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方法文章

Longa 大脑中动脉阻塞法在完全再灌注中的优化

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DOI：

10.3791/66720

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2024年11月22日

 ,  , 
1Department of Histology and Embryology, University of Zagreb School of Medicine, 2Croatian institute for brain research, University of Zagreb School of Medicine

本文内容

摘要

本方案为研究人员提供了使用改良Longa颈外动脉法在小鼠上进行大脑中动脉阻塞手术的逐步操作指南。本文介绍的改良方法旨在提高大脑中动脉阻塞的准确性，并确保完全再灌注。

摘要

大脑中动脉阻塞模型是研究缺血性脑卒中的主要动物模型。尽管该模型已在研究中使用了三十多年，但其标准化程度仍显不足。该手术主要在大鼠和小鼠上进行，而由于小鼠体型更小且更为脆弱，操作难度较大。与Koizumi法通过颈总动脉插线不同，Longa法通过颈外动脉插线是目前唯一能够确保缺血后完全再灌注的血管内线栓脑卒中模型。这一特点对于研究再灌注现象具有重要意义。本文所展示的手术改良方法可确保在整个缺血期及再灌注开始后，颈总动脉的血流持续通畅。这些改良的目的是在缺血期间，选择性地阻塞大脑中动脉，同时保持其近端分支的灌注不中断。此外，再灌注的启动迅速且可精确控制，从而更准确地模拟人类医学中的血管内取栓治疗。本文通过提供这一全面的视频文章，旨在帮助新外科医师的培训，并推动科学界内手术操作的标准化。

引言

脑卒中是导致死亡的第二大原因，也是导致死亡和残疾的第三大原因1。通过 其病因不同，脑卒中可分为缺血性和出血性，其中缺血性脑卒中在临床实践中更为常见。缺血性脑卒中是由于向脑组织供血的动脉发生阻塞，导致脑组织缺血、细胞死亡和炎症反应。自溶栓治疗和机械取栓等再灌注疗法问世以来，脑卒中的治疗已取得重大进展。然而，所有再灌注疗法均存在加重患者病情的风险，可能引发通常所说的再灌注损伤。2再灌注损伤的确切机制尚不明确，需要通过临床前研究来确定其潜在原因和预防措施。为此，建立一个与缺血性卒中后相符合的再灌注损伤动物模型变得至关重要。

大脑中动脉闭塞（MCAO）是研究缺血性脑卒中最常用的动物模型。该模型主要在啮齿类动物中实施，迄今为止科学文献中已描述了多种不同的操作变体3,4。其中两种主要类型为Koizumi法和Longa法，也称为颈总动脉（CCA）和颈外动脉（ECA）入路变体，其技术上的主要区别在于插入线栓时的动脉切开部位5,6。在我们最近的研究中，通过in vivo血管灌注监测发现，只有Longa法才可真正被视为脑缺血/再灌注模型7。该操作包括将线栓插入颈外动脉（ECA），经颈内动脉（ICA）推进，并固定于大脑中动脉（MCA）分叉处，以诱导脑组织缺血。在设定的缺血时间结束后，撤出线栓以实现再灌注，从而模拟一过性脑缺血过程。脑卒中发生后，研究中最常采用的主要结局指标是梗死灶体积，可通过ex vivo组织学方法或in vivo脑部扫描进行测量。MCAO模型面临的主要挑战在于其可重复性较低，这归因于不同变体、不同操作者以及不同个体之间的变异，其中个体间差异在临床前脑卒中研究中构成了重要限制因素4。

此外，啮齿类动物在大脑中动脉阻塞（MCAO）后，梗死区域相对于啮齿类动物脑的大小而言非常广泛。同时，尽管脑的海马后部区域主要依赖于来自大脑后动脉（PCA）的血流供应，而非大脑中动脉（MCA），这些区域仍常常被纳入梗死范围8。与文献中描述的Koizumi法和Longa法类似，由于小鼠Willis环存在不完全通畅 ，在缺血期间颈总动脉（CCA）保持结扎状态，导致诱导的缺血区域远比预期广泛5,6,9。即使在缺血结束后重新开放或修复CCA的方法中，通常30至60分钟的缺血时间仍会导致非MCA供血区域发生不可逆的组织损伤10。此外，与预期相反，先前的研究表明，栓线硅胶涂层的长度对梗死体积并无影响11。然而，关于栓线硅胶涂层长度的选择，迄今仅在缺血期间结扎CCA的模型中被探讨过。

本方法的目标是改进小鼠的Longa MCAO方法，使缺血期间颈总动脉（CCA）的血流保持持续通畅，从而提高大脑中动脉阻塞（MCAO）的选择性，并确保术后梗死区域完全再灌注。这些改进将显著有利于针对小鼠缺血-再灌注损伤的纵向研究，降低死亡率并减少个体间差异。

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方案

所有动物操作和实验程序均经萨格勒布大学医学院伦理许可委员会以及克罗地亚共和国农业部科学用途动物保护伦理委员会批准。实验操作依据克罗地亚《动物保护法》（NN 102/17，32/19）、《动物保护法修正案》（NN 37/13）以及《科学用途动物保护指南》（NN 55/13）进行，上述法规与《欧洲实验动物护理与使用指南》（指令 2010/63/EU）一致。

1. 动物和手术部位的准备

  1. 将动物放入击晕盒中，使用5%体积的异氟烷与氧气/氮气混合气体（比例为1:2）诱导麻醉。
  2. 目视检查动物的意识状态和呼吸频率后，将其转移至实验室天平上称重。
  3. 通过夹捏后肢趾间皮肤检查反射，以确认麻醉深度适当。
  4. 将动物置于加热手术台上，并将其鼻部置于麻醉面罩中。初始设置手术台温度为36 °C，并根据后续步骤中直肠探头测得的体温调节至维持动物体温在37 °C。在后续所有步骤中，调节异氟烷的体积分数，使动物呼吸频率保持在100次/分钟。
    注意：所有与动物直接接触的表面和材料在操作前必须彻底消毒。
  5. 在动物眼部涂抹眼膏，以防止脱水和异氟烷气体的刺激。
  6. 将动物仰卧位放置，并在其颈部下方垫一小块由手术胶带制成的枕头，以伸展颈部。
  7. 使用手术胶带固定动物四肢。注意不要过度拉伸前肢，以免意外导致肩关节脱位。
  8. 使用凡士林润滑直肠探头，并将其插入直肠以进行连续体温监测。使用手术胶带将探头与尾巴一同固定。
  9. 术前经腹腔注射生理盐水和布托啡诺（0.5 mg/kg），以维持动物术中充分水化和镇痛。
  10. 使用无线动物电推剪剃除动物颈部区域的毛发。用手术胶带收集所有剃下的毛发。再用剃刀进一步剃除该区域毛发，确保完全无毛。
  11. 根据测得的动物体重和/或年龄选择合适的MCAO栓线。将其从容器中取出，放入培养皿中置于显眼位置。在栓线的硅胶部分滴加一滴生理盐水，以保持其清洁无尘。
    注意：对于12至16周龄的小鼠，栓线硅胶涂层的厚度应根据制造商的官方建议选择。此外，硅胶涂层的长度应根据拟阻塞的灌注区域大小提前仔细规划（见讨论部分）。
  12. 在手术台上铺上干净的手术单。
  13. 在动物已剃毛的皮肤上滴加一滴碘伏。使用棉签从内向外以环形方式将消毒剂涂抹入皮肤。随后，用浸有乙醇的棉签重复相同操作。每次重复均使用新的无菌棉签，共重复3次。
  14. 在消毒后的未来切口部位涂抹少量利多卡因凝胶，以实现局部伤口镇痛。

2. 缺血诱导手术

  1. 使用手术刀在已消毒的皮肤上做初始切口。尽量减少皮肤切口的次数，以利于手术伤口的愈合。
    注意：所有器械必须事先经过灭菌处理。读者应参考所在机构关于使用无菌或外科手套的指导规范。
  2. 使用7号和5号镊子，撕开浅筋膜，并将唾液腺从下方组织中分离。
    注意：操作时应始终保持镊子闭合前进，移动时再张开以推开组织。这样可以在最小组织损伤的情况下穿过解剖间隙。
  3. 将金属牵开器置于初始位置，同时确保唾液腺不会干扰后续操作步骤。
  4. 使用7号镊子去除深部颈筋膜，并将胸锁乳突肌从颈动脉区域分离，以便重新定位牵开器。
  5. 重新调整牵开器位置，使其位于胸锁乳突肌下方，以暴露颈动脉区域。
  6. 切除肩胛舌骨肌，以便清晰观察并更方便地接近颈动脉区域。
  7. 将颈总动脉及其分支从包裹在颈动脉鞘内的颈静脉和迷走神经中游离出来。
    注意：必须小心去除该筋膜，避免损伤迷走神经或引起明显出血。
    1. 用镊子夹住颈动脉三联结构外侧的颈动脉鞘，轻轻向外牵拉，以清晰辨认动脉、神经、静脉及周围所有血管分支。
    2. 在向外牵拉筋膜的同时，使用5号镊子将颈总动脉（CCA）从邻近的神经和静脉中分离，直至分支点以及跨越CCA上方的甲状腺上静脉处。
    3. 使用弯头7号镊子将CCA下段完全从下方组织和筋膜中分离，确保其已准备好供后续步骤夹闭。
    4. 沿CCA分支点以上区域向头侧推进，使用两把镊子撕开颈动脉鞘。
    5. 同样地，将颈动脉鞘的游离端分别向内侧和外侧牵拉，精确地将颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）从筋膜及周围组织中分离。
    6. 使用弯头7号镊子将ECA和ICA从下方组织中完全游离。
  8. 在颈总动脉及其两个分支已妥善分离后，用弯头7号镊子提起颈外动脉（ECA），并用N0型自闭合镊子夹闭。
  9. 小心将N0型自闭合镊子放低至手术台面。
    注意：如需调整ECA的夹闭位置，有时需略微松开镊子，并将ECA分支点向尾侧推动。此时应确保ECA夹闭点与分支点之间保留超过1 mm的ECA长度。
  10. 在ECA被N0型镊子牢固夹闭并固定后，将两根编织丝线从ECA后方穿过。
    注意：头侧丝线用于结扎打结，必须置于夹闭点的头侧。
  11. 将头侧丝线完全打结固定（此为永久结扎），然后用剪刀剪除多余线头。
  12. 将尾侧丝线打成一个松结作为固定结。
    注意：该结应靠近ECA分支点，并保持松散状态，以便MCAO线栓通过。
  13. 使用血管微夹夹闭颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA），以防止动脉切开后出血。
    注意：必须确保用于CCA的微夹具有足够夹持力，因为CCA是一条搏动性强、血流量大的动脉，若夹闭不牢，可能导致严重出血，甚至动物死亡。
  14. 使用显微弹簧剪，在ECA夹闭点正下方做一小段动脉切开。
    注意：切口应足够大，以便线栓的硅胶部分进入，但不应超过ECA周长的一半，以免影响N0型镊子的夹持张力。
  15. 沿ECA的走向角度，将线栓从动脉切开处向近心端（即朝向CCA方向）插入，穿过ECA分支点处的松结，并进入CCA管腔内。
  16. 收紧固定结，使其紧贴线栓的硅胶部分。
    注意：此步骤需格外小心，因线栓在最后操作过程中容易从ECA中途滑脱，一旦滑出，重新插入将非常困难。
  17. 小心打开ICA的微夹并将其移除。
  18. 在线栓部分插入ECA并已固定的情况下，完成整个动脉切开，使带有MCAO线栓的ECA残端完全游离。此时松开并移除N0型自闭合镊子。
  19. 用一对5号镊子牢固夹住ECA残端并轻微提起。同时用另一把镊子固定已部分插入的线栓，缓慢下压并轻柔牵拉ECA残端，使线栓前端朝向ICA方向。切勿夹持线栓的硅胶部分。
  20. 用镊子固定线栓，缓慢将其沿ICA向Willis环方向推进。
    注意：ICA的第一个分支点也是操作者最容易错过目标MCA分支点的位置。因此，需以轻微外侧角度推进线栓，以引导其进入MCA分支。通过这种轻微外侧角度的推进，线栓可避开翼腭动脉（PPA），更有可能进入Willis环（图1）。

大脑动脉解剖图，显示PPA、ICA、CCA、ECA标签，供教学参考。
图1：大脑中动脉闭塞线栓通过翼腭动脉分支点的示意图。 正确的线栓推进方式（左侧）是将MCAO线栓调整方向，使其紧贴颈内动脉（ICA）的侧壁，并远离翼腭动脉（PPA）的分支点。若未做到这一点（右侧），线栓可能进入PPA，从而无法引起脑卒中。在此情况下，线栓无法推进至应有位置，手术者应撤回线栓，直至其末端在ICA分叉处可见，然后重新开始推进线栓。绿色动脉代表后交通动脉（PcomA），在小鼠中大多不开放。图示使用BioRender.com制作。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 缓慢推进MCAO线栓穿过Willis环，直至感觉到突然增加的阻力。
    注意：此时应观察线栓剩余的长度。在成年小鼠中，线栓应能轻松地从颈内动脉（ICA）分叉点继续推进至少7 mm。
  2. 扎紧固定结，以确保在缺血期间线栓不会移位。
  3. 移除颈总动脉（CCA）夹，并记录时间。
    注意：此时间点标志着缺血开始。
  4. 将MCAO线栓的游离端盘绕放置于颈动脉三角与同侧胸锁乳突肌之间的沟槽内，避免其突出于手术切口外。
  5. 移除金属牵开器，将手术切口边缘拉近对合。静置手术区域数秒钟，使组织恢复至解剖位置。
  6. 使用手术胶带闭合切口，以便在缺血结束后快速重新打开切口。
    注意：若研究人员希望动物在缺血期间苏醒，建议缝合切口，以防切口过早裂开。

3. 缺血期

  1. 使用 MRI 或其他定量灌注测量方法验证手术成功。
    注意：若进行 MRI 扫描，灌注加权成像（PWI）应显示大脑中动脉广泛区域的严重缺血，而弥散加权成像（DWI）应勾画出由于细胞水肿导致表观弥散系数（ADC）降低的区域。
  2. 将动物放入清洁笼具中，直至缺血期结束。

4. 纤维撤出手术

  1. 在预定的缺血时间结束前约5分钟，将动物重新置于手术台上并固定。
  2. 移除缠绕的胶带闭合物，并用金属丝牵开器重新打开手术切口。
  3. 松开MCAO线栓的自由端，使其脱离周围组织以及固定结扎线的末端。
  4. 使用N0型镊子夹住并轻轻向腹侧牵拉ECA残端边缘，使其受到张力。小心地将夹持镊子逐渐下移，操作方式类似于第一次手术步骤。
    注意：操作者必须避免夹住固定结，否则将导致结无法解开。
  5. 再次使用微血管夹夹闭CCA。
  6. 使用5型镊子松开固定结，以便撤出线栓。
    注意：开始松解结的最佳方法是持续夹住结直至其分解为单独部分，然后将线头推向结的方向。
  7. 缓慢撤出MCAO线栓，直至硅胶部分开始从ECA残端露出。略微收紧固定结，为完全撤出线栓做好准备。
  8. 当接近线栓的硅胶末端时，收紧固定结，使其在一次操作中将MCAO线栓推出并同时闭合ECA残端。在线栓完全滑出后，彻底扎紧结。
  9. 打开并同时移除夹持镊子和CCA夹。
    注意：这标志着缺血期的结束和再灌注过程的开始。
  10. 移除金属丝牵开器，再次将手术切口边缘对合。
  11. 从切口边缘开始缝合手术切口，完全闭合伤口，确保无皮下组织外露。
    注意：所需缝线数量取决于手术切口的大小。
  12. 使用酒精擦拭片清洁并消毒手术部位。

5. 术后护理

  1. 将动物放入清洁的笼子中，使其从麻醉状态自然苏醒。
  2. 将颗粒饲料置于笼底以便取食，并用饮用水将饲料颗粒润湿。另取一小培养皿盛装饮用水，一同放入笼内底部。
  3. 在接下来的48小时内，每24小时通过腹腔注射0.25 mL生理盐水配制的布托啡诺（0.5 mg/kg）。

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结果

术中或术后磁共振成像（MRI）扫描，特别是灌注加权成像（PWI）和/或弥散加权成像（DWI）扫描（图2），可为手术成功提供明确证据。术中PWI显示同侧大脑中动脉（MCA）区域出现严重缺血，从而证实栓线放置已导致完全闭塞。成功手术的术后PWI显示病灶核心区域出现高灌注，同时MCA区域边缘出现一定程度的再灌注。术中DWI病灶与术中PWI所观察到的缺血区域相对应。术后DWI病灶向缺血核心收缩，并伴随表观弥散系数显著降低，使其较术中DWI病灶及周围再灌注脑组织呈现更暗的信号。标准T2解剖成像在术中和术后通常无明显异常表现，除非发生由栓线引起的出血。

（图3）。在这种情况下，PWI和DWI扫描显示不完全或无缺血。

再灌注过程在接下来的48小时内发生，并通过术后第二天进行的MRI扫描确认其发生（图2，第2天的CBF）。PWI扫描显示病灶部位完全再灌注，病灶核心...

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讨论

大脑中动脉阻塞（MCAO）是一种对操作者要求极高且对动物造成显著损伤的手术操作。因此，研究人员必须制定标准操作流程，以最大程度降低卒中严重程度、减少手术失败率，并改善术后动物的福利状况。本MCAO实验方案重点阐述了在小鼠上实施该操作时需要考虑的一些关键环节。

MCAO 手术中栓线的选择会影响所诱导脑卒中病灶的大小和位置，因此是该操作中的关键步骤11。由 Doccol 率先开发的硅胶包被栓线显著降低了栓线诱导出血的发生率，取得了重大进展12。然而，硅胶包被栓线具有多种尺寸和长度，这为新研究人员在为实验动物选择合适的栓线时带来了挑战。尽管栓线制造商通常会提供根据动物体重选择合适直径栓线的指导建议，但硅胶包被的长度通常被认为取决于操作者的个人偏好，且应仅基于操作者的技术水平进行选择。在本研究中，我们主张尽量缩短硅胶包被的长度，以确保所诱导的脑卒中病灶仅局限于大脑中动脉（MCA）供血区域，从而提高实验的可重复性。图4 显示，大脑后动脉（...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。作者与本作品中提及的任何商业名称和商标均无关联。

致谢

本工作由克罗地亚科学基金会项目BRADISCHEMIA（UUP-2017-05-8082）资助；GA KK01.1.1.01.0007由欧洲联盟通过欧洲区域发展基金资助，以及根据资助协议编号KK.01.1.1.07.0071，由欧洲联盟通过欧洲区域发展基金资助，项目"SineMozak。博士生Rok Ister和Marta Pongrac的工作得到了克罗地亚科学基金会“青年研究人员职业发展项目——博士生培训”""的全额支持，该基金由欧洲社会基金通过欧洲联盟资助。实验过程使用安装在手术显微镜上的通用相机支架固定的安卓智能手机进行拍摄。视频材料的剪辑及配音录制均使用Wondershare Filmora视频编辑软件完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10g/100ml 聚维酮碘皮肤溶液生物碱斯科普里N/A
编织丝线缝合线Fine Science Tools18020-60
Dafilon 缝线 5/0 DS16B. BraunC0936154
多洛凯因 20 mg/g 凝胶贾德兰-加伦斯基实验室N/A
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-202 件
Dumont #7 镊子Fine Science Tools11271-30
Dumont N0 自锁式镊子Fine Science Tools11480-11
Durapore 外科手术胶带 1.25 cm × 9.1 m3M7100057169
Durapore 外科胶带 2.5 cm × 9.1 m3M7100057168
外部恒温器Petnap1012536
Halsey持针器精细科学工具12500-12
热珠灭菌器精细科学工具18000-50
虹膜剪精细科学工具14060-10
异氟烷 USPPiramal Critical CareN/A
激光多普勒监测仪穆尔MOORVMS-LDF2
金属宠物加热垫Petnap1012525
微型Vannas弹簧剪Fine Science Tools15000-00
迷你蜂鸟牵开器精细科学工具17000-01
Recugel 眼膏Bausch&LombN/A
S&T B-1 血管微型钳 Fine Science Tools00396-012 件
S&T 微型夹持施力镊子精细科学工具00071-14
施瓦茨微型持针器精细科学工具18052-01
Stemi DV4 体视显微镜Zeiss000000-1018-453
3 mm × 75 mm 加强型无菌胶带皮肤闭合贴3M7100236545
直组织镊Fine Science Tools11023-10
SZX 支架臂OlympusSZ2-STS
Tec III 300 系列校准蒸发器Vaporizer Sales and Service 公司N/A
通用支架类型 2奥林巴斯SZ2-STU2
VetFlo 六通道麻醉工作站Kent ScientificVetFlo-1225适用于O2/N2混合气体调节

参考文献

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