射器（Injekt鲁尔锁单件式注射器） | B Braun (Melsungen, Germany) | 4606710V | 聚丙烯（PP）/聚乙烯（PE）注射器，不含乳胶、PVC和硅油，用于试剂 |
| iTLC-SG纸 | Agilent technologies (Vic, Australia) | SGI0001 | 用于iTLC分析 |
| LabLogic软件（LAURA） | LabLogic Limited (VA, USA) | LAURA软件版本6.1 | 用于放射性薄层色谱分析 |
| L-抗坏血酸 痕量分析级 | Fluka Sigma | 05878-100G | 在反应体系中用作自由基清除剂 |
| Lichrosolv乙腈（ACN） | Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia) | 1.00030.2500 | 用于配制HPLC有机流动相 |
| Lichrosolv水 | Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia) | 1.15333.2500 | 用于配制HPLC水相流动相 |
| 甲醇（MeOH） | Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia) | 1060182500 | 用于配制iTLC流动相 |
| Na+I-检测器 | LabLogic Limited (VA, USA) | 1"NaI / PMT | 用于放射性HPLC的放射性检测器 |
| Oasis HLB（30 mg） | Waters (Milford, MA, USA) | WAT094225 | 纯化后共聚物固相萃取柱 |
| Oasis HLB Plus短柱（225 mg） | Waters (Milford, MA, USA) | 186000132 | 纯化后共聚物固相萃取柱 |
| pH试纸 | Thermo Fisher Scientific Australia Tty Ltd | 90424 | 用于测定产品pH值 |
| PS 检测器 | LabLogic Limited (VA, USA) | PS塑料/PMT | 用于放射性薄层色谱的放射性检测器 |
| Safe Lock管（1.5 mL） | Eppendorf | 0030 120.086 | 用于质量控制样品 |
| (+)-L-抗坏血酸钠 | Merck Pty Ltd (Victoria (Australia) | 11140-250G | 最终产品的稳定剂 |
| 氯化钠（NaCl）溶液（生理盐水） | Pfizer | PS111 | 0.9%，注射用，符合美国药典标准 |
| Sterican 100 针头 | B Braun (Melsungen, Germany) | 4667093 | 用于最终产品 |
| 无菌注射器滤器（0.22 µm） | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | SLGSV255F | Millex-GV |
| Strata SCX（包含在硬件卡盒套件中） | Phenomenex，由iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)硬件套件提供 | MSH-120 | 预纯化硅胶固相萃取柱，位于硬件卡盒内 |
| Strata X（包含在硬件卡盒套件中） | Phenomenex，由iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)硬件套件提供 | MSH-120 | 纯化后硅胶固相萃取柱，位于硬件卡盒内 |
| 痕量分析专用水 | Honeywell Riedel-de-Haen | 95305-2.5L | 用于反应体系及预纯化固相萃取柱的预处理 |
| 三氟乙酸（TFA） | Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia) | 302031-10X1mL | 用于配制HPLC水相流动相 |
| 超细胰岛素注射器（0.5 mL） | BD | 326769 | 用于分装质量控制样品 |
| 带通气滤膜的Cathivex-GV滤器（0.22 µm），低蛋白吸附Durapore PVDF膜 | Merk Millipore (Cork, Ireland) | SLGV02505 | 用于过滤最终产品 |
参考文献
- Imlimthan, S., et al. New frontiers in cancer imaging and therapy based on radiolabeled fibroblast activation protein inhibitors: a rational review and current progress. Pharmaceuticals. 14 (10), 1023(2021).
- Siveke, J. T.
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