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小鼠初始CD4+ T细胞体外分化为致病性Th17细胞

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DOI：

10.3791/66718

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2024年10月25日

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1Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, Department of Critical Care Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Department of Pathogenic Biology and Immunology, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, School of Medicine, Southeast University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了初始CD4+ 将T细胞转化为致病性Th17细胞 体外特别是当与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，可从初始CD4细胞中获得纯度达90%的致病性Th17细胞+ 使用此分化方法的T细胞。

摘要

体外 T 细胞分化技术对于 CD4+ T 细胞的功能与机制研究至关重要。近年来，致病性 Th17 细胞已被发现与多种疾病相关，包括多发性硬化症（MS）、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、脓毒症及其他自身免疫性疾病。然而，目前所知的体外分化方案在获得高纯度的致病性 Th17 细胞方面存在困难，诱导效率通常低于 50%，这是体外实验中的一个关键挑战。在本方案中，我们提出了一种优化的体外培养与致病性 Th17 细胞分化方案，可用于将从小鼠脾脏中分离的初始 CD4+ T 细胞直接分化为致病性 Th17 细胞。该方案详细说明了脾细胞分离、初始 CD4+ T 细胞纯化以及致病性 Th17 细胞分化的操作步骤。通过本方案，我们可实现约 90% 的致病性 Th17 细胞分化纯度，满足多种细胞实验的基本需求。

引言

离开胸腺后，初始CD4+ T淋巴细胞会经过次级淋巴器官。当抗原呈递细胞向初始CD4+ T细胞传递同源抗原时，可激活这些T细胞，启动一系列分化程序，最终产生高度特化的辅助性T细胞（Th）亚群1。Th17细胞是一类促炎性Th细胞亚群，其特征是产生白细胞介素17（IL-17）2。Th17细胞在宿主抵御胞外病原体以及多种自身免疫性疾病（如自身免疫性葡萄膜炎和多发性硬化症）的发病机制中发挥重要作用。T细胞受体信号以及细胞因子IL-6和转化生长因子-β（TGF-β）共同作用，通过激活信号转导子和转录激活子（STAT）3的磷酸化，诱导初始T细胞向Th17细胞分化3。STAT3的活化可通过IL-23和IL-21介导的信号通路形成正反馈回路而进一步放大4,5。STAT3的磷酸化可诱导转录因子RORγt和RORα的表达，二者作为主调控开关，调节Th17细胞中IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22等细胞因子的表达谱6。然而，已有研究报道，仅由IL-6和TGF-β诱导产生的Th17细胞不足以引发自身免疫性疾病，后者需要IL-23的共刺激，或在缺乏TGF-β的情况下由IL-6、IL-1β和IL-23共同提供共刺激信号7,8。

某些无法有效诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的Th17亚群有时被称为非致病性Th17，而能够诱导EAE的Th17亚群则被称为致病性Th179。目前研究表明，尽管致病性Th17与非致病性Th17共同表达核心转录因子RORγt，但在产生IL-17A的能力以及促炎和抗炎特性方面存在显著差异10。除了高表达Th17共有的特征性转录因子RORγt、CCR6、STAT4和RUNX4外，致病性Th17细胞还表现出与疾病相关的额外基因信号表达特征，例如具有Th1细胞亚群特征的TBX21、IFN-γ和CXCR3。致病性Th17细胞能够分泌高水平的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN-γ、TNF-α等细胞因子11,12。非致病性Th17细胞的表型不稳定，仅在CD3和细胞因子IL-2刺激下，其中部分细胞可分化为致病性Th17细胞。因此，在类风湿关节炎、多发性硬化症和急性呼吸窘迫综合征等常见临床疾病模型中，致病性Th17细胞主要发挥致病作用。

致病性和非致病性Th17细胞均可分化 体外 在不同细胞因子的影响下。近年来，多项研究提出了利用不同类型和浓度的细胞因子诱导 Th17 细胞分化的方案。Th17 细胞由 IL-6、IL-1β 和 IL-23 共同刺激而产生。13,14,15,16已证实，IL-6 和 TGF-β 这两种对 Th17 细胞分化至关重要的细胞因子，通过与 RORγt 基因座上两个不同的保守非编码 DNA 序列相互作用，协同调控 RORγt 的表达及 Th17 细胞的分化。 Rorc 基因座17致病性Th17细胞的稳定阶段主要由IL-23维持18,19IL-23 与其受体结合并激活 JAK-STAT 信号通路20，从而引起Jak2和Tyk2的磷酸化，并促进STAT1、STAT3、STAT4和STAT5的磷酸化。IL-4和IFN-γ是该通路的负调控因子。然而，研究表明IL-1β可能正向调控该通路中转录的进行 Rorα 和 Rorγt 通过mTOR通路维持Th17细胞表型的稳定性21.

由于大量研究存在异质性，我们选择最新研究中致病性和非致病性 Th17 细胞的诱导方案作为对照22。结果表明，假设完全按照本方案操作，在诱导致病性 Th17 细胞的条件下培养 5 天后，超过 90% 的存活细胞可转化为致病性 Th17 细胞。

方案

东南大学动物研究机构审查委员会批准了本研究中详述的所有动物实验，这些实验均按照当地和机构办公室的标准进行。脾脏样本取自 C57BL6/J 小鼠。本研究纳入了 5 至 8 周龄的雌性和雄性小鼠。培养基和缓冲液在 4 °C 下保存，最长可保存 1 个月。手术器械在使用前均经过高压灭菌。佩戴乳胶手套和口罩，以避免试剂对皮肤、眼睛和衣物造成污染；若接触皮肤或眼睛，应使用大量水或生理盐水冲洗。

1. 使用抗CD3抗体包被24孔组织培养板

  1. 用无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS）或RPMI 1640培养基将抗CD3抗体稀释至终浓度为1 µg/mL。
  2. 向24孔细胞培养板的每个孔中加入1 mL抗CD3溶液（1 µg/mL），然后用封口膜覆盖孔板。
  3. 将包被抗CD3抗体的孔板置于冰箱（2 °C–8 °C）中孵育16小时，或在37 °C细胞培养箱中孵育2–3小时。

2. 小鼠脾脏的分离及脾单细胞悬液的制备

  1. 使用3%异氟烷对C57BL/6J小鼠实施完全麻醉，并通过吸入100%二氧化碳2分钟实施安乐死。小鼠死亡后立即将其浸入75%乙醇中消毒，以防止污染。
  2. 将小鼠仰卧置于洁净台中，沿腹部中线剪开，逐层分离腹腔结构。用镊子轻轻打开大网膜和胃部，借助胃脾韧带轻轻拉出脾脏，钝性分离脾脏周围组织及韧带，以获取完整脾脏（注意避免挤压或破裂脾脏）。
    注意：为保持无菌状态，后续操作均在无菌超净工作台中进行。
  3. 将70 µm细胞滤膜置于100 mm无菌培养皿中，将脾脏放入细胞筛中，用注射器活塞碾压破碎。同时加入5–8 mL匀浆冲洗液，推动所有细胞通过滤膜进入培养皿。
    注意：淋巴细胞分离液试剂盒的组成详见材料表。
  4. 将滤液在室温下以450 × g离心5分钟，弃去上清液。
  5. 用淋巴细胞分离试剂盒提供的样品稀释液，或PBS或RPMI 1640培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液浓度调整至2 × 108–1 × 109 个细胞/mL。
    注意：通常每只脾脏需要4–6 mL样品稀释液。
  6. 在离心管中加入与组织单细胞悬液等体积的淋巴细胞分离液。小心将单细胞悬液缓慢铺加在淋巴细胞分离液表面，于25 °C下以800 × g离心30分钟。将离心机的升速和降速档位设置为适当范围（例如，若档位为1–9，则设为3档）。
    注意：淋巴细胞分离液体积不应少于3 mL。
  7. 离心后，从上至下观察离心管内出现的四层结构：第一层为样品稀释液，其下为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为分离液，最底层为红细胞。
  8. 用移液器小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层至另一离心管中，并加入10 mL洗涤液混匀细胞。
  9. 在室温下以250 × g离心5分钟，弃去上清液。用10 mL RPMI 1640培养基重悬细胞沉淀，进行细胞计数。

基于磁珠负向选择法纯化初始型 CD4+ T 细胞

注意：通过免疫磁珠负向筛选法，从小鼠脾细胞中分离未受刺激且高度纯化的初始型CD4+ T细胞（CD4+CD44lowCD62Lhigh）。

  1. 将样品制备至含有 1 × 108 0.1–2 mL 体积范围内，细胞密度为 cells/mL。
  2. 加入 50 µL/mL 大鼠血清，将样品转移至 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。
    注意：naive CD4 T细胞分选试剂盒的组成成分见于下文 材料表.
  3. 加入50 µL/mL分离试剂盒至样品中，充分混匀，在室温下孵育7.5分钟。
  4. 向样品中加入 50 µL/mL 去除缓冲液，充分混匀，在室温下孵育 2.5 分钟。
  5. 涡旋磁珠以确保均匀分散。按每毫升样品加入75 µL磁珠，充分混匀后于室温孵育2.5分钟。
    注意：颗粒应均匀分散；涡旋时间不应少于30秒。
  6. 用RPMI 1640培养基将样品补至终体积2.5 mL，轻轻吹打混匀数次。
  7. 将离心管（不加盖）放入磁力架中，室温孵育2.5 min。
  8. 拿起磁铁，将磁铁和试管作为一个整体连续翻转，将富集的细胞悬液倒入新试管中。
    注意：将试管和磁铁倒置保持2-3秒后再转为正立。不要扰动可能残留在管口的液滴。
  9. 使用血细胞计数板确定细胞数量。
  10. 进行初始CD4的流式细胞术分析+ 分离前后T细胞（图1).
  11. 将细胞转移至新的离心管中，在室温下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
  12. 将细胞重悬于200–500 µL RPMI 1640培养基中（添加10%胎牛血清）。每1 mL细胞培养液（例如，约106个细胞/mL），加入2 µL白细胞激活剂混合液并混匀。将细胞置于37 °C、饱和湿度的CO2培养箱中培养4–6小时。
    注意：细胞每隔1-2小时涡旋振荡一次。
  13. 以 400 × g 离心细胞 g，4 °C 下离心 5 分钟。小心弃去上清液，将细胞重悬于 200 µL PBS 中。向细胞中加入 1 µL Fc 阻断剂（例如，约 10⁶ 个细胞/mL）。4 °C 下孵育 10 分钟。
  14. 用 1 mL PBS 洗涤细胞一次，400 × g 离心 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于200 µL PBS中。
  15. 加入抗体混合物（Fixable Viability Dye 1:1,000；抗-CD4 1:200；抗-CD44 1:200；抗-CD62L 1:200），4 °C避光孵育15–20分钟。
  16. 用 2 × 1 mL 的 PBS 洗涤细胞，然后在 400 × g 4 °C下离心5分钟。
  17. 弃去上清液，将细胞重悬于250 µL固定缓冲液中，于4 °C避光孵育40–60分钟。
    注意：固定缓冲液随Foxp3/转录因子染色缓冲液提供，为4倍浓度储存液，需用破膜稀释液稀释后使用。
  18. 加入1 mL 1×透化缓冲液，通过在300 × g离心洗涤细胞2次 g，4 °C 下 5 分钟。
  19. 弃去上清液，将细胞重悬于200 µL透化缓冲液中，并向细胞中加入抗体（Foxp3 [核内]，1:200）。固定并破膜后，在4 °C下避光孵育细胞-抗体混合物40–60分钟，期间偶尔短暂振荡。
    注意：透化/洗涤液为10倍浓缩液，使用前需用PBS稀释。

4. 致病性 Th17 细胞的诱导 体外

  1. 使用前，从预包被的24孔板中移除无菌PBS。
  2. 使用Th17细胞培养基（表1）和对照培养基进行培养，包括Th0细胞培养基（表1）、经典非致病性Th17培养基（表1）和经典致病性Th17培养基（表1）。将富集的初始CD4+ T细胞重悬，并以相同浓度（调整至4 × 105 个细胞/mL，每孔1 mL培养基）分装至同一24孔板的不同孔中（已包被抗CD3抗体）。
  3. 向每孔中加入1 µL/mL抗CD28溶液（终浓度：用培养基稀释至2 µg/mL）。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养5天。
  4. 在第2天，通过轻柔吹打使细胞均匀分布，小心吸去一半含细胞的培养上清，然后加入等体积的新鲜培养基（Th0、非致病性Th17、致病性Th17及目标Th17培养基）；第4天重复此操作。
  5. 第5天在光学显微镜下观察细胞（图2）。收集各组细胞上清液，并于-80 °C冷冻保存。

5. 致病性 Th17 和 Th0 细胞分化的流式细胞术分析

  1. 培养5天后收集所有细胞（每孔）。执行步骤3.12-3.15。
  2. 加入抗体混合液（可固定活力染料，1:1,000；抗CD4抗体，1:200），在4 °C避光孵育15-20分钟。
  3. 执行步骤3.17-3.19。
  4. 弃去上清液，将细胞重悬于200 µL破膜缓冲液中，并向细胞中加入抗体混合液（IL-17A [胞内]，1:200；RORγT [核内]，1:200）。固定并破膜后，在4 °C下避光孵育细胞-抗体混合物40-60分钟，期间偶尔短暂振荡。
  5. 加入1 mL 1×破膜/洗涤液洗涤细胞两次，于4 °C以400 × g离心5分钟，然后弃去上清液。
  6. 在流式细胞仪上检测细胞，并使用软件分析数据（图3）。
    1. 打开流式细胞仪，启动自动清洁和校准程序。
    2. 选择本实验所用的激光通道，设置空白管、单染管和样品管。
    3. 点击仪器上的空白管选项并进行测试，调节电压使细胞事件尽可能位于采集框中心。
    4. 采集单染管细胞，对相应通道进行光谱检测，以确认荧光抗体添加正确。
    5. 点击解混按钮，让仪器自动调整光谱补偿。对于其他流式细胞仪，正常调节荧光补偿即可。
    6. 采集各样品管细胞，将数据保存为FCS文件格式并导出。在相应的流式细胞术数据分析软件中进行分析和作图。
      1. 通过FSC-H和FSC-A的对角线圈门圈选主要细胞群，去除可能的细胞黏连。
      2. 根据FVS阴性圈选区域圈选活细胞；随后圈选CD4+细胞群。
      3. 构建十字门，横轴为IL-17A，纵轴为RORγT；Q2区域的双阳性细胞即为Th17细胞群。

6. 酶联免疫吸附测定（ELISA）检测不同培养基诱导的IL-17A分泌

  1. 解冻第4.5节中收集的冻存细胞上清液。
  2. 将100 µL稀释后的标准品、空白样品和待测样品分别加入指定的孔中。使用封板膜覆盖酶标板，并在37 °C下孵育90分钟。
    注意：将溶液加入微孔板孔底时，避免接触孔壁内侧或产生气泡。
  3. 倾去各孔中的液体，立即每孔加入100 µL生物素化检测抗体工作液。更换新的封板膜覆盖酶标板，在37 °C下孵育1小时。
  4. 倾去孔内溶液，每孔加入350 µL洗涤缓冲液。1分钟后，吸去或倾去各孔中的液体，并将酶标板倒扣在干净的吸水纸上拍干。重复此洗涤步骤3次。
  5. 每孔加入100 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记的结合物工作液。更换新的封板膜覆盖酶标板，在37 °C下孵育30分钟。
  6. 倾去各孔中的溶液，并按照步骤6.4所述方法重复洗涤5次。
  7. 每孔加入90 µL底物试剂，更换新的封板膜，在37 °C避光孵育约15分钟。
    注意：反应时间可根据实际显色情况适当调整，但不应超过30分钟。在测定OD值前，让酶标仪预热约15分钟。
  8. 按与底物溶液相同的顺序，每孔加入50 µL终止液。
  9. 立即使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD值）。
  10. 获取标准品及样品重复孔的OD值，减去空白孔的OD值以得到校正后的数值。然后以浓度为横坐标、OD值为纵坐标进行线性拟合。根据拟合方程计算各样品孔中IL-17A的浓度值。
    注意：分化培养4天后，各组上清液中IL-17A的含量如图4所示。拟合方法可参考Orgin21软件。本实验所得标准曲线的R2值为0.9946。

7. 通过定量PCR（qPCR）检测特征基因表达分析T细胞分化

注意：为了排除染料和固定/破裂作用导致流式细胞仪检测不稳定的可能性，我们通过qPCR检测了特征性基因的表达，以在转录水平阐明致病性Th17细胞的分化效应。

  1. 在T细胞培养结束时测定细胞数量。将细胞收集到1.5 mL离心管中，在400 × g条件下离心5分钟，小心弃去所有上清液。
  2. RNA提取
    注意：提取过程必须在通风橱或超净工作台中进行，以避免RNA酶污染。
    1. 向样品管（步骤7.1）中加入500 µL裂解缓冲液（例如，用于1–2 × 106个细胞），立即振荡混匀直至无细胞团块，室温静置1分钟。
    2. 将混合液加入置于收集管中的吸附柱中，在13,400 × g条件下离心30秒，弃去滤液。
    3. 首次使用前，在洗涤缓冲液瓶中加入指定体积的无水乙醇。向吸附柱中加入500 µL洗涤缓冲液，在13,400 × g条件下离心30秒，弃去滤液。
    4. 重复步骤7.2.3的洗涤操作。
    5. 将吸附柱RA放入空的收集管中，在13,400 × g条件下离心2分钟，以去除残留的洗涤液。
      注意：必须彻底去除洗涤液，防止其中残留的乙醇抑制下游反应。
    6. 取出吸附柱RA，放入洁净的无RNase离心管中。向吸附膜中央加入50 µL无RNase的H2O，室温静置1分钟，然后在9,600 × g条件下离心1分钟。
  3. 测定RNA的纯度和浓度。
  4. 按照试剂盒说明书合成第一链cDNA。
    1. 去除基因组DNA。取500 ng提取的模板RNA置于无RNase的离心管中；加入无RNase的ddH2O和4x gDNA去除混合液，配制成反应体系。用移液器轻轻混匀后，置于42 °C水浴中孵育2分钟。
      注意：反应体系的总体积及各组分加入量与RNA浓度相关，请详细参考说明书。本实验采用20 µL反应体系。
    2. 在上一步的反应管中直接加入5x逆转录反应体系。取4 µL逆转录反应体系与上一步中的16 µL混合液，用移液器轻轻混匀。
      注意：逆转录体系已包含所有必需的逆转录酶，为预配置的直接使用体系。
    3. 设置逆转录反应程序：37 °C反应15分钟，85 °C反应5秒，最后降温至4 °C。
  5. 按照试剂盒说明书配制PCR反应体系。
    1. 在qPCR管中加入10 µL 2x PCR反应酶混合液、0.4 µL引物1、0.4 µL引物2、0.4 µL 50x ROX参比染料1、2 µL模板cDNA以及6.8 µL ddH2O，配制成20 µL的总反应体系。
    2. 在实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应条件如下：第一阶段，95 °C预变性30秒，循环1次；第二阶段，95 °C变性10秒，60 °C退火延伸30秒，循环40次；第三阶段，95 °C变性15秒，60 °C退火1分钟，95 °C熔解15秒，循环1次。
      注意：在分化培养4天后，初始CD4+ T细胞中Il17a、Il17f、Rora和Il23r的相对表达水平如图5所示。

结果

本实验方案基于关于致病性 Th17 细胞分化的前期研究而建立。实验的第一步是检测通过磁珠分选法从小鼠脾脏分离的初始型 CD4+ T 细胞的纯度，这是后续成功诱导致病性 Th17 细胞分化的基础。我们使用表面标志物 CD62L23 和 CD4424 来检测初始型 CD4+ T 细胞的纯度，同时以 FOXP325 作为调节性 T 细胞（Treg）的标志物。我们发现，分选后 Treg 细胞的比例显著降低，初始型 CD4+ T 细胞的纯度可达到至少 95%（图 1）。为了比较致病性 Th17 细胞的分化情况，将初始型 CD4+ T 细胞分别在 Th0 培养基（表 1）和 Th17 分化培养基（表 1）中培养，共培养 5 天。结果发现，T 细胞在 Th0 和 Th17 培养基中均呈现集簇生长状态（图 2）。

接下来，对细胞进行固定、通透化处理，并基于流式细胞术，使用针对多种细胞因子的抗体对分化后的CD4+ T细胞进行标记。我们检测了Th17细胞分化的标志性细胞因子IL17A26和RORγT27，结果发现，在新型Th17细胞培养基的刺激下，90%的初始CD4+ T细胞成功分化为致病性Th17细胞（图3）。图5展示了通过PCR检测到的Th17细胞特征性基因，证实了我们通过体外分化获得的致病性Th17细胞能够稳定表达这些标志性分子。

流式细胞术示意图；CD4-FITC、Foxp3-PE 分析；细胞分离前/后的结果。
图 1：C57BL/6J 小鼠在初始 CD4+ T 细胞分离前后特征性细胞因子分析的设门策略。缩写：FSC-H = 前向散射峰值高度；SSC-H = 侧向散射峰值高度；FSC-A = 前向散射峰值面积；FITC = 异硫氰酸荧光素；PE = 藻红蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

在50 μm尺度下比较细胞培养物A和B形态的显微镜图像。
图2：小鼠初始CD4+ T细胞在致病性Th17和Th0条件下培养5天的代表性图像。 （A）Th0细胞；（B）致病性Th17细胞。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术示意图；Th0至Th17细胞培养分析；CD4-FITC、IL-17A-PE、RORγT-APC标记物。
图3：Th0细胞培养基与Th17细胞培养基诱导分化后的流式细胞术分析。 缩写：FSC-H = 前向散射峰值高度；SSC-H = 侧向散射峰值高度；FSC-A = 前向散射峰值面积；FITC = 异硫氰酸荧光素；PE = 藻红蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

Th0、Th17-Non、Th17-path 和 Th17-new 细胞上清液中 IL-17 水平的柱状图；标示出统计学显著性。
图 4：Th0 细胞和诱导分化后 Th17 细胞培养上清液中 IL-17A 的含量。 请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达比较，四张图表，Th0 与 Th17；Il17a、Il17f、Rora、Il23r mRNA 水平。
图 5：C57BL/6J 小鼠分化的 CD4+ T 细胞中特征性细胞因子表达水平的代表性结果。 请点击此处查看该图的放大版本。

 靶向致病性 Th17 细胞培养基Th0 细胞培养基经典非致病性 Th17 细胞培养基经典致病性 Th17 细胞培养基。
试剂终浓度 用量终浓度 用量终浓度 用量终浓度 用量
青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩）1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
胎牛血清10%5 mL10%5 mL10%5 mL10%5 mL
β-巯基乙醇50 μM50 μL50 μM50 μL50 μM50 μL50 μM50 μL
GlutaMAXTM 补充剂（100倍浓缩）1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
丙酮酸钠溶液（100倍浓缩）1 mM500 μL1 mM500 μL1 mM500 μL1 mM500 μL
抗小鼠 IFN-γ 抗体（1 mg/mL）5 µg/mL250 μL10 µg/mL500 μL10 µg/mL500 μL
抗小鼠 IL-4 抗体（2 mg/mL）5 µg/mL125 μL5 µg/mL250 μL10 µg/mL250 μL
小鼠重组 IL-1β（20 µg）20 ng/mLNA
小鼠重组 IL-6（20 µg）20 ng/mLNA50 ng/mLNA50 ng/mLNA
小鼠重组 IL-23（50 µg）50 ng/mLNA10 ng/mLNA
小鼠 TGF-β（100 µg）3 ng/mLNA1 ng/mLNA1 ng/mLNA
 小鼠 IL-2（5 µg）20 ng/mLNA
RPMI 1640 培养基NATo 50 mLNA To 50 mLNATo 50 mL
总体积NA50 mLNA50 mLNA50 mL

表1：靶向致病性Th17细胞培养、Th0细胞培养、经典非致病性和致病性Th17细胞培养基。

讨论

该方法为增加小鼠脾脏初始CD4+ T细胞数量提供了一种有效的途径 体外 致病性Th17细胞的产生。尽管我们使用的细胞因子种类多于其他已报道的Th17细胞培养体系，但我们致力于优化致病性Th17细胞的生长条件。我们正在考虑进一步优化诱导分化方案。

在此，我们仅使用流式细胞术和定量PCR来检测标志性细胞因子的产生。经过少量细微修改，该方法也可用于其他功能检测，例如细胞增殖。

我们使用中国生产的淋巴细胞分离试剂盒来分离小鼠脾脏淋巴细胞，因为该方法高效且节省时间。基于其他品牌的淋巴细胞分离液也可以通过不同的步骤实现分离小鼠脾脏淋巴细胞的目的。另一种方法是直接裂解所获得的脾细胞悬液中的红细胞；然而，我们发现脾脏中的红细胞往往无法一次完全裂解。

在执行本方案过程中可能会出现一些问题。首先，通过磁珠分选获得的初始型CD4+ T细胞数量可能非常低（方案步骤3）。这可能是由于器官研磨过程不充分所致。确保器官被充分匀浆至关重要。在匀浆过程中增加冲洗频率可提高细胞回收率。为了获得更多脾脏初始型CD4+ T细胞，建议使用较年轻的实验小鼠（6–10周龄）。目前有多种分离脾淋巴细胞的方法，且不同分离液的细胞得率可能存在差异。建议使用经过广泛验证的通用分离液，并尽可能完全地提取淋巴细胞层。

其次，流式细胞术检测到的CD4+ T细胞比例可能<80%（实验步骤5）。造成这一问题的可能原因之一是脾细胞计数不准确，导致细胞数量超过额外添加的抗体混合物和磁珠的处理能力。为提高初始CD4+ T细胞纯化的效率，必须精确进行细胞计数。此外，可比本方案推荐量多使用10%的抗体混合物和磁珠。最后，在分选初始CD4+ T细胞后可立即进行流式细胞术分析。

第三，在培养过程中可能未形成大量T细胞簇，且大部分细胞可能在T细胞分化期间死亡（方案步骤4）。造成该问题的可能原因是接种前对初始CD4+ T细胞数量的测定不准确，导致细胞密度过低。建议采用更精确的细胞计数方法，以达到在48孔板中每孔约4 × 105 个细胞/mL的理想细胞密度。另一个可能的原因是CO2培养箱存在技术问题，例如温度或CO2浓度设置不当。最后，在更换细胞培养基时施加过大的力度也可能导致细胞死亡。

第四，特征性细胞因子基因的相对表达水平可能较低（实验步骤7）。为确保提取的RNA的真实性，建议使用纳米滴定仪检测的浓度超过100 ng/mL。浓度降低的可能原因在于培养细胞状态不佳，例如收集的细胞中大部分已死亡或正处于死亡过程中。为获得真实的RNA浓度，必须解决细胞培养过程中可能导致生长不良的情况。另一个可能的原因是在RNA提取过程中最终获得的细胞数量过少，这可能是由于在弃去上清液时无意中造成细胞丢失所致。采用先进的RNA提取技术，例如一步法RNA提取试剂盒，可能会更有优势。通过Nanodrop测定的理想OD260/OD280比值应在1.9–2.1范围内。若比值过低，则可能存在蛋白质污染。增加无RNase缓冲液的洗涤次数可能有助于缓解此问题。相反，异常低的比值则提示可能存在RNA降解。为应对这一问题，建议使用无RNase的水，并利用1.5 mL离心管进行RNase去污染处理。

总之，本方案描述了使用新型细胞培养基直接诱导初始CD4+ T细胞分化为致病性Th17细胞 体外与直接分离相比，该方法无疑更为直接、经济且高效。培养基的配制也非常简单，使得所构建的Th17细胞可更直观地用于后续实验，为多种疾病的研究提供了良好的细胞模型。

披露

作者声明，本文发表不存在利益冲突。

致谢

本工作由国家关键研发计划（National Key R&中国国家重点研发计划（编号：2022YFC2304604）、国家自然科学基金（编号：81971812）、国家自然科学基金（编号：82272235）、江苏省卫生健康委员会科研基金（编号：ZDB2020009）、江苏省重点研发计划（社会发展）专项（编号：BE2021734）、国家关键研发计划 &科技部重点研发计划（编号：2020YFC083700）、江苏省重症医学重点实验室项目（BM2020004）、国家自然科学基金重点项目（81930058）、国家自然科学基金面上项目（82171717）、中央高校基本科研业务费专项资金（2242022K4007）以及江苏省自然科学基金面上项目（BK20211170）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>抗体
大鼠抗小鼠 CD62L，BV650，克隆 MEL-14，1:200 稀释BD货号：564108；RRID: AB_2738597
大鼠单克隆抗 CD4，FITC 标记，克隆株 RM4-5，1:200 稀释BioLegend货号#100509；RRID: AB_312712
大鼠单克隆抗-IL-17A，PE标记，克隆号 TC11-18H10.1，1:200 稀释BioLegend货号#506903；RRID: AB_315463
大鼠单克隆抗小鼠/人 CD44，APC，克隆 IM&，1:200 稀释度BioLegend货号#103012；RRID: AB_312963
大鼠单克隆抗RORγT细胞，APC，克隆株B2D，1:200稀释Invitrogen货号#17-6981-80；RRID: AB_2573253
大鼠单克隆FOXP3抗体，PE标记，克隆号FJK-16s，1:200稀释Invitrogen货号#12-5773-82；RRID: AB_465936
<强>化学品、多肽和重组蛋白
抗小鼠 CD3 SAFIRE 纯化抗体生物宝石货号#05112-25
Anti-Mouse CD28 SAFIRE 纯化抗体生物宝石货号#10312-25
抗小鼠干扰素γ生物宝石货号#80822-25
抗小鼠 IL-4生物宝石货号#81112-25
乙醇西龙科学Cat#64-17-5
胎牛血清Gibco货号#10437-028
FcR封闭试剂Miltenyi Biotec货号#130-092-575
GlutaMAX 补充剂gibco货号#35050079
小鼠 rIL-1βSino Biological货号#50101-MNAE
小鼠 rIL-6Sino Biological货号#50136-MNAE
小鼠 rIL-23Sino Biological货号#CT028-M08H
小鼠 TGF beta 1Sino BiologicalCat#50698-M08H
PBSProcell货号 PB180327
重组小鼠 IL-2peprotech货号#212-12
含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基Gibco货号#11875-119
青霉素-链霉素溶液Gibco货号#15070063
β-巯基乙醇Sigma-Aldrich货号#M6250-100ML
<强>关键商业检测试剂盒
动物器官淋巴细胞分离液试剂盒待定科学货号#TBD0018SOP包含动物脾脏组织淋巴细胞分离液、组织样本稀释液（货号 2010C1119）、样本清洗液（货号 2010X1118）、样本洗涤液（货号 TBTDM-W）、组织匀浆冲洗液（F2013TBD）
ChamQ SYBR qPCR 预混液（高 ROX 预混）Vazyme货号 Q341-02https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html
固定/透化浓缩液invitrogenCat#00-5123-43
固定/通透稀释液invitrogen货号#00-5223-56
可固定的活力染料 EF506invitrogen货号#65-0866
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（含gDNA清除剂）Vazyme货号 R223-01https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html
白细胞激活混合物BD货号#550583
小鼠IL-17A（白细胞介素17A）ELISA试剂盒Elabscience®货号#E-EL-M0047
Naïve CD4+ 小鼠T细胞分离试剂盒STEMCELL货号#19765EasySep试剂盒包含小鼠CD4+ T细胞分离混合液［货号19852C.1］、小鼠记忆T细胞去除混合液［货号18766C］、链霉亲和素RapidSphered 50001［货号50001］、正常大鼠血清［货号13551］；仅大鼠血清需保存于-20℃ °C；其他组分应保存在2-8℃ °C.
通透缓冲液invitrogen货号#00-8333-56
SPARKeasy 细胞RNA试剂盒Sparkjade货号#AC0205-Bhttps://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
<强>实验模型：生物体/品系
小鼠：C57BL/6集萃药康Cat#000013
<强>寡核苷酸
小鼠 Il17a TaqMan 引物及探针ribobioNA
小鼠 Il17f TaqMan 引物及探针ribobioNA
小鼠 Il23r TaqMan 引物及探针ribobioNA
小鼠 Rora TaqMan 引物及探针ribobioNA
β-肌动蛋白TaqMan探针引物ribobioNA
<强>软件与算法
Cytek AuroraCytekhttps://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
GraphPad Prism 9GraphPad Softwarehttps://www.graphpad-prism.cn
<强>其他
1 mL 注射器请NA
1.5 mL 离心管Eppendorf货号 MCT-150-C
5 mL 圆底管康宁货号#352235
15 mL 离心管NEST货号#601052
48孔组织培养板（平底）康宁货号#3548
50 mL 离心管NEST货号#602052
70 µm 细胞滤筛Biosharp货号#BS-70-XBS
96孔无裙边qPCR板VIOX scientific货号#V4801-M
100 mm 培养皿康宁货号#430167
离心Eppendorf5425R
细胞培养用CO2培养箱赛默飞世尔科技HEPA Class100
Cytek AuroraCytekNA
解剖剪真实世界数据S12003-09
血细胞计数板AlphaCell货号#J633201
NanoDrop 2000 分光光度计赛默飞世尔科技ND-2000
实时荧光定量PCR系统罗氏LightCycler96
手术镊真实世界数据F12005-10
热循环仪伯乐（Bio-Rad）C1000 Touch

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Th17
小鼠初始CD4+ T细胞体外分化为致病性Th17细胞
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