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利用人肠道类器官在单细胞转录水平研究小肠上皮

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DOI：

10.3791/66749

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2024年6月28日

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1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

该方案结合了人类肠道类器官技术与单细胞转录组学分析，为此前尚未深入探索的肠道生物学提供了重要见解。

摘要

单细胞转录组学已经彻底改变了我们对人类机体细胞生物学的理解。先进的人类小肠类器官培养技术提供了 离体 能够弥合动物模型与临床研究之间差距的模型系统。将单细胞转录组学应用于人肠道类器官（HIO）模型，正在揭示胃肠道此前未被认知的细胞生物学、生物化学及生理学特征。先进的单细胞转录组学平台利用微流控分区与条形码技术生成cDNA文库。这些带有条形码的cDNA可由高通量测序平台轻松测序，并通过多种可视化工具生成图谱。本文描述了以不同形式培养和分化人小肠HIO的方法，以及从这些形式中分离出适用于单细胞转录谱分析平台的活细胞的操作流程。这些方案和操作流程有助于利用小肠HIO在多种不同环境下更深入地理解人肠上皮细胞在转录水平上的细胞应答。

引言

小肠上皮具有两个不同的区域：包含肠干细胞（ISC）的隐窝区和由分泌型及吸收型谱系分化细胞组成的绒毛区。上皮还具有区域特异性，使小肠不同区段具备独特的功能特性，这进一步增加了其复杂性。早期研究建立了培养条件，可同时生成人小肠隐窝区和绒毛区 离体 来自手术组织或组织活检1这些培养物正在弥合动物研究与临床试验之间的差距，揭示了胃肠道此前未被认知的细胞生物学、生物化学和生理学特性。HIOs 以三维球形结构进行扩增，培养所用培养基含有促进干细胞存活的生长因子以及细胞外支持基质。这些条件可形成类似隐窝的 HIO 模型，主要由前体细胞和干细胞组成。去除生长因子可促进肠干细胞（ISC）分化（形成类似绒毛的模型），并按适当比例生成成熟的肠上皮细胞（杯状细胞、肠内分泌细胞、簇细胞、肠细胞），同时伴随细胞增殖与分化、极性形成、屏障完整性、区域特异性特征以及适当的生理反应。2类器官培养物在隐窝样状态下具有遗传稳定性，并可无限传代。通过特定培养条件使其以单层形式生长，可便捷地接触这些培养物的顶端表面。3类器官还允许在生物分析中纳入宿主个体间的差异因素，例如遗传背景、年龄、性别、种族和疾病状态。其分析与功能评估工具与基于转化细胞系的研究方法相同，包括流式细胞术、显微成像、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多种分子技术。

单细胞转录组学通过揭示每种细胞类型在生物学过程中的个体贡献，正在彻底改变我们对小肠生物学与生理学的理解。利用该技术开展的开创性工作已描绘出天然人肠道中存在细胞类型的全景图谱4,5,6。单细胞转录谱分析平台可探索单个细胞的转录组景观，使细胞异质性成为科学研究的核心焦点。在某些单细胞转录谱分析平台中，通过微流控分区与条形码技术，可从每份样本最多10,000个细胞中提取的多聚腺苷酸化mRNA生成cDNA文库。在此类平台上，包含单个细胞、条形码寡核苷酸、逆转录试剂和油的液滴形成反应囊泡，使得来自同一个细胞的所有cDNA均带有相同的条形码。这些带有条形码的cDNA随后可通过高通量测序技术高效测序。所产生的数据可通过软件及可视化工具进行处理，将条形码序列转化为可视化图谱和单细胞转录谱。可利用公开的人小肠上皮数据库识别细胞群体4,5,6。尽管已有大量研究利用该平台在单细胞水平上分析小鼠肠道类器官，但对人肠类器官（HIOs）的单细胞转录响应分析仍相对滞后7,8,9,10,11,12。

本文提供了一步一步的实验方案，用于从小肠类器官（HIOs）中分离具有活性的细胞，以用于单细胞转录组分析平台的处理（图1）。我们提供了经过优化的上皮细胞分化培养体系及培养基组分的培养与分化指导。我们概述了三种不同培养模式下的细胞回收方法：三维（3D）培养、塑料培养皿上的单层培养以及膜插件上的单层培养。我们还提供了使用开源软件进行样本聚类分析所获得的数据，以鉴定各聚类中差异表达的基因。

方案

本研究所用的类器官系来自德克萨斯医学中心消化疾病中心GEMS核心实验室。简言之，为初步建立类器官系，供体组织样本经洗涤后进行酶消化以释放肠隐窝。隐窝被包埋于基底膜基质中，并在培养基中进行培养。贝勒医学院机构审查委员会已批准本研究方案，允许获取用于建立类器官系的组织样本，且所有供体均签署了知情同意书，同意使用其捐赠的组织建立类器官系。

1. 传代3D HIO以扩增并进行分化

  1. 从24孔板中培养的类器官（位于固体基底膜周围）孔内，使用P1000移液器吸除并弃去培养基。向孔中加入300 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，用P1000移液器上下吹打5次，机械性地将类器官打散。
  2. 在37 °C下孵育培养板4分钟。向每孔中加入500 µL不含生长因子的完全培养基（CMGF- 培养基）并添加10% FBS（表1). 使用 P1000 移液器，在孔中将 CMGF 培养基与 HIO 混合物反复吹打 10 次。将全部液体转移至 15 mL 离心管中。可将多个孔的传代液体合并至同一 15 mL 离心管中，但每管合并孔数不得超过 10 个。
  3. 在 4 °C 下使用水平转子离心机以 100 x g 离心细胞 g 5 分钟后，移除所有培养基，保留管底的沉淀。将管子置于冰上。
  4. 根据已接种的HIO数量计算所需的基底膜用量，并 使用预冷的P200枪头，将HIO沉淀物重悬于每孔30 µL基底膜中。使用预冷的P200枪头，将HIO与基底膜的混合物以液滴形式加入24孔板的中央。
  5. 将培养板转移至37 °C培养箱中，使基底膜在5–10分钟内凝固，随后加入500 µL室温的完全培养基，其中含有WNT、R-spondin、noggin、EGF和ROCK抑制剂（WRNE+Y）； 表1向每个孔中加入适量培养基，置于37 °C培养箱中培养。每隔一天用WRNE+Y完全更换培养基，持续培养7天。
    注意：健康的 HIO 应呈囊状，具有光泽的出芽状上皮（图2）。囊状体中部的细胞无法观察到。不健康的HIO外观暗淡，上皮较厚，中间呈实心状。最重要的特征是其发亮的外观。

2. HIO分化：三维形式

  1. 培养1周后，用一个3D HIOs孔制备三个3D分化HIOs孔。
  2. 移除孔中培养基。使用P1000移液器分散基底膜和HIOs，每孔加入500 µL冷CMGF-，上下吹打至少5次。在4 °C下使用摆动转子离心机以100 × g 离心5分钟，沉淀HIOs。移除所有上清液，保留管底沉淀。
  3. 每孔待铺板的HIOs中加入30 µL基底膜。用移液器将含有HIOs的30 µL基底膜液滴转移至24孔板的一个孔中。在37 °C孵育10分钟。加入500 µL WRNE+Y/Diff（50/50）培养基。
  4. 24小时后更换为分化培养基，继续培养3天，每隔一天更换一次培养基。每个样本准备三个孔进行合并，以减少技术变异。

3. HIO 分化：单层培养格式

  1. 包被 膜细胞培养小室或96孔板的孔中加入100 µL/孔人胎盘IV型胶原蛋白（1 mg/mL溶于100 mM乙酸），用冷H2O（1:30）。在37 °C孵育至少1.5小时，或最长过夜。对于膜式细胞培养小室，加入无菌H2在培养板的空间中加入 O，以保持培养板内的湿度；对于 96 孔板，加入无菌 H2未使用孔中的 O。
  2. 收集在 WRNE 培养基中培养 7 天的 3D HIO，移除培养基后，每孔加入 500 µL 冷的 0.5 mM EDTA（将 0.5 M EDTA 用无菌 PBS 稀释 1:1000 配制），回收基底膜及细胞。使用 P1000 移液器将类器官和溶液轻轻吹打 5 次，转移至 15 mL 离心管中。每管类器官样品勿超过 10 孔。300 × g 离心 5 分钟 g 在4 °C下使用水平转子离心。
    注意：制备96孔板中的3个孔，使用1孔3D HIOs。制备1个膜式细胞培养插入物，使用1孔3D HIOs（单细胞接种密度约为1–2 × 105 细胞/孔（96孔板），2.5–3 × 105 细胞/孔（用于膜培养插件）
  3. 移除 500 µL 培养基，保留管底沉淀。加入 500 µL 0.05% 胰蛋白酶/0.5 mM EDTA，于 37 °C 孵育 4–5 分钟，以解离 HIO。使用 P1000 移液器剧烈吹打约 50 次。移液时紧贴管壁，避免产生气泡。
  4. 加入1 mL含10% FBS的CMGF-以灭活胰蛋白酶。用1 mL含10% FBS的CMGF-润湿40 µm细胞筛网，将细胞悬液加至筛网上方，过滤未消化的细胞团块。依靠重力使细胞通过筛网，弃去含有细胞团块的筛网。
  5. 通过离心收集细胞，400 × g 离心 5 分钟 g 在室温下使用水平转子离心
  6. 从胶原蛋白包被的膜式细胞培养插入物或96孔板中移除液体。将HIO细胞团块重悬于含10 µM Y-27632的100 µL/well WRNE培养基中，然后移液至膜式细胞培养插入物的上室或96孔板中。对于膜式细胞培养插入物，在孔的下室中加入含10 µM Y-27632的600 µL WRNE培养基。
  7. 24小时后，从膜细胞培养小室的上层和下层或96孔板中移除培养基 并更换为分化培养基培养5天。每个样本准备3个孔，合并样本以减少技术误差。

4. 用于单细胞转录组学分析的分化后三维人肠道类器官单细胞悬液的制备

  1. 将酶解细胞消化试剂置于37 °C的CO₂培养箱中预热2 培养箱 在开始3D HIO消化前，将其解冻并预热30分钟。使用10倍明场显微镜检查HIOs，以确保细胞状态良好。
  2. 从孔中移除培养基，向每孔加入 500 µL 冷的细胞回收溶液。使用 P1000 移液器和标准移液器吸头，上下吹打数次，使细胞从基底膜上脱离。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微离心管中。
    注意：使用重复孔可确保足够的细胞数量，并减少孔间差异。在以下步骤4.7之前，不要合并各孔。
  3. 将细胞管置于冰上孵育10分钟，每5分钟上下吹打一次。在400 x g条件下离心3分钟收集细胞。 g 在 4 °C 下。
  4. 从离心管中移除液体，注意不要扰动细胞沉淀。用500 µL预热的酶法细胞消化试剂重悬细胞。使用P1000移液器上下吹打至少10次。
  5. 将 HIOs 在 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟2 培养箱中。每10分钟使用P1000移液器将全部体积吹打10次，以促进细胞解离。避免在细胞悬液中引入气泡。
  6. 离心细胞3分钟，400 x g g 在 4 °C 下。去除上清液，将细胞重悬于 1 mL 分化培养基中，并置于冰上保存。
    注意：从此步骤开始，HIOs 必须始终置于冰上。
  7. 使用 P1000 移液器快速吹打细胞 50 次，确保 HIOs 解离为单细胞。此步骤中需注意避免引入气泡，以免造成细胞损失。
  8. 使用P1000移液器枪头将全部液体通过70 µm滤嘴过滤，用1.5 mL微量离心管收集滤出液。
    注意：如果消化时间充足，滤芯吸头不会堵塞。若滤芯发生堵塞，请更换多个滤芯吸头；切勿强行将液体通过滤膜。
  9. 用40 µm孔径的滤筛重复步骤4.8。将样品置于冰上保存。
  10. 使用台盼蓝排斥法在细胞计数板上计数活细胞：将5 µL 0.4%台盼蓝与5 µL细胞悬液混合。根据需要将样品稀释至1000个细胞/µL。若细胞密度低于1000个细胞/µL，于400 × g离心2分钟收集细胞 g 在 4 °C 下，移除原始培养基，并用细胞培养基重悬。该方案通常可获得 5 x 105-1 × 106 细胞
    注意：制备高质量的单细胞悬液（90% 细胞存活且 90% 为单细胞）对于获得高质量的单细胞数据至关重要。然而，经验表明，当处理因素（如感染或小分子处理）影响细胞存活率时，细胞存活率低至 75% 也可接受。
  11. 根据制造商的说明书制备用于单细胞转录组分析平台的DNA文库。按照单细胞RNA测序数据分析的最佳实践方案处理数据13,14.

5. 在膜式细胞培养插件上分化的 HIOs 单细胞悬液的制备

  1. 在开始HIO膜细胞培养插件消化前，将酶解细胞消化试剂置于37 °C、含CO2的培养箱中解冻并预热30分钟。将预热后的酶解细胞消化试剂分装至1.5 mL微量离心管中，每管200 µL，每张膜细胞培养插件使用一管。将分装好的试剂管保留在37 °C培养箱中，直至使用。
  2. 通过向5 mL PBS中加入5 µL 0.5 M EDTA配制PBS-EDTA。将500 µL PBS-EDTA分装至24孔板中，每张膜细胞培养插件使用一孔。
  3. 用PBS-EDTA洗涤细胞：将含有生长培养基的孔中的膜细胞培养插件转移至含有PBS-EDTA的孔中。吸去顶端侧的细胞培养基，并替换为100 µL PBS-EDTA。操作时注意不要扰动细胞层。
  4. 立即弃去添加至膜细胞培养插件顶端侧的PBS-EDTA。将膜细胞培养插件从孔中取出，轻轻将其边缘接触纸巾以吸去多余液体，然后倒置放在实验台面上。使用锋利的手术刀片沿膜的内周缘切割，将膜从插件上取下。操作应迅速，以防止膜干燥。
  5. 使用镊子将膜转移至预先加热的、装有酶解细胞消化试剂的1.5 mL微量离心管中，并确保膜完全浸没。对所有其他膜细胞培养插件重复此步骤。
    注意：将酶解细胞消化试剂体积增加至500 µL可能有助于解离致密的单层细胞。
  6. 将装有膜的离心管置于37 °C、含CO2的培养箱中孵育以解离细胞。每10分钟用200 µL移液器轻柔吹打全部液体5次，共持续30分钟。避免产生气泡或吸入膜，以保持细胞活性。
  7. 每隔10分钟取少量细胞（1–2 µL）转移至载玻片上，通过定性评估单细胞比例来判断解离程度。根据HIO类型不同，可能需要长达50分钟并额外吹打才能达到80%–90%的单细胞比例。在混合过程中可用移液器枪头轻柔刮擦膜以促进解离，尤其适用于难以解离的细胞，但刮擦可能影响细胞活性。
  8. 将每种条件下3个重复孔的细胞合并至同一个1.5 mL微量离心管中（总体积600 µL）。加入400 µL细胞培养基（diff）和10 µM ROCKi（终体积1 mL）。用移液器轻柔混匀。
    注意：使用重复孔可确保足够的细胞数量，并减少孔间差异。此步骤应将各孔细胞合并。
  9. 使用1 mL移液器枪头将全部液体通过70 µm滤嘴过滤器过滤，收集滤过液至新的1.5 mL微量离心管中。
    注意：若消化时间充分，滤嘴不会堵塞。若发生堵塞，应更换多个滤嘴；切勿强行推动液体通过。
  10. 使用40 µm滤嘴过滤器重复步骤5.9。样品置于冰上保存。
  11. 使用台盼蓝染色排除法在细胞计数板上计数活的单细胞：将5 µL 0.4%台盼蓝加入5 µL细胞悬液中。根据需要将样品稀释至1000个细胞/µL。若细胞密度低于1000个细胞/µL，可在4 °C下以400 × g离心2分钟收集细胞，弃去原始培养基，并用WRNE+Y重悬至所需细胞密度。本方案通常可获得4 × 105 – 6 × 105个细胞。
    注意：制备高质量的单细胞悬液（90%活细胞且90%为单细胞）对于获得高质量的单细胞数据至关重要。然而，经验表明，在某些处理（如感染或小分子处理）影响细胞活性的情况下，细胞活性低至75%也可接受。
  12. 根据制造商的操作说明制备用于单细胞转录组分析平台的DNA文库。按照单细胞RNA测序（scRNAseq）数据分析的最佳实践方案处理数据13,14。

6. 从在96孔板中以单层形式分化的HIO制备单细胞悬液

  1. 在开始单层HIO消化前30分钟，将酶法细胞消化试剂置于37 °C、含CO2的培养箱中解冻并预热。
  2. 通过向5 mL PBS中加入5 µL 0.5 M EDTA配制PBS-EDTA。弃去96孔板中的细胞培养基，每孔加入100 µL PBS-EDTA，注意不要扰动细胞层。
  3. 消化细胞：弃去PBS-EDTA，每孔加入100 µL预热的酶法细胞消化试剂。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中，每隔10分钟用200 µL移液枪头轻柔吹打全液体体积5次，持续20–30分钟。避免产生气泡以保持细胞活性。
    注意：将酶法细胞消化试剂体积增加至500 µL可能有助于解离致密的单层细胞。
  4. 每10分钟取少量细胞（1–2 µL）转移至载玻片上，以评估解离程度。根据HIO类型不同，可能需要长达50分钟才能获得80%–90%的单细胞。在吹打过程中可使用移液枪头轻柔刮擦孔板表面以促进解离，尤其适用于难以解离的细胞；但刮擦可能影响细胞活性。
  5. 将每种条件下3个重复孔的细胞合并至一个1.5 mL微量离心管中（总体积300 µL）。加入700 µL细胞培养基（diff）+ 10 µM ROCKi（总体积1 mL）。用移液器轻柔混匀。
    注意：使用重复培养的孔可确保足够的细胞数量，并减少孔间差异。
  6. 使用1 mL移液枪头将全部液体通过70 µm滤嘴过滤器过滤，滤过液收集至新的1.5 mL微量离心管中。
    注意：若酶法消化时间充分，滤嘴不会堵塞。若发生堵塞，应更换多个滤嘴，切勿强行推动液体通过。
  7. 使用40 µm滤嘴过滤器重复步骤6.6。样品置于冰上保存。
  8. 使用台盼蓝染色排除法，在细胞计数板上对活细胞进行计数：将5 µL 0.4%台盼蓝加入5 µL细胞悬液中。根据需要稀释至1000个细胞/µL。若细胞密度低于1000个细胞/µL，可在4 °C下以400 × g离心2分钟收集细胞，弃去原始培养基，并用含ROCKi的细胞培养基重悬至所需细胞密度。本方案通常可获得2 × 105 – 6 × 105个细胞。
    注意：高质量的单细胞悬液（90%活细胞且90%为单细胞）是获得高质量单细胞数据的关键。然而，经验表明，在某些处理（如感染或小分子处理）影响细胞活性的情况下，细胞活性低至75%也可接受。
  9. 根据单细胞转录组测序平台制造商提供的方案制备DNA文库。按照scRNA-seq数据分析的最佳实践方案处理数据13,14。

结果

将来自膜式细胞培养小室、单层培养以及3D HIOs的2-3个孔的单细胞悬液合并，以确保获得足够的细胞产量并减少孔间差异。使用针对单细胞转录组分析平台的特异性试剂制备单细胞文库，并在下一代测序平台上进行双端测序，测序深度为30,000条读长/细胞。采用单细胞基因组学分析工具对读长进行比对、计数和分析。排除线粒体来源读长远超过20%或检测到基因数少于200个的低质量细胞。为评估细胞质量，我们绘制了每个细胞的基因数量、UMI数量及线粒体读长百分比（图3）；高质量细胞通常包含约3500个基因、15,000个UMI以及10%的线粒体读长。经过筛选后，根据HIO的培养方式不同，共获得4000至9500个单细胞。无监督聚类分析结合UMAP降维方法识别出代表预期细胞类型的多个明显细胞簇，包括吸收性肠上皮细胞和分泌细胞（图4）。

figure-results-1
图1：实验方案步骤概览。 示意图展示了将人肠道类器官（HIOs）以不同形式接种至单细胞数据工作流程中的主要步骤。本图像使用Biorender创建。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：明场图像。 准备好进行处理的HIO在5倍放大倍数下使用明场显微镜成像。左侧为3D类器官，中间为96孔板，右侧为Transwell。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：数据质量控制。 从在96孔板上以单层培养的空肠类器官（jejunal HIOs）中分离并分析的单细胞示例质控指标。小提琴图显示了每个细胞的基因数量（nFeature_RNA）、UMI数量（nCount_RNA）以及线粒体读段所占百分比（percent.mt）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图 4：分析的单细胞的UMAP图。 （A）从在96孔板中培养的已分化空肠HIOs中分离出共计9952个单细胞。 （B）从在膜性细胞培养插件上培养的已分化空肠HIOs中分离出共计5623个单细胞。 （C）从已分化的回肠三维HIOs中分离出共计4402个单细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

WRNE 生长培养基分化培养基
组分体积终浓度不含 L-WRN 条件培养基、烟酰胺和 SB202190 的 WRNE 培养基
*Y-27632 (5 mM) 可选 200 µL10 µM
A 83-01 (500 µM)100 µL 500  nM
Advanced DMEM/F1245 mL
B272 mL
EGF (50 µg/mL)100 µL50 ng/mL
胃泌素 (10 µM)100 µL10 nM
GlutaMax (100X)1 mL
HEPES 1 M1 mL
L-WRN 条件培养基50 mL~50%
N21 mL
N-乙酰半胱氨酸 (500 mM)100 µL 500 µM
烟酰胺 1 M1 mL10 mM
SB202190 (10 mM)100 µL 10 µM
总体积100 mL
CMGF- 培养基
 Advanced DMEM/F12 500 mL
 Glutamax 5 mL100X
 1 M Hepes5 mL

表1： 所用各种培养基的成分。

讨论

利用单细胞基因组学平台，可以将复杂的生物系统（例如模拟肠上皮的组织来源人肠道类器官（HIO）培养物）分解，以解析各个细胞对整体生物学反应的贡献4,5,6。同时，也可识别并深入研究细胞异质性及稀有细胞群体。为最大化基于单细胞转录组学平台的产出，需对细胞投入量进行优化。本文所述方案旨在获得高活力且高质量的单细胞悬液，从而提高获取下游高质量转录组数据的可能性。熟练掌握该实验流程至关重要，建议在正式开展文库构建前进行多次预实验。在将细胞用于文库制备前，应先确保能够稳定地获得具有活性的单细胞悬液。操作速度极为关键，因为操作越快，细胞活力越有保障。基于此，建议每次处理的样本数量应加以限制。在启动这些实验流程前，建议与负责文库制备的单位或人员进行沟通协作，以便在遇到问题时获得及时的技术支持。

人肠道类器官（HIO）的活性直接影响送测序的DNA文库质量。HIO的细胞活性取决于单细胞悬液制备过程中的多个步骤，包括解离、离心、缓冲液、移液和计数准确性。制备HIO样本平台的目标是在维持细胞活性与保证样本质量之间取得平衡。获得高质量数据的关键在于尽量减少细胞聚集体、死细胞、非细胞来源的核酸以及逆转录反应的生化抑制剂。濒死细胞会增加核酸背景噪音，并导致细胞成团，从而引起数据和平台运行失败7,8,9,10,11,12。使用合适孔径的滤膜进行过滤有助于去除大尺寸聚集体，提高数据质量。

在制备单细胞悬液时，需要考虑多个因素以尽量减少HIO细胞死亡。获得至少80%的活细胞是必要的，而>90%的细胞活力则更为理想。对于死细胞比例较高的样本，可通过去除死细胞的策略加以改善，例如使用基于柱的磁珠法，但这些方法由于操作过程中的细胞损失，需要更多的起始细胞和更大的样本体积。HIO对缓冲液特别敏感，若在室温下某些缓冲液中放置时间过长，会导致细胞死亡。使用类器官培养基可使细胞损失和聚集体形成最少。在解离过程中，移液操作也会影响HIO的细胞活力。普通孔径的吸头可通过剪切力帮助类器官解离成单细胞悬液，但使用普通孔径吸头过快地反复吹打可能因剪切力导致HIO细胞损伤。使用宽孔吸头缓慢吹打可最大程度减少对HIO细胞的机械应力，显著提高后续可用的活细胞数量。离心、洗涤和重悬也是影响HIO单细胞悬液质量的重要因素。采用摆桶式离心机可实现更温和的细胞沉淀，从而减少死细胞数量并最大限度降低细胞丢失。最后，准确的细胞计数以确定细胞浓度至关重要，可确保最大数量的细胞进入文库构建平台。关注这些细节将有助于在分离过程中最小化HIO细胞所受的应激，确保处理后获得数据的最大可能性。

尽管单细胞转录组学是一种在单细胞水平上解析生物学特征和应答的有力工具4,5,6，但在将其应用于分析人肠道类器官培养物时，仍需考虑若干局限性。首先，由于文库构建和测序过程中引入的技术变异，或样本制备导致的批次效应，可能产生显著的转录本变异。此外，测序可能导致覆盖度偏差，即不同基因或细胞间的测序深度不均，这在检测低表达基因或鉴定稀有细胞群体时会带来挑战。其次，由于类器官培养物本身存在细胞和转录异质性，且其细胞分化程度低于天然肠上皮，因此细胞类型的鉴定较为困难。将转录应答与功能表型关联也是一大挑战，需要借助其他方法或检测手段进行额外验证。第三，该方法未考虑细胞的空间背景或时间动态变化。解离过程破坏了从转录数据中推断细胞间相互作用的能力，仅能提供某一时间点的细胞状态快照，而非生物学上的连续过程。最后，单细胞转录组学方法成本较高，且需要专业的计算工具和生物信息学专业知识。然而，该方法仍是目前解析细胞异质性和鉴定新型细胞类型的主要前沿技术。

致谢

作者感谢以下资助项目：U19 AI157984、U01 DK103168、U19 AI144297、P30 DK56338、P01 AI057788、U19 AI116497 以及 NASA 合作协议通知/TRISH NNX16AO69A。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
[Leu15]-胃泌素 ISigma-AldrichG914510 nM
0.05% 胰蛋白酶-EDTAInvitrogen25300054
0.4% 台盼蓝Millipore-SigmaT8154
0.5 M EDTA康宁46-034-CI
1× PBS，无钙无镁康宁21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
24孔Nunclon Delta表面组织培养皿赛默飞世尔科技142475
40 µm细胞滤筛Falcon352340
40 µm Flowmi 小口滤网SP Bel-Art 实验耗材H13680-0040
70 µm Flowmi 小口滤网SP Bel-Art 实验器具H13680-0070
96孔板康宁3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
高级DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27添加剂Invitrogen17504-0441X
Chromium Next GEM 单细胞 3’ GEM，文库 & 凝胶珠试剂盒 v3.110x GenomicsPN-1000128
IV型胶原蛋白Sigma-AldrichC5533-5MG33 µg/mL
Corning 细胞回收溶液 VWR354253
DPBS（Mg²⁻, Ca²⁻）Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 mM
HEPES 1 MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN 条件培养基ATCCCRL-3276
基质胶，生长因子减少型，无酚康宁356231
小鼠重组EGFInvitrogenPMG804350 ng/mL
N2 补充剂Invitrogen17502-0481X
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165-5G500 µM
烟酰胺Sigma-AldrichN063610 mM
SB202190Sigma-AldrichS706710 µM
Transwell康宁3413
Y27632干细胞技术7230810 µM

参考文献

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