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氧化锌纳米颗粒的制备及其抗菌效果评价

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DOI：

10.3791/66725

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2024年9月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 2Feynman Institute of Technology, Nanomedicine Corporation, 3Department of Chemical Science and Engineering, Tokyo Institute of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Kumoh National Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究采用沉淀法合成了氧化锌纳米颗粒。测试了所合成颗粒对多重耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和铜绿假单胞菌菌株的抗菌效果。

摘要

由于固有的抗生素耐药性，医院内细菌感染已变得日益棘手。医院中多重耐药细菌菌株的出现归因于抗生素的广泛和多样化使用，这进一步加剧了抗生素耐药性问题。金属纳米材料已被广泛研究作为清除抗生素耐药细菌细胞的替代方案。金属纳米颗粒可通过多种机制攻击细菌细胞，例如释放抗菌离子、产生活性氧物种或造成物理破坏，而细菌无法对这些机制产生耐药性。在当前积极研究的抗菌金属纳米颗粒中，氧化锌纳米颗粒因具有生物相容性和抗菌性能而受到关注，且已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。本研究聚焦于成功开发一种沉淀法用于合成氧化锌纳米颗粒，分析这些纳米颗粒的特性，并开展抗菌性能测试。采用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、紫外/可见光谱法以及X射线衍射（XRD）对氧化锌纳米颗粒进行表征。抗菌试验采用肉汤微量稀释法，测试对象为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和铜绿假单胞菌的多重耐药菌株。本研究表明，氧化锌纳米颗粒在抑制抗生素耐药细菌增殖方面具有潜在应用价值。

引言

多重耐药（MDR）细菌感染对全球人类健康构成重大威胁1。由于此类感染可能对患有基础疾病的患者造成致命后果，目前正积极开展研究以应对这一问题2。细菌已进化出多种机制以逃避药物作用。青霉素广为人知，被认为在全球范围内挽救了数百万人的生命，它是一种β-内酰胺类抗生素，可抑制细菌细胞壁的合成3。然而，细菌已通过多种机制（如外排泵、转肽酶改变或通透性降低）进化出中和药物效力的能力4。此外，细菌还可将这些耐药基因传递给下一代，提高后代的存活率，从而加剧耐药菌株的问题5。

耐药细菌的增加导致了多重耐药菌（MDR细菌）的出现，这类细菌通常对多种抗生素具有耐药性。MDR菌株最常出现在医院环境中，在这些场所中，多种细菌长期接触不同抗生素，从而逐渐发展出耐药性。6. 金黄色葡萄球菌，尤其是耐甲氧西林的 S. aureus （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）是一种革兰氏阳性共生细菌，可在约30%人类的皮肤上形成簇状结构7,8耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）于20世纪60年代首次被发现，对β-内酰胺类抗生素的敏感性降低，导致自20世纪90年代以来感染率急剧上升9在革兰氏阴性菌中 铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa是医院内感染最常见的菌株之一。该物种为一种兼性厌氧的杆状细菌，可在人类中引起机会性感染10特别是那些直接影响人类健康的耐多药菌株，导致了超过50%的医疗相关感染。11在本研究中，我们采用了医院内最常见的多重耐药菌株——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA） 和 P. aeruginosa.

为应对抗生素耐药性问题，纳米颗粒（NPs）在抗菌领域的应用已得到广泛研究。特别是金属纳米颗粒，可通过多种机制诱导细菌细胞死亡，为解决药物耐药性问题提供了潜在方案。金属纳米颗粒的抗菌作用机制包括释放抗菌离子、产生活性氧（ROS）以及对细胞造成物理性破坏等多种途径12。由银、铜、氧化锌（ZnO）和二氧化钛组成的纳米颗粒具有高效的抗菌性能，因此正受到积极研究13。

氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于人体。相比之下，尽管银和铜纳米颗粒具有高效的抗菌性能，但其在人体中的应用因其高细胞毒性而受到限制。然而，氧化锌纳米颗粒在日常生活中普遍存在，甚至存在于广泛使用的防晒霜配方中14。值得注意的是，氧化锌纳米颗粒释放的 Zn2+ 离子在细菌治疗中具有高效作用，可通过产生活性氧（ROS）及其他物理损伤机制诱导细菌细胞死亡15。

本研究概述了采用沉淀法合成氧化锌纳米颗粒（NPs）的实验方案，并介绍了一种利用微孔肉汤稀释法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和P. aeruginosa临床样本进行抗菌性能检测的方法。氧化锌纳米颗粒的沉淀法是通过调节pH值和温度，使用可溶性前驱体（如乙酸锌或硝酸锌）生成不溶性固态氧化锌纳米颗粒16。该方法不仅操作相对简便、生产速度快，而且能够保证合成过程的可重复性，并实现对颗粒尺寸和形貌的有效调控17。在本实验方案中，采用氢氧化钠（NaOH）作为最常用的沉淀剂之一，用于沉淀乙酸锌，同时加入少量十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）以抑制纳米颗粒的非可控性生长18。在多种抗菌检测方法中，本研究采用微孔肉汤稀释法评估氧化锌纳米颗粒的抗菌活性，该方法可避免金属氧化物纳米颗粒带来的光学干扰，并可通过直接计数菌落来确定最小抑菌浓度（MIC）19。

方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 氧化锌纳米颗粒的制备

  1. 量取 200 mL 无水乙醇，倒入玻璃圆底烧瓶中。
  2. 将圆底烧瓶置于加热套上，在 25–40 °C 条件下持续搅拌。
  3. 在 50 mL 小瓶中称取 500 mg CTAB，加入烧瓶中的乙醇溶液中，搅拌至 CTAB 完全溶解。
  4. 向溶液中加入 1.4 g 乙酸锌，搅拌至完全溶解。
  5. 将加热套温度调至 70 °C，升高溶液温度。
  6. 向混合液中加入 25 mL 0.5 M NaOH 溶液，反应 1 小时，直至澄清溶液变为白色。
  7. 将溶液分装至 50 mL 锥形管中，在室温下以 15000 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。
  8. 向其中一根锥形管中加入 10 mL 蒸馏水，通过超声处理重悬纳米颗粒。将悬浮液转移至另一含有 ZnO 沉淀的锥形管中，重复此步骤，直至所有 ZnO 溶液均收集至同一根锥形管中。
  9. 在室温下以 15000 × g 离心洗涤纳米颗粒 15 分钟，弃去上清液后用蒸馏水重悬。用 pH 试纸检测上清液的 pH 值，并重复洗涤过程，直至上清液 pH 值呈中性。
    注意：当上清液 pH 值达到中性（pH = 7）时，弃去上清液，不再用蒸馏水重悬。
  10. 将样品在 60 °C 下真空干燥 24 小时，得到 ZnO 纳米颗粒粉末。

2. 使用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）进行的抗菌测试 P. aeruginosa

  1. 细菌培养
    注意：临床多重耐药（MDR）细菌菌株来自韩国首尔的中央大学医院。
    1. 从超低温冰箱中取出保存在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和P. aeruginosa菌株。
    2. 将细菌溶液解冻后，使用一次性接种环将溶液划线接种至胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上。将划线后的琼脂平板放入培养箱中，37 °C 培养 24 小时。
      注意：使用细菌接种环从 TSA 平板上挑取单个菌落，接种至含有 10 mL TSB 培养基的 50 mL 锥形管中，37 °C 需氧条件下培养 24 小时。
    3. 为测定细菌溶液浓度，使用蒸馏水对培养液进行 10 倍系列稀释至 10-6。随后，取 50 µL 稀释液滴加至 TSA 平板上，并使用 L 形涂布棒均匀涂布。
    4. 将平板置于培养箱中培养 24 小时。
      注意：通过光学计数菌落，并将菌落数乘以稀释倍数，计算培养液的浓度。
  2. 细菌处理
    1. 为测试多种 ZnO 浓度，使用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）配制 2 mg/mL 的 ZnO 纳米颗粒（NPs）溶液，并进行 2 倍系列稀释以获得不同浓度。
      注意：测试的浓度分别为 1000 µg/mL、500 µg/mL、250 µg/mL、125 µg/mL 和 62.5 µg/mL。
    2. 向 96 孔板中每孔加入 100 µL 不同浓度的 ZnO NPs 溶液。
      注意：ZnO NPs 的终浓度应为所需终浓度的两倍（2x），因为每孔将加入 100 µL 细菌培养液，导致两倍稀释。使用 2% 抗生素-抗真菌素（A/A）溶液作为阳性对照，DPBS 作为阴性对照。A/A 是青霉素和链霉素的复合物，分别对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有效。
    3. 使用 TSB 培养基将细菌培养液稀释至 1 × 106 CFU/mL，并向含有不同浓度 ZnO NPs 的各孔中加入 100 µL。
      注意：MRSA 和 P. aeruginosa 初始培养液浓度为 3 × 109 CFU/mL。通过将培养液稀释 1/20 和 1/150，获得 1 × 106 CFU/mL 的细菌浓度。与 100 µL ZnO NPs 混合后，细菌终浓度为 5 × 105 CFU/mL。
    4. 将 96 孔板置于 37 °C 培养箱中，培养 24 小时。
  3. 细菌涂布
    1. 从每孔中吸取 100 µL 溶液，进行 10 倍系列稀释至 10-6。
      注意：将含 ZnO NPs 的细菌溶液 100 µL 加入 900 µL 无菌蒸馏水中，重复此步骤共 6 次。
    2. 从四个稀释度的溶液中各取 50 µL，分别接种至 TSA 培养基平板上。使用 L 形涂布棒将细菌悬液均匀涂布于琼脂表面。
      注意：使用 100、10-2、10-4 和 10-6 四个稀释度。所有实验均设三个重复。涂布至液体完全被琼脂吸收。
    3. 将琼脂平板置于 37 °C 培养箱中，培养 24 小时。
  4. 细菌菌落形成单位（CFU）计数
    1. 为每组选择可计数的稀释度。标记可计数平板上的所有菌落，并换算为 CFU/mL 的浓度。
      注意：可计数稀释度指单个平板上菌落数在 20–100 之间的平板。初始计数结果为每 50 µL 中的 CFU 数。使用未稀释细菌溶液的涂布平板，确定潜在的最小杀菌浓度。
    2. 利用所得数据，计算相对于阴性对照组的活菌百分比。
      注意：活菌百分比（%）=   细菌分析方程，浓度百分比计算，科学结果表示。

结果

通过透射电子显微镜（TEM）确认了氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的成功合成，如图1A所示。所获得的ZnO NPs呈圆形，平均粒径为35.35 nm，标准偏差为6.81 nm。通过向乙酸锌溶液中加入NaOH溶液发生双置换反应，观察到这些纳米颗粒的沉淀，其中Zn2+离子发生了水解。

通过动态光散射（DLS）测定，所合成的纳米颗粒的平均粒径和zeta电位分别为130.4 nm和28.92 mV，如图1B所示。DLS测得的ZnO纳米颗粒粒径与透射电子显微镜（TEM）图像结果之间的差异归因于裸纳米颗粒的聚集。正的zeta电位间接证实了ZnO纳米颗粒的成功制备，该电位可使其通过静电作用与细菌细胞表面相互作用，从而可能造成物理损伤。zeta电位的绝对值大小反映了胶体体系的潜在稳定性。当悬浮液中所有颗粒具有较大正值或负值的zeta电位时，颗粒间倾向于相互排斥，从而防止聚集。通常认为，zeta电位大于+30 mV或小于-30 mV的颗粒体系具有较好的稳定性。本研究中合成的ZnO纳米颗粒zeta电位为+28.92 mV，表明其在水中具有相对稳定性20。

采用微孔板读数仪检测了ZnO纳米颗粒（NPs）的吸收光谱，结果显示ZnO在360 nm处具有特定的吸收峰（图1C）。前体乙酸锌在该波长处无特征吸收峰，而ZnO纳米颗粒已知在360–370 nm范围内具有特征吸收峰。合成产物中360 nm处特征峰的存在证实了ZnO纳米颗粒的成功合成21。这些特定的紫外吸收特性验证了ZnO纳米颗粒的直接合成。此外，X射线衍射（XRD）分析（图1D）显示出ZnO特有的明显结晶峰。与标准纤锌矿结构的ZnO纳米颗粒（JCPDS编号：36-1415）相比，所有晶面（1, 0, 0）、（0, 0, 2）、（1, 0, 1）、（1, 0, 2）、（1, 1, 0）、（1, 0, 3）、（2, 0, 0）、（1, 1, 2）和（2, 0, 1）均与标准谱图完全吻合22。

采用微量肉汤稀释法评估合成的氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）对来自韩国首尔中央大学医院的P. aeruginosa和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）临床样本的抗菌效果。拍摄细菌培养图像用于分析。为在相同稀释倍数下直观评估纳米颗粒的抗菌效果，使用未稀释细菌溶液进行涂布平板实验（图2A、B）。采用原始溶液的涂布平板用于确定可能的最小杀菌浓度。由于在两种菌株的最高浓度下仍观察到细菌菌落，因此未实现完全杀菌效果。各组细菌浓度通过可计数的稀释倍数计算得出。将各处理组的存活率与阴性对照组比较后，ZnO NPs对P. aeruginosa和MRSA菌株均表现出明显的抗菌作用。结合已有研究中关于ZnO NPs细胞毒性的浓度范围，通过系列稀释法测试了不同ZnO浓度，起始浓度为已知可诱导毒性的最高浓度1000 µg/mL，逐步稀释至无毒范围62.5 µg/mL23,24。对于P. aeruginosa，ZnO NPs的抗菌活性随浓度增加而增强（图2A）。然而，在起始未稀释（100）细菌培养物中，P. aeruginosa菌落数量的明显减少并不显著。

相反，氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）对革兰氏阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）表现出较强的抗菌活性，细菌菌落形成单位（CFU）显著减少，通过将稀释后的细菌培养物图像与初始未稀释（100）的细菌培养物图像进行比较得以证实。该结果表明，所合成的ZnO NPs对两种细菌菌株均具有抗菌活性，尤其对MRSA菌株的抑制效果更为显著。

纳米颗粒表征示意图；透射电镜图像、粒径分布、动态光散射、zeta电位、X射线衍射分析。
图1：氧化锌纳米颗粒的表征。（A）不同放大倍数下ZnO NPs的透射电子显微镜图像。（B）通过动态光散射（DLS）分析得到的粒径分布（左）和zeta电位分布（右）。（C）使用微孔板读数仪测定的ZnO NPs的吸光度光谱。（D）ZnO NPs的X射线衍射（XRD）分析及其晶型峰。 请点击此处查看该图的放大版本。

铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌受氧化锌纳米颗粒抑制；柱状图与培养皿图像；浓度效应
图2：采用5 x 10⁶5 CFU/mL 细菌菌株 (A) 抗菌试验针对 P. aeruginosa 菌株。B) 抗菌试验针对 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 菌株。N = 阴性对照（DPBS），P = 阳性对照（A/A）。星号表示与对照组相比具有统计学显著性差异，****p ≤ 0.0001。数据表示为三次独立实验（每组设三个复孔）的均值 ± 标准差。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

ZnO 纳米颗粒的合成 通过 沉淀法相对简单直接。采用此方法成功合成氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）时，搅拌至关重要，以确保前驱体（乙酸锌）在溶剂中充分溶解。此外，升高温度有助于促进双置换反应的顺利进行。在ZnO NPs的合成过程中，决定颗粒尺寸和形貌的因素众多，包括沉淀剂的种类、沉淀剂的浓度以及表面活性剂的使用。使用NaOH以外的沉淀剂可改变颗粒的形貌。正如Gharpure等报道所示。25，当氢氧化铵（NH4OH）用于在不同表面活性剂存在下沉淀乙酸锌，所得颗粒主要呈锥形和三角形。即使使用氢氧化钾（KOH）进行合成，也难以观察到球形颗粒。26这一观察结果证实，使用 NaOH 沉淀有助于合成具有圆形形貌的 ZnO 纳米颗粒。

本研究中，由于氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）在生物医学应用中的潜力以及快速合成方法的开发需求，我们采用少量表面活性剂和NaOH合成了ZnO NPs。结果表明，尽管能够合成出圆形纳米级颗粒，但在未进行额外修饰的情况下，均一球形颗粒的合成仍受到限制27。已知ZnO NPs在非极性溶剂或极性与非极性混合溶剂中分散性良好，但在水中稳定性较差，易发生聚集28,29。由于本实验中ZnO NPs被分散于DPBS中，因此观察到了聚集现象，这从透射电镜（TEM）图像与动态光散射（DLS）测量结果之间的粒径差异即可明显看出。引入诸如3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）等封端剂和偶联剂有望改善其在水中的分散性，但本研究未进行任何修饰，以评估ZnO NPs固有的抗菌性能30。

本研究中报道的ZnO纳米颗粒合成方法不同于微波辅助或溶剂热法，因其无需高温高压条件，且除少量表面活性剂外不涉及任何其他连接剂31,32。该方法合成反应时间仅为2小时，操作简便，易于普及。从生物医学应用的角度出发，本研究采用来自中南大学（Chung-Ang University）的多重耐药（MDR）临床样本评估了ZnO纳米颗粒的抗菌性能，从而确定在真实环境中根除细菌所需的ZnO浓度。与Khan等人的研究相比，在针对P. aeruginosa的实验中，其在60 µg/mL浓度范围内即可清除大部分细菌，而本研究使用的MDR临床菌株表现出更高的存活率33。

采用合成的氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株的抗菌效果进行了评估。鉴于实验过程中细菌的倍增时间较短，首先将纳米颗粒溶液加入96孔板，然后迅速加入细菌溶液至关重要。此外，采用不同稀释度进行培养对于准确测定纳米颗粒的抗菌活性也十分关键。在制备10倍系列稀释细菌溶液时，充分混匀同样至关重要，因此必须仔细进行移液和涡旋振荡操作。然而需要注意的是，该实验流程较为耗时。因此，可在培养前先通过在600 nm处测定吸光度进行初步评估，以大致估算纳米颗粒的抗菌活性。

合成的ZnO纳米颗粒对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株表现出更强的抗菌活性，这可能是由于细菌结构的差异所致。革兰氏阴性菌（如P. aeruginosa）与MRSA在细胞膜结构上有所不同，具体表现为前者具有含脂多糖的双层膜结构，而MRSA则为单层厚肽聚糖膜。这种双层膜结构可能阻碍了抗菌Zn2+离子的渗透，从而提高了P. aeruginosa的存活率。ZnO纳米颗粒因其抗菌特性而被广泛应用，同时也被积极用于防晒产品和皮肤再生领域。因此，未来有望继续开展更多关于ZnO纳米颗粒的多样化研究。

通过表面修饰和多种材料偶联，氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）可应用于多个领域。氧化锌在药物递送、抗菌涂层、癌症治疗以及伤口愈合等方面具有潜在应用价值34。在药物递送中，可通过将抗体等靶向分子与氧化锌纳米颗粒偶联，实现对特定细胞或组织的靶向递送35。此外，由于能够产生活性氧物种，氧化锌纳米颗粒不仅能靶向细菌细胞，还可作用于癌细胞。同时，氧化锌纳米颗粒释放的 Zn2+ 离子以及因活性氧物种而产生的过氧化氢（H2O2）可促进伤口部位的愈合过程36。预计这些潜力将推动大量研究，探索氧化锌纳米颗粒在不同领域的应用。

披露

Jonghoon Choi 博士是纳米医学公司费曼技术研究所的首席执行官兼创始人，Yonghyun Choi 博士是该研究所的首席技术官。

致谢

本研究得到了2022年中央大学研究生研究奖学金（李佳贤女士）的支持。本工作还得到了韩国国家研究基金会（NRF）由韩国政府（MSIT）资助的项目（编号：2020R1A5A1018052）以及由韩国中小企业和初创企业部（MSS，韩国）资助的技术开发项目（项目编号：RS202300261938）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DLSZetasizer Pro
乙醇，纯DAEJUNG4023-2304
酶标仪 BioTeck
氢氧化钠Sigma-Aldrich221465
TEMJEOL JEM-F200
TSADB difco236950
TSBDB difco211825
XRDNEW D8-Advance
乙酸锌Sigma-Aldrich383317

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