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方法文章

将 Naegleria gruberi rDNA 的分子克隆转染入 N. gruberi 滋养体

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DOI：

10.3791/66726

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2024年6月21日

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center, 3Department of Biology, Washburn University

本文内容

摘要

本方案描述了一种转染方法 Naegleria gruberi 滋养体携带一种在连续传代过程中保持稳定的构建体 体外以及通过包囊化和脱囊过程。

摘要

所有Naegleria滋养体的核糖体基因均维持在一个闭合环状的染色体外核糖体DNA（rDNA）包含元件（CERE）中。尽管目前对CERE了解甚少，但对三种Naegleria物种进行的完整基因组序列分析明确表明，其核基因组中不存在rDNA顺反子。此外，在N. gruberi的CERE中已定位到单一的DNA复制起点，支持了CERE独立于核基因组进行复制的假说。这一CERE特性提示，有可能利用工程化CERE将外源蛋白导入Naegleria滋养体中。作为探索CERE在Naegleria中作为载体应用的第一步，我们建立了一种将克隆至pGEM7zf+载体中的N. gruberi CERE分子克隆（pGRUB）转染N. gruberi的实验方案。转染后，pGRUB在N. gruberi滋养体中至少连续传代七次仍可被检测到，并且能够通过包囊和脱囊过程稳定存在。作为对照，将不含N. gruberi序列的骨架载体pGEM7zf+（pGEM）转染滋养体。转染进入N. gruberi后，pGEM在第一次传代后即无法检测到，表明其不能在真核生物中复制。这些研究描述了一种针对Naegleria滋养体的转染方案，并证明pGRUB中的细菌质粒序列并不影响转染后CERE克隆在细胞内的成功转染与复制。此外，该转染方案对于确定驱动CERE在滋养体中复制所需的最小序列，以及鉴定非核糖体序列（NRS）中的调控区域将至关重要。

引言

Naegleria 属包含超过 45 个物种，尽管目前可能尚未鉴定出该属的所有成员1。Naegleria 可以以不同形态存在：滋养体（阿米巴）、鞭毛体，或在资源严重受限时以包囊形式存在1,2,3,4。Naegleria 属因其一个特别危险的物种——Naegleria fowleri 而广为人知，该物种被称为“食脑阿米巴”（综述见1,2,3,4,5,6,7），是几乎无一幸免的原发性阿米巴脑膜脑炎的致病原因。

Naegleria 将其核糖体DNA（rDNA）编码在位于核仁中的CERE上。对三种Naegleria物种基因组的完整测序证实，其核基因组中不存在rDNA8,9,10,11。根据目前有限的全长CERE序列数据，CERE的长度范围约为10 kbp至18 kbp。每种Naegleria物种的每个细胞约含有4,000个CERE，每个CERE携带一个rDNA顺反子（包含5.8S、18S和28S核糖体DNA）12,13,14。除rDNA外，每个CERE还含有一段较长的非rDNA序列（NRS）。不同物种间的CERE大小存在差异，这种差异主要源于NRS长度的变化，而rDNA序列在该属中高度保守1,15,16,17,18,19,20。N. gruberi CERE的NRS区域内已定位到单一的DNA复制起点21，这为Naegleria CERE独立于核基因组进行复制的假说提供了有力支持。

N. gruberi 是一种常用于研究的非致病性阿米巴 纳格里虫 生物学。我们开发了一种用于转化的实验方法 N. gruberi 同一物种的CERE克隆滋养体，以验证该假设 纳格里虫 阿米巴原虫在滋养体内容忍并独立复制CERE。这是通过转化实现的 N. gruberi 全长克隆 N. gruberi 将CERE转化为滋养体，并通过聚合酶链式反应（PCR）追踪供体CERE克隆的命运。该方案的总体概述如下所示： 图1本文展示的数据表明，供体克隆在组织培养中至少可检测到连续七次传代，并能通过包囊和脱囊过程得以维持。这些研究为解析CERE复制机制以及探索其作为转染载体的应用提供了基础。 纳格里虫.

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方案

本研究中使用的物种、试剂和设备的详细信息列在材料表中。17,004个碱基对的pGRUB构建体序列见补充文件1。

1. 滋养体培养

  1. 将冻存的 N. gruberi 滋养体在 37 °C 下解冻 3 分钟。
  2. 将滋养体接种至 T25 培养瓶中，使用含 10% 胎牛血清的改良蛋白胨/酵母提取物/核酸/叶酸/血红素（PYNFH）培养基，并添加 2% 缓冲液（磷酸氢二钠、磷酸二氢钾）。
  3. 在 25 °C 下培养滋养体，直至汇合度达约 80%，此时细胞呈现阿米巴样形态（图 2A）。
    注意：初次从冻存状态复苏滋养体培养物时，T25 培养瓶可能需要 5–7 天才能达到完全汇合。每 3–4 天倾去培养基，并更换新鲜培养基。
  4. 将汇合的培养瓶置于冰上 5–10 分钟，以使贴壁的滋养体从塑料表面脱落。轻轻摇晃培养瓶，使残留的贴壁细胞松动。此时滋养体呈现“圆缩”形态（图 2B）。
  5. 按 1:2 至 1:4 的比例将培养物传代至新的组织培养瓶中。
  6. 去除 PYNFH 培养基，更换为无菌包囊培养基（120 mM 氯化钠、0.03 mM 氯化镁、1 mM 磷酸氢二钠、1 mM 磷酸二氢钾、0.03 mM 氯化钙、0.02 mM 氯化铁，pH 6.8）22，以诱导 N. gruberi 形成包囊。
    注意：大多数滋养体在 72 小时内完成包囊（图 2C）。脱囊过程应在 72 小时内完成。
  7. 从培养瓶中收集包囊，在 20 °C 下以 600 × g 离心 10 分钟，然后将包囊重悬于含 10% 胎牛血清的 PYNFH 培养基中，以诱导细胞脱囊。在 25 °C 下孵育 24 小时，直至滋养体开始出现。

2. 转染滋养体

  1. 将滋养体接种于6孔平底组织培养板中（每孔1 mL，浓度为1 × 106 个滋养体/mL），在25 °C条件下培养。
  2. 当细胞生长至70%–80%汇合度时（6孔板中约为10.4 × 104 个细胞/cm2）进行转染。使用前将转染试剂恢复至室温。
  3. 按如下方法配制质粒-转染试剂混合物：在200 µL不含FBS的PYNFH培养基中加入75 ng质粒DNA和0.225 µL转染试剂。为保证重复实验，需配制足够的质粒-转染试剂混合物以进行双份转染。
    注：本研究使用含有N. gruberi CERE全长克隆的细菌质粒（pGRUB）。空质粒（pGEM）作为阴性对照（图3）。
  4. 将质粒-转染试剂混合物于室温孵育10分钟。
  5. 转染前，从滋养体单层中移除约800 µL培养基。
  6. 将质粒-转染试剂混合物加入滋养体中。
  7. 每隔15分钟轻轻摇动培养板，防止培养基在板边缘聚集。
  8. 在25 °C孵育1小时后，用2 mL生长培养基洗涤单层细胞一次。
  9. 加入含10 U DNase的1 mL 10倍浓度DNase缓冲液，在37 °C处理15分钟以去除残留质粒DNA，随后用生长培养基洗涤一次，加入2 mL新鲜培养基，并置于25°C培养24–36小时。
  10. 将培养板置于冰上10分钟，以释放细胞。
  11. 将一个孔的细胞按1:2比例传代至两个 新孔中。
  12. 收集其余孔中的滋养体用于后续实验。
    注：所有培养均设双重复。每种条件下，一个孔用于传代，另一个孔用于CERE分离。

3. 从 Naegleria中分离CERE

  1. 通过台盼蓝排斥染色法和血细胞计数板计算用于CERE分离的每个孔中滋养体的数量23.
  2. 将滋养体置于 2.0 mL 离心管中。
  3. 用 100 mM 氯化钠（pH 7.5）洗涤滋养体一次 通过 离心（600 × g） g，10 分钟，4 °C)
    注意：氯化钠可防止滋养体黏附在试管壁上。
  4. 移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 100 µ100 mM EDTA（pH 7.5）的 L
  5. 将试管置于98℃的加热块中，持续15分钟 °C 以裂解细胞并灭活滋养体中的酶。
    注意：此步骤可灭活大量存在的DNase 纳格里虫 滋养体。DNase 可能会干扰在第 4 步中对天然 CERE 及其分子克隆的检测。当细胞数量超过约 3 × 10⁶ 时，DNA 产量会降低。6 第3.4步中使用细胞。
  6. 将离心管以最高速度（16,000 x g) 在 4 °C离心10分钟以沉淀碎片。
  7. 将上清液转移至新的离心管中。
  8. 用0.5体积的7.5 M醋酸铵（pH 7.5）、3体积的无水乙醇和1体积的……对上清液进行乙醇沉淀 µ10 mg/mL 糖原溶液，用作载体。
  9. 将试管颠倒数次，然后将试管置于 -80 °C，至少持续1 小时或过夜。
  10. 将样品 warming 至室温。
  11. 在室温下以16,000 x g离心试管10分钟 g.
  12. 移去上清液，加入70%乙醇重悬沉淀，于16,000 x g离心5分钟 g （室温下）
  13. 去除乙醇，将沉淀物在空气中干燥5分钟。
  14. 将干燥的沉淀重悬于无菌去离子水（DI 水）中。调整体积至每微升含 10,000 个滋养体， µL.
  15. -80 保存 °C，直至用于 PCR。

4. 转化滋养体的PCR检测

  1. 使用 20,000 个细胞当量的 DNA、600 nM 引物（表 1）以及 Taq 聚合酶进行 PCR24。
    注：用于区分天然 CERE 与克隆 CERE 的引物列于 表 1，PCR 条件亦列于其中。图 3 显示了引物在构建体上的位置。PCR 需根据所用引物及特定的 PCR 混合液进行优化。
  2. 将 0.8% 琼脂糖溶于 1×Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中，微波加热至琼脂糖完全溶解。
  3. 将琼脂糖溶液在室温下冷却至约 50 °C。
  4. 将溶液倒入含有梳子的凝胶制备槽中，形成加样孔。
  5. 让凝胶在室温下静置至完全凝固。
  6. 将凝胶放入电泳装置中。
  7. 向电泳槽中倾入 1×TAE 缓冲液，直至完全浸没凝胶。
  8. 移去梳子。
  9. 向样品中加入 6×上样染料（0.25% 溴酚蓝、0.25% 茜素蓝、30% 甘油），混匀后上样。使用 DNA 分子量标记物确定 PCR 产物的大小。
  10. 连接电极，开启电源，以 80 V 电压电泳约 1.5–2 小时。
  11. 关闭电源，取出凝胶。
  12. 将凝胶置于 100 mL 去离子水中，加入 DNA 染料（例如 10 mg/mL 溴化乙锭 10 µL）染色 10 分钟。
  13. 用去离子水脱色 20 分钟。
  14. 在紫外（UV）成像系统下观察凝胶并记录结果。

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结果

对转染了pGRUB质粒的滋养体进行PCR检测表明，转染的CERE在滋养体连续传代至少七代的过程中均能被检测到，且在包囊和脱囊过程中也保持存在（图4）。PCR所用引物针对pGEM载体和CERE序列进行设计，从而确保PCR不会扩增出内源性CERE。将pGEM转染滋养体后进行PCR检测显示结果为阴性（图4），表明空质粒未被阿米巴保留。图4显示，pGEM在第一代传代后即已丢失，后续各代、包囊及脱囊过程的检测结果均为阴性。

滋养体培养、转染、分离和PCR流程图；微生物学方法。

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讨论

本文所述方案非常直接，但每种构建体可能都需要一定程度的优化，特别是DNA与转染试剂的比例，这取决于构建体的性质以及所用Naegleria的物种。我们仅使用了一种市售的转染试剂对该方案进行了测试，但很可能其他多种试剂也有效。由于使用了包含功能性复制起点并因此能够自主复制的CERE全长克隆，该构建体具备所有必要的真核复制机制。如果将部分克隆插入pGEM载体，则预测转染后的克隆在转染后很快就会丢失，除非其含有功能性真核复制起点，这一点与空pGEM载体类似（图2B）。此外，这些数据表明，原核DNA的存在不会干扰分子克隆被滋养体保留的能力。

尽管已有研究报道过对N. gruberi滋养体进行转染的案例25，但本研究所使用的插入片段明显更大（约17 kbp），远大于先前研究中转染的片段（<1 kbp）。目前尚不清楚Naegleria能够耐受的最大质粒大小，但我们实验室的未发表数据显示，另一属（Willaertia

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披露

未声明任何财务利益冲突。

致谢

这些研究部分由克瑞顿大学George F. Haddix基金（KMD）资助。图1在biorender.com中生成，图3在benchling.com中生成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Bio Rad161-3102
乙酸铵Sigma AldrichA-7330
氯化钙Sigma AldrichC-4901
碎冰
培养瓶，T-75Thermo Scientific130190
培养板，6孔Corning3506
DNaseSigma AldrichD-4527
EDTA，0.5 MAffymetrix15694
电泳凝胶装置Amersham Biosciences80-6052-45
Eppendorf 管，1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Eppendorf 管，2 mLFisher Scientific05-408-138
乙醇，100%Decon Laboratories2716
溴化乙锭Sigma AldrichE-8751
胎牛血清Gibco26140
叶酸Sigma AldrichF7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo ScientificSM1331
冰醋酸Fisher ScientificUN2789
GoTaq Green PCR Master MixPromegaM7122
加热金属块Thermo Scientific88871001
血细胞计数板Hausser Scientific1483
血红素Sigma Aldrich51280
氯化铁Sigma Aldrich372870-256
连接酶NEBM2200S
氯化镁Fisher ScientificM33-500
微量离心机Thermo ScientificMySpin 12
显微镜NikonTMS
N. gruberiATCC30224
核酸Chem Impex Int’l#01625
蛋白胨Gibco211677
pGEMPromegaP2251
磷酸钾Sigma AldrichP0662-500G
PowerPac HC 电泳电源装置Bio Rad1645052
氯化钠MCB ReagentsSX0420
磷酸氢二钠Sigma AldrichS2554
台式离心机eppendorf5415R
Tris 碱Sigma AldrichT1503-1KG
台盼蓝，0.4%Gibco15250-061
ViaFect 转染试剂PromegaE4981
电子天平Denver InstrumentsAPX-60
酵母提取物Gibco212750

参考文献

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