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方法文章

两亲性DNA纳米结构构建的合成凝聚体与类细胞结构

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DOI：

10.3791/66738

⸱

2024年5月31日

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 2Department of Chemistry, Imperial College London, 3fabriCELL, Imperial College London

本文内容

摘要

我们介绍一种从两亲性DNA纳米星的组成DNA寡核苷酸出发，制备合成生物分子凝聚体的实验方案。该凝聚体可由单一纳米星组分或两种组分生成，并可进行修饰以维持 体外 从嵌入式DNA模板转录RNA

摘要

合成液滴和凝聚体正日益成为先进仿生系统和合成细胞中的常见组分，可用于实现区室化并维持类生命响应。合成DNA纳米结构因其可编程的形状、化学功能化能力以及自组装特性，已展现出作为凝聚体形成构件的巨大潜力。我们近期研究表明，通过将疏水基团标记到DNA连接点上所获得的两亲性DNA“纳米星”（nanostars），是一种尤为稳健且多功能的解决方案。由此产生的两亲性DNA凝聚体可被编程以呈现复杂的多区室内部结构，对外部多种刺激产生结构响应，合成大分子，捕获并释放有效载荷，经历形态转变，并与活细胞相互作用。本文中，我们演示了从组成性DNA寡核苷酸出发制备两亲性DNA凝聚体的实验方案。我们将介绍以下三类系统：（i）形成均一凝聚体的单组分系统，（ii）形成核-壳结构凝聚体的双组分系统，以及（iii）对凝聚体进行修饰以支持特定功能的系统 体外 RNA纳米结构的转录

引言

合成细胞是微米尺度（10-50 µm) 通过自下而上构建的装置，以模拟现存生物细胞的功能与结构1,2合成细胞通常由脂质双层囊泡构成的膜所包裹3,4,5,6,7，聚合物囊泡8,9或蛋白体10,11，也可用于建立内部区室化12,13. 受到已知在活细胞中维持多种功能的无膜细胞器的启发14聚合物凝聚体、生物分子凝聚物和水凝胶等结构正逐渐成为构建合成细胞内外区室化的多功能且稳定的替代方案15,16,17,18.

利用DNA纳米技术的多功能工具包19，研究人员已开发出多种策略，通过人工DNA纳米结构的自组装来构建合成液滴和凝聚体，其尺寸、形状、功能、价态及相互作用均可被精确编程20。DNA液滴或凝聚体具有良好的生物相容性，可作为合成细胞和细胞器的支架，用于容纳化学和生物分子反应21、执行信息计算22,23、捕获与释放 cargo 分子24,25，以及维持结构响应26。

在多种可形成冷凝相的DNA纳米结构设计中，两亲性DNA纳米星（被称为C-stars -）已被证明具有良好的稳定性和多功能性27。C-stars是一类简单的分支结构，由一个固定的DNA连接点（通常为四向连接）构成，从该连接点延伸出双链（ds）DNA臂28。这些DNA臂末端连接疏水基团（通常为胆固醇），从而使纳米结构具备两亲性，并能够在简单的单管退火过程中自发发生冷凝。C-stars形成的冷凝相具有精确的结构与功能可编程性，包括构建多区室结构29,30、响应DNA和阳离子刺激而发生结构变化31、合成大分子29、负载物的捕获与释放32,以及与活细胞相互作用33。下文将描述并讨论从组成该结构的寡核苷酸出发制备C-star冷凝相的实验方案。

本实验方案总结了利用三种不同C-star结构（图1）制备单组分（单组分）和双组分（双组分）凝聚体的方法，分别为“非响应型”、“TMSD响应型”和“RNA模板型”。 “非响应型”C-star（图A）由四条具有不同序列的“核心链”组成，形成四向连接结构；四个相同的胆固醇修饰寡核苷酸连接在该连接点上，确保每条臂末端均含有一个胆固醇分子。非响应型C-star作为构建单组分和双组分凝聚体的简单且惰性的支架结构。在“TMSD响应型”C-star（图B）中，胆固醇修饰链与连接点之间通过一条“趾桥”（Toeholding bridge）链连接，该链含有一段游离的单链DNA（ssDNA）“趾区”（toehold）结构域；当存在具有互补趾区结构域的入侵DNA链时，可触发趾区介导的链置换反应34，使入侵链取代趾桥链，从而切断连接点与疏水基团之间的连接，导致DNA网络解体32。最后，“RNA模板型”C-star（图C）包含一种与“桥”链互补的“底物”（Base）修饰结构，后者连接可转录的ssDNA模板，用于生成Broccoli适配体29。上述三种C-star结构所用寡核苷酸组分的序列详情见补充表1以及先前的研究文献29,30,32。

C-star 结构示意图；非响应性、TMSD 响应性、RNA 模板化；DNA 纳米技术。
图 1．三种不同设计的两亲性 DNA 纳米星（C-stars）示意图。 本文所述各种 C-stars 的寡核苷酸序列见补充表 1。(A) 设计用于形成非响应性凝聚体的 C-star 示意图，其组分寡核苷酸链包括“Core 1”、“Core 2”、“Core 3”、“Core 4”（以不同深浅的粉红色表示）和“Terminal cholesterol”（以蓝色表示）。每种独特颜色代表一条具有独特序列的寡核苷酸链。“Core 1”和“Core 3”各自部分互补于“Core 2”和“Core 4”，但彼此之间不互补。(B) 一种设计为在加入入侵链后通过趾部介导的链置换（toehold-mediated strand displacement）而解组装的 C-star 示意图，如先前研究32所述。该 C-star 由“Core”和“Terminal cholesterol”链（以灰色表示）、“Terminal complement”（以橙色表示）以及“Toeholding bridge”链（以深蓝绿色表示）组成。后者包含一个六核苷酸突出端，可与设计合适的入侵链结合，随后完全置换“Toeholding bridge”链，从而导致中心纳米星连接结构（由“Core 1, 2, 3, 和 4”组成）与由“Terminal complement”和“Terminal cholesterol”链组成的双链区解离。(C) 一种功能化修饰了 RNA 适体的 DNA 模板的 C-star 示意图。该结构同样包含“Terminal cholesterol”链以及“Core 2, 3, 和 4”（均以灰色表示），此外还包括延长版的“Core 1”链（以粉红色表示）、“Base”链（棕色）、“Bridge”链（黄色）以及“Aptamer template”（绿色）。后两条链组成的 DNA 双链构成 T7 聚合酶启动子区域，标志着转录起始位点。请点击此处查看此图的放大版本。

C-star凝聚体通过组成寡核苷酸的热退火形成，本文所述方案中，该过程在具有高长宽比矩形截面的密封玻璃毛细管内进行。此类容器具有多个关键优势：i）密封可完全防止在（有时较慢的）退火过程中发生蒸发；ii）毛细管的光学质量平底可实现对自组装（或解离）瞬态过程的成像；iii）毛细管的高长宽比确保了较重的凝聚体在宽而平坦的区域沉降，减少了在楔形容器（如微量离心管）中自组装瞬态后期易发生的融合与聚集，从而产生相对单分散的凝聚体群体；iv）在细长玻璃毛细管中进行退火可最大程度减少样品暴露于疏水界面（空气、塑料或油），这些界面已被发现会通过招募两亲性胆固醇修饰的寡核苷酸而干扰自组装过程。一旦组装程序完成，可从玻璃毛细管中提取凝聚体，用于涉及其他试剂的后续实验。

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方案

注意：本实验方案分为三个部分。第1部分描述了先决步骤，包括DNA寡核苷酸和玻璃毛细管的制备。第2部分描述了多种设计的C-star凝聚体（包括单组分和双组分设计）的制备，以及从玻璃毛细管中提取C-star凝聚体的方法。第3部分描述了利用单组分RNA模板化C-star凝聚体合成RNA适配体的应用。实验过程中，操作者必须遵循良好的实验室规范，确保完成所有必要的风险评估并采取相应的防护措施，并佩戴适当的一次性个人防护装备（PPE），包括手套、护目镜和实验服。清洗玻璃毛细管需依次在表面活性剂溶液和异丙醇或乙醇中进行超声处理。从毛细管中提取C-star凝聚体时，需使用金刚石刻划笔对玻璃进行划痕并折断，此操作存在被玻璃碎片划伤的风险。关键材料、仪器和试剂详见材料表。大多数未修饰的寡核苷酸由供应商采用标准脱盐法纯化，但“延长型Core 1”和“Aptamer模板”链需订购时选择聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化。胆固醇修饰的寡核苷酸则由供应商采用反相高效液相色谱（HPLC）进行纯化。

1. 先决条件

注意：以下溶液应使用超纯（一级）水配制，并用 0.22 µm 注射器滤器过滤：Tris-EDTA（TE）缓冲液，含 10 mM Tris、1 mM EDTA，pH 约为 8.0；含 2 M NaCl 的 TE 缓冲液；以及含 0.3 M NaCl 的 TE 缓冲液。缓冲液应在配制后 2 周内使用，不使用时应于 4 °C 保存。此外，将使用含 1 vol% 碱性光学清洁剂的超纯水溶液清洗玻璃毛细管。

  1. 从冻干状态制备DNA寡核苷酸
    1. 短暂离心（2000 × g，10–30 秒）冻干DNA寡核苷酸管，以确保冻干粉沉淀完全沉降至管底。
      注意：离心在室温（RT）下进行，持续10–30秒。此处使用的微型离心机默认转速为2000 × g（6000 rpm）。
    2. 加入适量TE缓冲液，将每种寡核苷酸重悬至100 µM。充分涡旋以确保完全溶解，然后按步骤1.1.1离心收集管壁上的全部液体。
    3. 对每种储存液，在260 nm处测定吸光度，并利用待测寡核苷酸序列的消光系数计算最终浓度。
      注意：特定寡核苷酸序列的消光系数通常可在供应商提供的数据表中找到，也可使用在线工具基于最近邻模型35或单个核苷酸消光系数的列表值36进行计算。
    4. 重悬后的寡核苷酸可短期储存于4 °C（不超过1周），或长期储存于-20 °C（最长6个月）。
  2. 玻璃毛细管的清洗
    1. 在去离子水中使用1%碱性光学元件清洗剂进行超声处理。
      1. 取所需数量的待清洗玻璃毛细管，放入一个高而窄的容器中（例如烧杯或15/50 mL离心管），确保毛细管不平放在容器底部。
      2. 向容器中加入清洗剂，液面略高于毛细管顶部。确保毛细管内部无残留气泡——必要时轻敲容器以去除。松散覆盖容器（例如用锡箔纸或离心管盖，确保未完全密封）。
      3. 将超声水浴设定为40 °C，将覆盖好的容器直立放入水浴中，超声30分钟。若使用锡箔纸，确保其不与超声水浴中的水接触。
        注意：本研究中使用的超声水浴默认超声频率为60 Hz，功率为150 W。
        警告：切勿在超声水浴运行时添加或取出物品；操作前必须先暂停程序。
      4. 超声完成后，关闭超声水浴的加热元件，然后用去离子水或超纯水彻底冲洗容器中的毛细管，至少冲洗五次，每次冲洗后弃去废液。
  3. 在异丙醇或乙醇中进行超声处理。
    1. 向清洗容器中的玻璃毛细管加入异丙醇或乙醇（浓度不低于70%），液面略高于毛细管顶部。与步骤1.2.1.2相同，确保毛细管内无残留气泡，并松散覆盖容器。
    2. 将容器直立放入超声水浴中，超声15–30分钟。
      警告：异丙醇和乙醇为易燃液体，闪点低于室温。应选择合适尺寸的容器以减少清洗过程中溶剂用量，确保容器松散覆盖，且此阶段不得无人看管超声水浴。
    3. 超声完成后，妥善处理异丙醇或乙醇废液，并用氮气吹干毛细管，操作时使用无尘纸巾夹持。

2. C-star凝聚物的制备与提取（图2）

实验装置中毛细管法的流体注入、清洗、密封和提取步骤。
图 2：玻璃毛细管中C-star混合物的加载及凝聚物的提取。 所有图示中均使用25 mM荧光素水溶液替代C-star混合物以增强可见性。(A-E) 退火前需依次执行的关键步骤，对应方案第2.1和2.2节。(F-J) 退火后需依次执行的关键步骤，对应方案第2.3节。在提取过程中（图(I-J)），只要将微量离心管垂直存放，DNA凝聚物便会从毛细管沉降到缓冲液储液池中。凝聚物肉眼不可见。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 单组分凝聚体制备C-star混合物
    注意：各种单个组件设计的序列细节可在 补充表1 以及以往的研究成果29,30,32. 步骤 2.1.9 和 2.2.2 中定义的慢速退火程序旨在确保纳米星网络弛豫为致密的形貌，因为纳米星网络的流变性能对温度具有强烈依赖性37.
    1. 寡核苷酸和缓冲液组分将根据所需的 C-star 结构设计而有所不同。准备一个 60 µL 单组分C星凝聚体的混合物在 5 µM 非响应型四臂C-star、TMSD响应型C-star或RNA模板型C-star的浓度。
    2. 针对每种设计，用移液器吸取相应列出的组分 补充表2 转移到另一支微量离心管中，用移液器充分混匀。
      注意：所有寡核苷酸储备液均假设处于 100 µM TE 中的浓度
    3. 抽出全部 60 µL C-star 溶液，并用移液管小心地将混合物注入已清洗并干燥的玻璃毛细管中，如图所示 图 2A，注意避免引入气泡。
    4. 使用移液器注入约 9-12 µL 在毛细管两端各加入矿物油，封住样品，确保C-star溶液与空气之间无自由界面（参见 图2B）。然后，用纸巾小心擦干毛细管，确保其外表面无油。图 2C），注意不要将矿物油或C-star溶液从毛细管中吸出。最终结果如图所示。 图 2D.
    5. 准备少量双组分环氧树脂胶，将毛细管两端平整面朝下粘附于玻璃盖玻片上。确保管口完全被胶覆盖，形成连续密封，如图所示 图 2E.
    6. 静置固化，至少3小时，最好过夜。
    7. 约30分钟固化后，检查胶层是否存在因气泡导致的密封缝隙。若存在此类缝隙，应使用少量胶水将其密封。
    8. 将粘附在盖玻片上的毛细管用锡箔纸包裹，确保锡箔纸在盖玻片底面保持平整。锡箔可确保盖玻片与PCR仪加热元件之间具有良好的热接触（见下一步）。
    9. 将包裹好的样品放入热循环仪中，并按照以下程序进行退火：保持在 95 °C 30 分钟，然后冷却 85 °C 到 50 °C 在 -0.04 °C·min-1，然后从高温冷却 50 °C 至室温，-0.5 °C·min-1.
      1. 将退火后的 C-star 凝聚物储存于 4 °C 或在室温下长期（数月）保存，只要毛细管保持密封即可，因为热退火能有效灭菌并使核酸酶失活。储存和操作期间应将毛细管平放，以防止冷凝液向一端沉积并聚集。
  2. 用于二元凝聚体的 C-star 混合物的制备
    注意：为指导双星系统中C星族成员的选择，可参考Malouf等人的研究工作., 描述二元C星型凝聚体的设计规则及预期相行为30.
    1. 为制备二元缩合物，将 30 µL 步骤2.1中所述C-star混合物的体积，加至总体积 60 µL，充分混匀，装入毛细管，然后按照步骤 2.1.4–2.1.8 操作。
    2. 将包裹好的样品放入热循环仪中，并按照以下程序进行退火：保持在 95 °C 30 分钟，然后冷却 85 °C 至 40 °C 在 -0.01 °C·min-1，然后冷却 40 °C 至室温（-0.1 °C·分钟-1.
  3. 从毛细管中提取C-star凝聚物
    1. 准备一个大容量（1.5 mL 或 2.0 mL）微量离心管，其中含有 60 µL 在TE缓冲液中含0.3 M NaCl。
    2. 拆开毛细管样品，使用金刚石刻划笔在粘合区域每个内端对应的盖玻片底面进行划痕图2F在此区域折断盖玻片，并妥善丢弃。
    3. 用乙醇彻底清洗毛细管并干燥。
    4. 用金刚石刻划笔在毛细管两端的底面先进行划痕图2G），然后将离心管翻转并标记为“正立”。
      1. 确保刻度线不与油水界面重叠，必须位于水相区域内，以防止油相残留在提取的样品中。
    5. 折断毛细管两端图2H），保留管子的中央部分，弃去其余部分。将切割好的毛细管放入步骤2.3.1中准备好的微量离心管中，确保毛细管底部与缓冲液接触（图2I).
    6. 凝聚体会在重力作用下从离心管沉降到缓冲液储液槽中；此过程至少持续10 min。图 2J）。移除切割后的毛细管并妥善丢弃。这种温和的提取方法可降低冷凝物聚集的风险。

3. 从RNA模板C-star凝聚体转录RNA适体

注意：在制备 Broccoli RNA 适配体时，需要使用二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮（DFHBI）溶液——首先将 DFHBI 粉末溶于二甲基亚砜（DMSO）中配制成 10 mM 的储存液，然后用无 RNase 和 DNase 的水稀释至 600 µM。

  1. 洗涤RNA模板化C-star凝聚体
    注意：RNA模板化C-star凝聚体需洗涤三次，以确保去除未结合的模板寡核苷酸。
    1. 让提取的凝聚体溶液静置至少5分钟，然后移除约一半体积的上清液。
      1. 对于60 µL体积的提取凝聚体，移除25–30 µL上清液。
      2. 从液面顶部进行移液，以尽量减少此步骤中移除的凝聚体数量。
    2. 加入与移除上清液体积相等的0.3 M NaCl TE缓冲液，并通过移液混匀。
    3. 重复前两步操作，共完成三个循环。
  2. T7转录混合物的制备
    ​注意：T7转录混合物使用CellScript T7-FlashScribe转录试剂盒制备。步骤3.2.2对制造商提供的操作流程进行了修改，原始流程可在此处查阅38。本文描述的是Broccoli RNA适体的转录过程，该适体在结合DFHBI后可诱导荧光。对于其他发光适体，请将步骤3.2.2中所述DFHBI的体积替换为相应的荧光原。对于其他转录产物，请完全省略该组分。
    1. 配制10 mM DFHBI的DMSO储备液，然后取适量用无RNase和DNase的水稀释至终浓度为600 µM。
    2. 将转录试剂盒组分在冰上解冻，随后使用无菌移液器吸头在室温下将以下组分加入已灭菌的微量离心管中：2 µL 10x T7转录缓冲液（试剂盒提供）、1.8 µL 100 mM ATP、1.8 µL 100 mM CTP、1.8 µL 100 mM UTP、1.8 µL 100 mM GTP、2 µL 100 mM DTT、2 µL 600 µM DFHBI、0.5 µL RNase抑制剂、2 µL T7酶溶液（试剂盒提供）。
    3. 通过移液轻轻混匀溶液。
    4. 制备完成后立即用于步骤3.3（RNA转录本合成）。
  3. RNA转录本的合成
    1. 向适合显微成像的腔室中加入3.3 µL经洗涤的RNA模板化C-star凝聚体，并加入先前制备的全部体积的转录混合物。
    2. 在向凝聚体中加入转录混合物后立即开始采集显微图像，持续18小时。
      注意：显微镜设置将取决于所使用的系统。请确保为样品中的任何荧光染料选择适当的激发和发射参数，并设置不会导致信号饱和的曝光时间。与所有延时成像一样，应在足够高的激光或LED功率以获得良好信号与尽量减少光漂白风险之间取得平衡。相较于基于激光的系统，基于LED的系统在长时间成像过程中可显著减少光漂白现象。建议成像时间间隔：前2小时每20分钟一次，之后每30分钟一次。

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结果

退火后，C-star 凝聚物可直接在毛细管中成像，或在提取后成像，以确认其形成。对于所有 C-star 设计变体，应观察到直径约为 10–50 µm 的明显球形或多面体状凝聚物，后者在发生结晶时形成28,32。对于单组分凝聚物，其外观应为离散且均一，可能呈现多面体形（图 3A）或球形（图 3B、C），具体形态取决于所使用的 C-star 设计。双组分凝聚物的形态则取决于所用 C-star 群体的性质，如前所述30。图 3D 显示了预期出现相分离的双组分凝聚物，可在明场成像中观察到。毛细管中的气泡也可能干扰凝聚物的自组装，常导致凝聚物在气液界面附近聚集（图 4A、B）。配制...

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讨论

本文所述方案提供了一种从两亲性DNA纳米星制备单组分或双组分凝聚体的方法，并可通过设计变异使凝聚体具备不同的响应特性。该方案在含有0.3 M NaCl的TE缓冲液中生成凝聚体，但可通过适当调整上述体积来改变缓冲条件。先前的研究已在含有0.2 M NaCl或0.1 M NaCl的TE缓冲液以及磷酸盐缓冲盐水（PBS）中研究了C-star凝聚体的形成过程32。C-star凝聚体的终浓度为5 µM，但也可通过适当调整上述方案中的寡核苷酸浓度和/或添加体积进行调节。根据所需变异，可能需要在与第1节所述不同的浓度和缓冲体系中配制寡核苷酸储备液，尽管实验操作的基本流程保持不变。C-star的设计可轻易修改以引入新的功能或响应特性，具体方法详见前期研究32。设计变异包括引入对pH变化32、钾离子31或特定寡核苷酸序列30,32有响应的结构基序。若...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

LM、LDM 和 DT 承认获得欧洲研究理事会（ERC）在“地平线 2020”研究与创新计划（ERC-STG No 851667 - NANOCELL）下的资助。LDM 承认获得英国皇家学会研究员研究资助（RGF/R1/180043）以及英国皇家学会大学研究员职位资助（UF160152, URF/R/221009）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 注射器滤器Sigma-AldrichSLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 矩形盖玻片，Menzel GläserVWR631-0853
2-丙醇Sigma-Aldrich34683
6 L 数显定时加热超声波清洗器，230 VACCole-ParmerWZ-08895-11
Araldite 快干型双组分环氧胶RSARA-400005
Bio-Rad C1000 梯度PCR仪Bio-Rad1851197
Brand 2 mL 带锁盖微量离心管Fisher Scientific15338665用于C-star凝聚物的提取
金刚石划线笔RS394-217
二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮（DFHBI）Sigma-AldrichSML1627
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-Aldrich472301
Eppendorf PCR Clean 无色安全锁离心管Fisher Scientific0030123301用于C-star混合物的制备
无水乙醇 99.8+%Fisher Scientific1043734170%乙醇足以满足清洁需求
Fisherbrand ZX4 IR 涡旋混合器Fisherbrand13284769
Hellmanex III 清洗剂Hellma9-307-011-4-507
空心矩形毛细管，内径 0.40 × 4.00 mm，长度 50 mmCM Scientific2540-50
矿物油Sigma-Aldrich69794
迷你离心机，230 VPRISM(TM)Z763128
NaClSigma-AldrichS3014
NanoDrop One 分光光度计Thermo Fisher ScientificND-ONE-W用于测定寡核苷酸的吸光度以计算浓度
寡核苷酸Integrated DNA Technologies定制寡核苷酸序列根据所需C-star设计而定
ScriptGuard RNase 抑制剂CELLSCRIPTC-SRI6310KRNase抑制剂
T7-FlashScribe 转录试剂盒CambioC-ASF3507
Tris-EDTA 缓冲液，100× 储存液Sigma-Aldrich574793
UltraPure 无DNase/RNase蒸馏水Invitrogen10977035
VWR Spec-Wipe 3 擦拭纸VWR21914-758

参考文献

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