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方法文章

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

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DOI：

10.3791/66735

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2024年7月19日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。

摘要

光片显微镜已成为对斑马鱼胚胎进行长时间活体成像的首选方法，具有极低的光毒性。特别是多视角系统，可通过旋转样品实现从不同角度对整个胚胎进行成像。然而，在大多数多视角系统的成像过程中，样品固定是一个繁琐的步骤，因为样品通常制备在聚合物管中。为协助完成这一过程，本实验方案描述了在70%外包层期至早期体节阶段之间对斑马鱼早期发育进行成像的基本固定策略。具体而言，本研究提供了胚胎在卵膜内处于70%外包层期和芽期时默认位置的统计信息。此外，本文讨论了在斑马鱼胚胎发育早期阶段进行全胚胎成像所需的最优角度数量及角度间隔，以便通过融合不同视角图像获取细胞尺度的信息。最后，由于胚胎占据了相机的整个视场（这是获得细胞尺度分辨率所必需的），本方案详细说明了如何利用位于胚胎上方或下方的微珠信息来实现不同视角图像之间的精确配准。

引言

在长时间对活体胚胎进行高时空分辨率成像时，确保光毒性最小化是一个主要要求。在过去十年中，光片显微镜技术已成为满足这一要求的首选方法1,2,3,4,5,6,7。简而言之，该技术最早于2004年被用于捕捉发育过程8，其原理是两束对准的薄层激光从相对两端穿过胚胎，仅照亮目标平面。检测物镜被置于正交方向，从而同时收集样品中所有被照亮点发出的荧光。通过将胚胎逐层穿过静止的光片，即可获得三维图像。

此外，在该方法的一种特定形式——多视角光片显微镜技术中，样品可悬浮于聚合物管内，并通过转子旋转，从而实现从多个角度对同一胚胎进行成像9,10,11。成像完成后，基于配准标记物将来自不同角度的图像进行融合，这些标记物通常是胚胎内部的球形荧光标记（例如细胞核）或管壁上的荧光微珠。多视角成像与图像融合显著提高了轴向分辨率，实现三个维度上的各向同性分辨率12。尽管这是显著优势，但多视角方法的主要挑战在于样品装载，即胚胎必须在整个成像过程中被稳定地装载并固定在管内。

为了进行多视角成像，需要将胚胎固定以防止成像过程中发生移动，可将胚胎包埋于琼脂糖中。然而，这种方法通常会对胚胎的生长和发育产生不利影响，尤其是对本文所讨论的模式系统——早期斑马鱼胚胎13。另一种固定策略是使用一种内径略大于胚胎直径的细管，将胚胎连同胚胎培养液一起吸入管中，随后用琼脂糖塞封闭管底14。在此方法中，由于管内充满胚胎培养液，无法使用荧光微球等外部标记物作为不同视角图像融合的配准标记，因此图像配准必须依赖胚胎内部的天然结构作为标记。通常情况下，微球作为配准标记的效果更佳，因为受显微镜照明和检测深度的限制，胚胎内部标记信号在成像深度增加时会逐渐衰减。

因此，第三种方法（本文将详细描述并已在先前研究中使用过5,13,14,15,16）是对具有完整绒毛膜的早期斑马鱼胚胎进行成像，并在毛细管中填充含有作为配准标记的微珠的极低浓度琼脂糖。在此情况下，由于无法通过人工干预在绒毛膜内调整胚胎位置，本研究提供了早期斑马鱼胚胎自然沉降方向的统计结果，特别关注了70%原肠胚形成期和胚芽期。随后讨论了以细胞尺度分辨率对早期胚胎进行成像所需的最优视图数量，并详细描述了使用基于FIJI的插件BigStitcher进行图像融合的流程10,17,18。该方案结合使用20x/1 NA物镜，旨在帮助斑马鱼胚胎学研究人员利用多视角光片显微系统，对从原肠胚形成期到早期体节阶段的胚胎进行细胞核和膜标记的成像。

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方案

本研究中使用的斑马鱼饲养和实验程序已获得机构动物伦理委员会批准，批准文号为 TIFR/IAEC/2023-1 和 TIFR/IAEC/2023-5。通过交配携带杂合基因型并表达特定标记的斑马鱼获得胚胎 Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)19 在单细胞阶段注射了 H2A-mCherry mRNA（30 pg）。H2A-mCherry mRNA 使用 pCS2+ H2A-mCherry 质粒（由 EPFL 的 Oates 实验室惠赠）合成 体外 转录。在本方案其余部分中，分别将表达这两种标记物的胚胎称为 Utr-GFP 和 H2A-mCherry，并在原肠胚形成70%包被期和胚芽期进行成像。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 多视角成像的样品制备

  1. 氟化乙烯丙烯/聚四氟乙烯（FEP/PTFE）管的制备
    1. 按照先前描述的步骤清洗FEP/PTFE管14。
    2. 清洗后，根据需要将管子切成2-2.5 cm的长度，并将其储存于含有双蒸水的2 mL微量离心管中。此类储存方式可维持约一个月。
    3. 在样品制备前，将管子在70-75 °C下加热约25分钟以使其伸直。每个微量离心管中应避免过度堆积，以防管子粘连，确保留有足够空间以实现有效伸直。
      注意：在整个管子操作过程中需佩戴手套，因为管子上留下的任何指纹或灰尘颗粒都可能干扰成像。
  2. 琼脂糖的制备
    1. 配制50倍浓缩的E3缓冲液储备液，方法如下：
      1. 储备液1：将3.252 g Na2HPO4、0.285 g KH2PO4、11.933 g NaCl、0.477 g KCl溶于1 L去离子水中
      2. 储备液2：将2.426 g CaCl2、4.067 g MgSO4 溶于1 L去离子水中。
    2. 配制1倍E3缓冲液时，将储备液1和储备液2各取20 mL，加入960 mL去离子水中。
      ​注意：用于成像的E3缓冲液中不得添加亚甲蓝，因其会导致光散射。
    3. 将低熔点琼脂糖加入1倍E3缓冲液中，在加热块上于70-75 °C加热并搅拌，直至溶液澄清、无结块或晶体残留。
    4. 对于多视角成像，向琼脂糖溶液中加入市售荧光微球（参见材料表），以便在分析过程中实现图像配准。将微球置于水浴超声仪中，室温下以40 kHz频率超声处理20-30分钟，以分散微球团块。
    5. 超声处理后，向15 mL离心管中的10 mL琼脂糖溶液中加入1 µL微球，并充分涡旋混匀，确保微球均匀分散。
      注意：加入琼脂糖的微球溶液体积取决于厂家提供的原液浓度。建议尝试不同体积范围，选择在光片成像系统中观察到微球分布均匀的浓度。即使经过超声和涡旋处理，过多的微球仍可能聚集，而过少则会影响图像配准效果。
    6. 在样品制备前，将加入微球的琼脂糖管置于37 °C恒温水浴中密闭保存至少30分钟，使琼脂糖温度从70 °C降至37 °C。
  3. 样品制备
    1. 在成像当天前一晚，将鱼类成对放入饲养盒中并用隔板隔开。移除隔板约15分钟，随后采用标准方法收集胚胎20。
    2. 当胚胎发育至样品制备所需阶段时，将置于37 °C保温的全部10 mL含微球琼脂糖溶液倒入6 cm培养皿中。
    3. 等待约2-3分钟，待温度降至33 °C以下后，将10至15个胚胎转移至琼脂糖溶液中。
      注意：此步骤至关重要，可防止胚胎因高温琼脂糖而遭受热休克。
    4. 转移胚胎时，应尽量减少带入琼脂糖溶液中的E3缓冲液体积。轻轻旋转培养皿，使少量带入的缓冲液充分分散。
    5. 在后续样品制备过程中均需佩戴手套。
    6. 取一支200 µL移液器并装配合适的吸头，将一根从微量离心管中取出的已清洗直管插入移液器吸头中，如图1A、B所示。
    7. 使用移液器先吸入少量琼脂糖进入管内，随后吸入2-3个胚胎（图1C、D）。确保胚胎靠近管底（图1E），这在后续设置成像时非常重要。同时确保不同胚胎之间留有少量琼脂糖（图1E），以便该区域的微球可作为图像配准标记。
    8. 保持移液器负压不释放，将管子从吸头上取下，并将其放置于盛有E3缓冲液的培养皿盖上，使琼脂糖凝固（图1F）。
    9. 重复步骤1.3.6至1.3.8，直至培养皿中所有胚胎均转移至管中。
    10. 待琼脂糖完全凝固（约需5-10分钟，可通过检查培养皿中琼脂糖状态确认）后，将管子转移至装有E3缓冲液的2 mL微量离心管中（图1G）。
    11. 根据需要，将含有胚胎的管子置于28 °C或33 °C培养箱中保存，随后进行多视角成像。

2. 多视角成像

注意：本步骤介绍了斑马鱼胚胎在早期发育阶段进行多视角成像的通用流程。下述方法可轻松适配于任何多视角光片显微镜系统。

  1. 定位胚胎
    注意：用胚胎培养基填充显微镜的样品室20 并将样品室温度设置为成像所需的温度，且至少在成像前10分钟完成预热。
    1. 按照之前所述组装样品 holder21，但需进行一项修改。由于将通过毛细管进行成像，因此需将含有胚胎的琼脂糖管直接插入直径合适的毛细管中，确保其固定到位，同时避免推出琼脂ose或扰动底部的胚胎（图1H).
      注意：由于样品室具有固定的深度，在样品制备过程中（如步骤1.3.7所述）确保胚胎位于管底附近，可使胚胎定位在视野范围内，同时避免触碰到样品室底部。
    2. 将样本架插入多视角系统，并使用x轴和y轴控制将胚胎移至视野中心。
    3. 使用样本导航器的 z 轴控制功能将胚胎调至焦点。
    4. 此时，胚胎在绒毛膜内的方向将清晰可见；如果方向不理想，可插入新的移液管，选择具有理想方向的胚胎。
  2. 对齐光片
    1. 胚胎就位后，设置所有实验参数——激光器、光路、滤光片、分光镜和相机。
    2. 在设置采集参数时，如果软件提供选项 摆动扫描，选择该选项。枢轴扫描可减少光片在遇到样品中任何结构或不透明区域时产生的阴影效应。
    3. 开始对样品进行实时扫描。设置位大小、激光功率和所需的缩放倍数，这些参数将决定光片的厚度，从而影响轴向分辨率。
    4. 为对齐光片，首先切换至 单侧光照 并更改设置 两束光片 （左侧和右侧）依次进行。在样品中选择一个具有清晰可见目标结构的区域，进行数字放大。
      注意：本研究中使用了核标记（H2A-mCherry）或膜标记（Utr-GFP）来对齐层片。建议在软件中调整光片设置，以在目标区域获得最清晰的信号对比度。
    5. 当两束光片各自优化至获得最佳信号后，同时开启两束光片。进行第二轮准直调整，确保闪烁现象最小化，这表明两束光片已实现较佳的对准。
    6. 一旦完成对齐，如果软件允许，启用自动融合由两片光片生成图像的选项。或者，可先通过聚焦样品周围的荧光微珠对光片进行粗略对齐，再利用样品本身的信息进行精细调整。
      注意：在使用两种荧光染料（如细胞核和细胞膜标记物）进行成像时，两种结构的最佳对齐参数通常略有不同。在此情况下，应根据下游处理的限制条件选择设置。例如，若需分割细胞边界（该过程相对更耗费计算资源），则应基于细胞膜标记物对齐光片。
  3. 设置多视角成像
    1. 对齐光片后，启用进行z轴扫描及多视角成像的选项。
    2. 开始 活体扫描 并使用样本导航器选择第一个视图。在此视图中，设置 层厚间隔，接着是z轴层扫的第一层和最后一层。在多视野对话框中添加此位置，以记录该视野的位置和z轴层扫信息。
    3. 通过调整样本导航器中的角度切换到下一个视野。为第二个视野设置z轴层扫，并在多视野对话框中添加相应信息。
    4. 对其他视图重复相同操作。
      注意：确保在每种视角下成像的切片数量达到一定最小值，以便不同视角之间具有足够的重叠区域，从而在后续处理过程中有助于视角间的配准。最小切片数取决于成像时的缩放倍数以及所选择的成像角度数量。
    5. 设置完所有视图后，将这些信息保存为一个文本文件（例如命名为“embryo-positions”），文件中将包含z层信息、管状结构的(x, y, z)坐标以及每个视图的角度参数。保存后，清除多视图对话框中的所有位置信息。
    6. 由于成像时卵膜保持完整，而卵膜相对较大，因此无法在相同设置下于管中观察到珠子。因此，必须从管中另一位置获取珠子信息。为此，将视野移至远离胚胎、可清晰看到珠子的另一个“y”坐标位置。将该位置添加至多视野对话框中，并将其保存为文本文件（例如命名为“beads-y”）。
      注意：应将珠子成像位置尽量靠近胚胎样本，以尽量减少两个位置间因管壁曲率差异可能带来的影响。因此，若在管中装载多个胚胎，需在胚胎之间保留少量琼脂糖，用于珠子成像（如步骤1.3.7所述）。
    7. 转到保存文本文件的文件夹，将“embryo-positions”文件复制为一个新文件，命名为“beads-positions”。在“beads-positions”文件中，将所有视图的 y 坐标替换为“beads-y”文件中的 y 坐标。这将确保珠子以相同数量的视图、z 层切和 x 坐标进行成像，但在管中的 y 位置不同。
    8. 返回成像软件并加载软件中的“bead-positions”文件。如果已启用时间序列选项，请选择一个周期并开始实验。将珠子图像保存为“beads”，用于图像处理过程中不同视角的配准。
    9. 拍摄完磁珠图像后，清除原有位置信息，并在软件中加载初始的“胚胎-位置”文件。设置合适的循环次数和时间间隔，然后开始实验。

3. 多视角图像分析

注意：为融合多视角图像，使用 FIJI 插件 BigStitcher，该插件是 Multiview Reconstruction 插件的最新版本10,17,18。可通过在“帮助”菜单下的“更新”选项中进入“管理更新站点”功能，添加 BigStitcher 插件以完成安装。安装完成后，该插件将出现在“插件”菜单下。融合过程的主要步骤如下：（1）分别为荧光微球和胚胎定义 .xml/.h5 文件对；（2）使用荧光微球文件对所有视角进行配准；（3）提取荧光微球的点扩散函数（PSF），用于去卷积处理（图 2A）；（4）将荧光微球文件中的配准信息和 PSF 信息转移至胚胎文件，并开始多视角去卷积。其中大部分步骤已有详细描述21，本文仅介绍处理方式有所不同的步骤。

  1. 定义 .xml 数据集
    1. 如前所述21，分别为珠子和胚胎定义新的数据集，文件名为“beads.xml”和“embryo.xml”。
  2. 使用兴趣点进行检测与配准
    1. 成功导出 beads.xml 文件后，在“Multiview Explorer”对话框中选择需要用于配准的视图（图2B）。右键单击并选择检测兴趣点。按照描述的步骤继续操作21。
    2. 检测到兴趣点后，选择所有视图，右键单击并选择使用兴趣点进行配准。按照描述的方案进行操作21。
    3. 仔细检查珠子配准是否成功。配准成功后，来自不同视图的重叠珠子将被叠加（图2C）。为评估配准的精确程度，选择两个连续的视图，进入重叠区域，并在两个视图之间切换，观察从不同角度成像的珠子是否完全重合。对每一对连续视图重复此操作。
    4. 如果重叠不够精确，可通过降低配准所需的显著性阈值和/或放宽可接受的重叠误差（在“Registration”对话框中称为“RANSAC error”）重新尝试配准。
    5. 成功配准后，点击“Multiview Explorer”窗口中的保存按钮，以保存更新后的 .xml 文件。
      注意：同时保存日志文件，其中包含有关配准效率的更详细信息。要将珠子的配准信息转换至胚胎数据，请按以下步骤操作。
    6. 使用任意文本编辑器打开bead.xml文件，并复制"ViewRegistrations"下的整个代码块。
    7. 打开embryo.xml文件，将其中的"ViewRegistrations"代码块替换为从珠子文件中复制的代码块。如果有多个通道，需对每个通道重复上述替换操作。配准信息可通过手动方式或使用自定义编写的 MATLAB 代码进行转移，该代码可从此处下载：https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
    8. 在"BigStitcher"中打开embryo.xml文件，并仔细检查胚胎数据的配准是否成功。如同对珠子的操作一样，通过检查每两个连续视图中感兴趣结构的重叠情况来验证配准效果。
      注意：有时即使珠子配准完美，胚胎配准效果仍可能不理想。这可能是由于从珠子成像位置到胚胎位置之间毛细管曲率存在轻微变化所致。此外，由于胚胎在绒毛膜内自由漂浮，不同视图之间可能存在细微移动。在此情况下，可使用胚胎中的核标记进行第二轮配准。
    9. 为此，在"BigStitcher"中打开embryo.xml文件，右键单击所有包含核标记的视图，然后选择检测兴趣点。
    10. 将兴趣点重命名为“nuclei”，并按照珠子处理的步骤继续操作。
    11. 设置“高斯差分”参数时，应确保绝大多数（若非全部）细胞核被检测到，且无异位的细胞核检测信号。随后点击完成。
    12. 接下来，选择使用兴趣点进行配准，并选择基于精确描述符（平移不变）选项。确保选中“比较所有视图和兴趣点”选项，并使用“nuclei”作为兴趣点。启用固定第一个视图的选项，并不进行反向映射。
    13. 配准时使用仿射模型并结合刚性正则化，插件中使用默认参数。
    14. 通过比较每两个连续视图，重新检查配准的成功情况。
    15. 配准成功后，点击“Multiview Explorer”窗口中的保存按钮，以保存更新后的 .xml 文件。
    16. 使用任意文本编辑器打开 embryo.xml 文件，并将来自核标记的配准信息复制到其他通道。
  3. 点扩散函数提取与分配
    1. 为执行多视角去卷积，需从已配准的珠子数据集中提取成像系统的点扩散函数（PSF），并将其 应用于胚胎文件。
    2. 为获取该信息，选择珠子文件中的所有视图，右键单击并选择点扩散函数和提取选项。
    3. 在弹出的对话框中，确保勾选使用对应的兴趣点和从PSF中移除最小强度投影，使用默认的PSF尺寸，然后点击确定。
      注意：如果所有视图的PSF提取均成功，日志文件将显示“Extracted n/n PSFs”
    4. 随后，重新保存 .xml 文件。“Multiview Explorer”对话框的PSF列中将出现勾选标记，同时在相应文件夹中生成一个包含所有提取PSF的“psf”文件夹。
    5. 打开embryo.xml文件，并为每个视图单独分配PSF。右键单击"一个视图" → 点击点扩散函数 → 选择分配 → 选择高级，然后选择为所有选定视图分配新PSF。点击浏览，前往 .xml 文件路径，打开psf文件夹。
    6. 选择与所选视图对应ID匹配的PSF，点击确定，之后“Multiview Explorer”窗口中PSF列的复选框将显示为已勾选。
    7. 对所有其他视图重复此过程。
  4. 多视角融合与去卷积
    1. 在为所有视图分配点扩散函数后，右键单击并选择多视角去卷积。
    2. 选择边界框为当前选定的视图。在本研究中，默认的OSEM加速参数和迭代次数表现良好。
    3. 如需加快计算速度或受限于CPU内存，可根据需要对图像进行下采样。
      注意：如果所需RAM超过现有内存，窗口底部将弹出红色警告消息。若出现此警告，请勿启动去卷积，否则插件将在处理过程中卡住并停止响应。
    4. 为评估去卷积的进度，可查看日志文件，该文件每5次迭代显示一次结果。
    5. 为提高计算速度，若已安装GPU，可在GPU上执行多视角去卷积。
      注意：此过程结束后，将弹出融合图像窗口，可将其保存为tiff文件。

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结果

以精确的方式对样本进行定位是高效使用显微成像系统的关键环节。然而，在使用多视角光片显微系统时，由于需要将样本置于管状容器中制备，通常无法手动调整样本方向。因此，为了检测胚胎在卵膜内是否存在典型的空间取向，本研究在原肠胚形成期至早期体节阶段的时间序列成像背景下，选择在原肠形成70%阶段（约受精后7小时，hpf）对斑马鱼胚胎进行成像。当在70%原肠阶段成像前立即制备样本时，胚胎在不同样本间未表现出特定的常见取向。由于这种情况通常并不理想，因此样本在原肠胚形成前较早时间即完成制备，并在适当温度下保存于微量离心管中，直至成像开始。在此条件下，在70%原肠阶段（N = 3；n = 87个胚胎），胚胎的取向可分为三类：（1）水平方向，即胚胎的动-植极（AV）轴与聚合物管的长轴垂直；（2）垂直方向，即AV轴与聚合物管的长轴平行；（3）倾斜方向，即AV轴与管长轴呈锐角（图3A）。其中，水平方向出现频率最低，而垂直方向与倾斜方向的出现频率相当（图4）。

当胚胎保留在管中时，它们在各...

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讨论

将胚胎调整至合适的方向以观察目标区域，是成像过程中的限速步骤之一，常导致用户显微成像失败。在多视角光片显微镜中，这一问题尤为突出，因为样本被包埋在管状结构中，难以手动调整其方向。为辅助该过程，本研究报道了当含有胚胎的聚合物管直立放置于微量离心管中时，斑马鱼胚胎在卵膜内从70%外包期至早期体节阶段所呈现的各种位置的统计结果。

在70%下包阶段，垂直或水平方向的胚胎可提供整个胚胎发育事件的互补信息。水平方向便于从植物极观察动物极的细胞动态以及正在进行下包的细胞动态，而垂直方向则便于观察胚胎的背侧和腹侧，包括背侧组织中心的细胞动态、原肠作用期间细胞的内陷以及汇聚延伸流。本研究表明，如果在成像前数小时制备样品，仅凭偶然即可较大概率获得垂直方向的胚胎；然而，在这些阶段，水平方向的胚胎似乎较为少见。对于70%下包阶段之前的时期，建议用户在进行延时成像前，先记录胚胎在卵膜内的类似方向分布统计数据，因为提前掌握这些信息可从长远上节省时间。

从芽胚期开始，成像的最佳方向是将胚胎水平放置，因为这样可以沿胚胎的整个前后体轴观察细胞动态

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢Kalidas Kohale博士及其团队对鱼类养殖设施的维护，以及KV Boby对光片显微镜的维护。SRN感谢印度原子能部（DAE）政府提供的经费支持（项目编号：RTI4003，DAE文件号：1303/2/2019/R&D-II/DAE/2079，日期：2020年2月11日）、马克斯·普朗克学会伙伴小组项目（M.PG.A MOZG0010）以及科学与工程研究委员会启动研究基金（SRG/2023/001716）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
低凝胶温度琼脂糖Sigma-AldrichA9414
氯化钙二水合物Sigma-Aldrich12022
FIJI版本：ImageJ 1.54f
荧光红色羧基化改性聚苯乙烯乳胶微球，平均粒径 0.5 μm，水悬浮液Sigma-AldrichL3280
七水合硫酸镁Sigma-AldrichM2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒ThermoFischer ScientificAM1340用于 H2A-mCherry 质粒的体外转录
氯化钾Sigma-AldrichP9541
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP0662
PTFE 套管 AWG 15L - 内径 1.58 mm × 壁厚 0.15 mm，公差 ±0.05 Adtech Innovations in FluoroplasticsSTW15PTFE 管
氯化钠Sigma-AldrichS3014
磷酸氢二钠Sigma-Aldrich71640
超声波清洗机LabmanLMUC3超声波破碎仪
Zeiss LightSheet 7 系统Zeiss

参考文献

  1. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
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