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下双翅目蝇类 Bradysia (Sciara) coprophila 的实验室培养：一种新兴/传统的模式生物

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DOI：

10.3791/66751

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2024年4月19日

1Department of Molecular and Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine, Brown University

本文内容

摘要

本文概述了低等双翅目蝇类Bradysia (Sciara) coprophila的实验室饲养方法（包括交配和喂养）。

摘要

双翅目下等蝇类 Bradysia (Sciara) coprophila 的实验室品系已维持了一个多世纪。本文介绍了 B. coprophila 实验室保种的操作方案。这些方案将有助于越来越多致力于研究 B. coprophila 独特生物学特性的实验室，这些特性包括：（1）雄性减数分裂 I 中存在单极纺锤体；（2）雄性减数分裂 II 中 X 二分体不分离；（3）染色体印记可区分母源与父源同源染色体；（4）生殖系特有（L）染色体；（5）染色体消除现象（雄性减数分裂 I 中消除父源染色体；早期胚胎中消除一条或两条 X 染色体；早期胚胎体细胞中消除 L 染色体）；（6）性别由母体决定（无 Y 染色体）；以及（7）在幼虫唾腺多线染色体的 DNA 泡位点发生发育调控的 DNA 扩增。

现在可以利用近期在 B. coprophila 基因组测序与组装方面的进展，以及基因组工程转化技术的发展，来研究染色体力学的诸多独特特征。使用 B. coprophila 开展研究的科学界日益壮大，本文所述的果蝇交配方案（用于产生仅含雄性或仅含雌性后代的母本的表型标记；生化实验所需的大量交配细节）、胚胎孵化检测、幼虫饲养以及其他有关其培养的注意事项，将为此类研究群体提供重要帮助。

引言

要全面理解生物学原理，需要研究涵盖生命之树的多种多样生物。尽管在19世纪末已描述了范围广泛的生物，th 20世纪中叶th 世纪以来，实验研究逐渐局限于十余种模式生物。随着基因组时代的到来，以及对生命之树中所有物种进行基因组测序的目标确立1现在，我们能够拓展用于实验室实验的生物种类，并充分利用其多样性优势。这类新兴模式生物的实验应用，前提是能够在实验室条件下进行培养和维持。本文介绍了培养一种新兴的“新/老”模式生物的实验方案。

地球上绝大多数动物生命由四大昆虫超级辐射类群构成2在昆虫中，双翅目（真正的蝇类）约有 158,000 个物种。3，蕈蚊科（Sciaridae，即黑蕈蚊）约有3000个物种4果蝇 果蝇 是双翅目昆虫中研究最为深入的一种。下等双翅目昆虫（Nematocera）， 蕈蚊属（Bradysia）曾称为 粪生毛蚊（Sciara coprophila），约2亿年前从 果蝇，这是一种“高等双翅目”蝇类（Brachycera）。因此 B. coprophila 在与之进行比较研究时具有有利的分类学地位 D. melanogaster (图1。此外， B. coprophila 具有许多独特的生物学特征，这些特征本身便值得深入研究5,6,7许多这些特征违背了DNA恒定性原则，即同一生物体的所有细胞具有相同的DNA含量。在 B. coprophila (i) 在雄性减数分裂Ⅰ期，父本基因组在单极纺锤体上被消除；(ii) 在雄性减数分裂Ⅱ期，X二分体发生不分离现象；(iii) 生殖系限定性（L）染色体从体细胞中被消除；(iv) 根据个体的性别，早期胚胎中会消除一条或两条X染色体。用于区分母本与父本同源染色体的染色体印记现象最早发现于 B. coprophila 在许多染色体消除事件中均发挥重要作用。除了染色体消除外，另一种突破DNA恒定性的机制是发育调控的、位点特异性的DNA扩增，该过程发生于幼虫唾腺多线染色体的DNA泡位点。对这些独特特征的研究需要实验室对 B.coprophila；其饲养管理的详细信息在此提供，以促进相关研究的开展。

显示双翅目、膜翅目关系及进化分支的昆虫系统发育树示意图
图1：Bradysia (Sciara) coprophila 的系统发育关系。 常用的模式生物以蓝色字体标出，其分类学目级分类以红色字体标出。Bradysia 及其他科罗蚊科（Sciarid）真菌蚊，以及蚊子，均属于低等双翅目昆虫（过去称为线虫亚目 Nematocera），而Drosophila物种则属于高等双翅目昆虫（亚目：Brachysera）。图左侧信息来自 Misof 等人33；右侧信息来自 Bertone 等人34 和 Wiegmann 等人2。请点击此处查看该图的放大版本。

此前，该属 蕈蚊属 拥有最多的物种数量（700种），是任何真核生物中物种数最多的，这促使Steffan对它们进行了细分8随后，Shin 提出将眼蕈蚊科细分为眼蕈蚊亚科（包含六个属，包括 斯奇拉菌、毛蠓属 和 Leptosciarella），亚科Megalosphyinae（包括属 Bradysia）以及另外三个组（包括 Pseudolycoriella)9近年来，多个研究团队对毛蚊科的系统发育关系进行了进一步研究。9,10,11在过去的几十年中，许多眼蕈蚊科（Sciaridae）生物的名称发生了变化12尽管一个多世纪以来的大多数文献都将我们研究的生物体称为 Sciara coprophila，其当前的分类学名称现在为 Bradysia coprophila（异名：Bradysia tilicola 及其他同物异名）10它们在全球范围内均有分布，通常被称为菌蚊，因其以蘑菇和其他真菌为食。该类群最早由Meigen于1804年首次描述。13 在欧洲，随后由Johannsen14,15 在北美。 B. coprophila 于冷泉港实验室收集，并由查尔斯·梅茨（Charles Metz）在20世纪初作为哥伦比亚大学托马斯·亨特·摩根（Thomas Hunt Morgan）的研究生时建立了实验室品系。因此，当前的品系反映了长达一个世纪的近交历史。同样，该生物的生物学特性 B. coprophila 由海伦·克劳斯（Helen Crouse，曾在芭芭拉·麦克林托克指导下完成其博士研究）开展的数十年细胞遗传学研究进一步阐明了这一问题。

20世纪30年代， Bradysia (蕈蚊属）与……竞争 黑腹果蝇 作为遗传学研究的模式系统。尽管其具有多种独特的生物学特征， B. coprophila 被……所掩盖 D. melanogaster 作为一种常用的模式生物，因为后者更容易实现辐射诱导的表型突变，而这类突变在遗传学研究中是必需的，尽管 B. coprophila 对γ射线辐照的抗性仅略高于 D. melanogaster16在基因组学的现代时代，这已不再是一个问题。由于基因组序列17,18,19 （Urban、Gerbi 和 Spradling，数据未显示）以及转化方法20,21 （Yamamoto 和 Gerbi，数据未显示）用于 B. coprophila 最近已有相关资源可供使用，现在正是将其作为一种新兴/传统并存的模式系统加以利用的时机，这一点从越来越多的科研人员将其应用于研究中可见一斑。本文介绍了该系统在实验室中的维持方法。

B. coprophila 没有Y染色体，子代的性别由母本决定。携带具有长臂近端倒位的X'（“X-primed”）染色体的雌性只产生雌性子代，而对标准（非倒位）X染色体呈纯合状态的雌性则只产生雄性子代5（图2）。目前已有X'染色体的序列信息19，但X'染色体决定子代为雌性的分子机制仍有待阐明。雄性从不携带X'染色体，受精后，雌性为X'X（X'杂合）或XX。成年X'X雌性可通过翅上的表型标记与XX雌性区分（图3）。X'X雌性（只产生雌性子代）可通过X'染色体上的显性“Wavy”（W）翅标记识别（如HoLo2品系）22。相反，XX雌性（只产生雄性子代）可通过X染色体上的隐性“petite”（p）翅标记识别，如91S品系23。在此情况下，X'Xp雌性具有全长翅（非petite翅），且只产生雌性子代。品系6980在X染色体上携带一个隐性“swollen”（sw）翅脉标记24，同时在X'上具有显性Wavy标记，因此可用于杂交筛选的两个标记。Wavy翅表型的表达程度可能存在变异，在培养瓶中个体过密、食物不足或温度过高时，其表型似乎较弱。若将幼虫置于低温环境（4°–8 °C）而非通常的21 °C培养，则Wavy翅表型表现尤为明显。尽管隐性petite翅标记表型稳定且易于识别，但由于91S品系的健康状况不如HoLo2品系，因此使用频率较低。本文展示了B. coprophila的交配方案（图2），并详细描述了HoLo2、7298和W14品系（补充文件1）、91S品系（补充文件1）、6980品系（补充文件1）以及易位品系（补充文件1）的交配设计。这些易位品系现已不存在，它们是X染色体短臂上含有核糖体RNA基因区域的异染色质区（H1、H2和H3）发生的相互易位25,26,27。

遗传图解；性连锁性状；配子形成；合子发育；X染色体。
图2：B. coprophila 的交配方案。 该生物没有Y染色体（雄性体细胞仅含一条X染色体）；子代的性别由母体决定。XX型母体只产生雄性后代，而X'X型雌性只产生雌性后代。与X染色体相比，X'染色体具有一个长的臂内倒位。在本图中，X（或X'）染色体的父源或母源谱系分别用蓝色或红色表示。精子的常染色体为单倍体，但由于减数分裂II期不分离，含有两条X染色体。早期胚胎的体细胞谱系会根据个体将发育为雌性或雄性，分别消除一条或两条父源X染色体。请点击此处查看该图的放大版本。

昆虫翅形态比较；特征标注；显微图像，生物学研究
图3：翅表型的 B. coprophila. 成年雌性果蝇表现出多种翅表型：（A）直翅型（XX），（B波状翅（X'WX），（C) 极度波状翅 (X'WX）表型在将幼虫置于低温房间储存后呈现皱缩外观m (D）小翅（XpXp），呈类似残翅状，（E直翅，野生型（XX），翅脉无肿胀, (F直翅且翅脉肿胀（XswXsw），翅的上边缘和/或两翅顶端附近出现小泡状结构（黑色箭头），G）肿胀的极端示例，其中一只或两只翅膀上出现水泡（白色箭头）。雄性缺乏X'染色体，因此不会出现波状翅，但在91S品系或6980品系中分别表现为小型翅或肿胀翅。比例尺 = 1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

在品系保种过程中，目标是进行交配操作，其中一半交配来自产生雌性后代的母本，另一半来自产生雄性后代的母本，以使下一代中雌性和雄性成虫数量相等，用于后续的交配。然而，这一过程需要周密规划，因为雄性的生命周期比雌性短，成年雄性比成年雌性早最多一周羽化。自然界通过一种机制来适应这种性别间的不同步：在同一日期进行交配后，雄性胚胎比雌性胚胎晚1-2天孵化为幼虫。然而，为了确保实验室交配时雄性和雌性成虫能同时可用，可通过将含有雌性幼虫的培养瓶置于室温而非21 °C下培养，或把含有雄性幼虫的培养瓶置于稍低的温度（例如16 °C）来适度加快雌性发育速度。另一种更可靠的方法是在同一周的星期一使用产生雌性后代的母本进行交配，而在星期五使用产生雄性后代的母本进行交配。我们所采用的最简便方法是每周在同一天对产生雌性和雄性后代的母本同时进行交配，并在接下来的每一周都于同一天重复该操作。在此策略下，第1周交配产生的成年雌性可与第2周交配产生的成年雄性进行交配。

B. coprophila 雌虫在 21 °C 条件下培养时，其生命周期为 5 周（表 1）。在较低温度下或营养不足时，其生命周期略长。雄性 B. coprophila 的生命周期约为 4–4.5 周，因其化蛹时间比雌性早 0.5–1 周。每个幼虫龄期的结束均以蜕去表皮为标志，该过程由类固醇激素蜕皮酮（ecdysone）水平的短暂升高所触发。与具有三个幼虫龄期的 D. melanogaster 不同，B. coprophila 具有四个幼虫龄期。

发育阶段交配后天数（dpm）阶段持续时间（天）
产卵1-2
胚胎1-2 至 7-8约 7 天
幼虫
1、2 和 3 龄幼虫7-8 至 16-19约 10
4 龄幼虫（眼斑出现前）16-19 至 21-245
4 龄幼虫（眼斑期）21-24 至 25-284
蛹25-28 至 30-335
成虫在 21 °C 下若已交配则存活 1-2 天，或在 16 °C 下若未交配则存活 2-3 周。

表1：21 °C下雌性B. coprophila的生活史。

B. coprophila 可在 15 °C–25 °C 范围内的任何环境中饲养，较低温度下发育进程较慢。这种昆虫偏好潮湿环境（常见于室内盆栽植物或蘑菇培养床的土壤中），因此我们在培养箱中放置一个盛有去离子水的烧杯以维持湿度。B. coprophila 也可在室温下饲养于带松动盖子的金属面包箱中，并在箱内放置一个盛水的烧杯；但当温度达到 37 °C 时，它们会发生热休克28，在炎热气候条件下存在风险。Michael Ashburner 及其他研究者曾尝试将 D. melanogaster 低温保存以减少保种所需时间，但收效甚微。相比之下，B. coprophila 的一个主要优势在于：含有中期幼虫的培养管可在冷藏室（4–8 °C）的开放货架上保存长达 3 个月，仅需每月喂食一次，管理极为简便。在低温下，它们的发育极其缓慢，可一直维持至蛹期；当将培养管重新移回 21 °C 环境时，个体可正常羽化为具有繁殖能力的成虫。这一现象可能模拟了其在自然环境中的越冬过程。这种由低温诱导的发育停滞可能与经 γ 射线照射中期 B. coprophila 幼虫后所观察到的现象类似16，但在已越过不可逆发育节点的晚期幼虫中，则不会出现发育停滞现象。

方案

本文所述方案凝聚了查尔斯·梅茨（Charles Metz）、海伦·克劳斯（Helen Crouse）和苏珊·格贝（Susan Gerbi）先后管理的Bradysia（Sciara）品系保藏中心长达一个世纪的经验，同时也吸收了其他研究人员的贡献。

1. 杂交交配

  1. 每只直径为28 mm的玻璃小瓶使用1只成年雌性和2只成年雄性。当能够以100%准确率识别仅产雌性或仅产雄性子代的母本翅型表型后，可将每瓶调整为2只雌性和2只雄性，以增加每瓶幼虫数量。向小瓶中添加个体时，应先加入雌性，再加入雄性，因为雄性从麻醉状态中苏醒的速度快于雌性。
    注意：以下描述假定您已拥有 CO2；或者，也可使用乙醚麻醉成年果蝇。
  2. 若使用乙醚麻醉成年果蝇，需将一张折叠的实验室擦拭垫用胶带固定 （例如 Kimwipes）擦拭纸放入 Coplin 染色缸的圆形玻璃盖内侧，用滴管从瓶子中吸取少量乙醚滴加至擦拭纸上，使其湿润但不饱和，避免乙醚液体滴落导致果蝇溺亡。在执行下文步骤 1.6 时，将湿润的乙醚擦拭纸置于打开的试剂瓶口上方约 1 分钟，直至成虫停止活动。一旦将成虫转移至白色陶瓷板（替代白色果蝇麻醉板）上，当果蝇腿部开始抽动时，应定期将新湿润的乙醚擦拭纸悬于（不接触）果蝇上方约 1 分钟。
    警告：乙醚易燃，应储存于通风橱中，不得存放在冰箱内。
  3. 在触手可及的范围内摆放三个托盘：一个装有雌性成虫小瓶的托盘，一个装有雄性成虫小瓶的托盘，以及一个装有含2.2%（wt/vol）琼脂的空小瓶的托盘。在实验台面上放置标示牌，注明 "女性" 或 "男性" 并记录母本的翅型表型，以便将用于杂交的成虫管放入正确的组别中，其中一组的所有管中仅含有雄性子代，另一组的所有管中仅含有雌性子代。
    注意：确保小瓶内无冷凝水滴，否则成虫会粘附在水滴上。若小瓶曾存放在塑料盒中，使用前应将其置于室温下的实验台上至少1小时，以使冷凝水蒸发。
  4. 打开 CO2 气体和解剖显微镜用灯。
    注意：建议使用带有光纤的光源，因其产生的热量较少，可减缓麻醉果蝇的苏醒速度。
  5. 用力轻敲装有成虫的瓶子底部，将其置于橡胶垫上，使成虫全部落至瓶底，随后拔出瓶塞；插入 CO₂2 枪嘴并重新装回塞子。
  6. 按下喷嘴扳机，使 CO2 流入小瓶约1分钟以麻醉成虫。
  7. 将脚放在脚踏板上，以开启 CO2 将流向白色果蝇垫，而非枪头喷嘴。在整个果蝇位于白色果蝇垫期间，持续踩下脚踏板（或在果蝇腿部开始抽动时，间歇性踩下脚踏板）。
  8. 取下小瓶的喷嘴和塞子，将小瓶倒置在解剖显微镜下的白色飞虫垫上。
  9. 将倒置的试剂瓶底部轻敲显微镜，使成虫从瓶中落入白色接虫板上。
  10. 选择腹部最饱满的成虫（刚羽化、腹部呈白色的个体），用尖头镊子轻轻夹住成虫的中足或后足将其拾起。注意不要损伤用于求偶舞蹈的前足。不要使用刚刚羽化、全身完全白色尚未变黑的成虫，因为它们的翅膀较短且未充分发育，无法准确评估翅表型。腹部较瘦的成虫仍可使用，但其生育力较低。不要使用身体瘦弱且翅膀垂直竖立于体外的成虫，此类个体已经死亡。
  11. 用另一只手取下装有2.2%（wt/vol）琼脂的试剂瓶的塞子。用持镊子的手轻轻敲击试剂瓶内壁顶部，使成虫落入瓶底。将塞子重新插入试剂瓶中。
  12. 重复上述步骤1.5–1.11，为每支含有雌性成虫的试剂瓶进行设置。使用画笔将未使用的果蝇从白色果蝇操作垫上扫回其亲本试剂瓶中。在亲本试剂瓶的标签上打勾，以标明其已用于交配（如有需要，可再次使用）。
  13. 为常规品系保种，需准备6-8管雌性亲本和6-8管雄性亲本图4将一半的小瓶用来自一个成虫小瓶的母本（或父本）进行设置，另一半新小瓶则使用另一个成虫小瓶的母本（或父本），以最小化遗传瓶颈。
    1. 偶尔，染色体错误分离事件会在产生雌性的培养瓶中产生例外雄性个体。若在含有成年雌性的培养瓶中发现例外雄性，应立即移除并压碎以处死该雄性。如有可能，丢弃该培养瓶中的所有雌性，并等待数天，直至有新的成年雌性羽化，方可安全用于杂交实验。
      注意：最好不要使用该瓶中的雌蝇进行杂交，因为它们可能已与异常雄蝇交配，导致无法产生可育的杂交后代。
  14. 一旦将成年雌性个体加入所有小瓶后，重复步骤1.5–1.11，向其中加入两只成年雄性个体（图4将每管已装有雌蝇的样品管分别加入两只雄蝇。将装有雌蝇的管子轻敲在橡胶垫上，使雌蝇沉降至管底，再依次加入两只雄蝇，以防其逃逸。
    注意：操作需迅速，且不可过度麻醉成年果蝇，否则会导致其死亡。
  15. 为每个小瓶贴上标签，注明品系、杂交组合（雌性或雄性子代）、母本来源（来自成虫小瓶#1或#2）以及交配日期。同时将上述信息记录于实验 notebook 中，并注明每种杂交组合所设置的小瓶数量。
    注意：在托盘中，用一张纸巾将产生雄性果蝇的培养瓶与产生雌性果蝇的培养瓶隔开，操作更为方便。
  16. 将小瓶静置在台面上约15分钟，以确保成虫苏醒并开始飞行。观察其是否在苏醒后立即发生交配行为（雌雄个体尾部相对，雄性的抱握器会抓住雌性尖形的产卵器）图4，底部).
    注意：成年雌蝇一生中仅接受一次交配，因此交配后切勿摇动或碰撞试管，以免在交配过程中使雄蝇与雌蝇分离，导致该雌蝇无法再次交配。
  17. 将交配瓶所在的托盘放入培养箱中（例如，21 °C). 在托盘上标注品系名称（例如 HoLo2）以及5周循环中的周数（第1、2、3、4或5周）。
    注意：将装有新近交配果蝇的培养皿放置在培养箱的独立区域或另一个培养箱中，以提醒自己在幼虫孵化前（如下所述）不要给培养瓶喂食。

2. 群体交配

注意：通常，单只B. coprophila雌虫的子代数量约为60只。当实验需要更多子代时，可采用群体交配方式，而非上述的单对交配。若仅需在交配后一天收集母体用于诱导产卵和胚胎收集，群体交配可在标准的直径28 cm玻璃试管中进行。然而，若需要获得更大量的幼虫，则应在表面积更大的广口瓶中进行群体交配，以避免过度拥挤。在广口瓶盖上穿刺数个小孔，以确保幼虫能够获得足够的空气呼吸。

  1. 按照第1节中的上述步骤操作，但使用尖头镊子将所有产雌性后代的母本（或所有产雄性后代的母本）移至白色蝇垫的前角。取10-15只麻醉后的肥胖成年雌蝇，用画笔将这群个体扫入瓶或罐中，瓶盖或罐盖上需扎有小孔。
    注意：为避免过度麻醉影响交配受精，应迅速完成步骤2.1和2.2，以实现大量交配。
  2. 选取20-25只麻醉后的肥胖成年雄蝇，用尖头镊子将其移至白色蝇垫的前角。
  3. 将装有雌蝇的瓶子或罐子在橡胶垫上用力轻敲，使雌蝇不会在打开塞子或瓶盖时逃逸，随后用画笔将白色蝇垫上前角麻醉的成年雄蝇群体扫入其中。

3. 群体交配后的胚胎收集

  1. 交配后一天（24 小时），执行步骤 1.5–1.11，以麻醉成年果蝇（雌雄混合），并将它们转移至白色果蝇垫上。
    注意：成年果蝇交配时卵子发生尚未完成，交配会触发减数分裂的完成；当卵子排出时，储存在受精囊中的精子使其受精29。卵子发生完成可能需要 1–2 天，因此在诱导产卵前需等待 1 天。
  2. 用尖头镊子夹住一只成年雌蝇的翅膀，将其放置于直径 100 mm、含有 2.2%（wt/vol）琼脂的培养皿中，使翅膀插入琼脂内。依次对白色果蝇垫上的每只成年雌蝇重复此操作。将成年雄蝇丢弃。
  3. 当所有雌蝇均被固定在琼脂上后，用镊子轻轻挤压其头部，直至雌蝇出现类似抽搐的动作，以此诱导其产卵；也可轻轻挤压其胸部。随后，雌蝇将在 30–60 分钟内产出一批受精卵。用经水润湿的实验室擦拭纸沾湿培养皿盖内侧后盖上，以防止卵因静电吸附于皿盖。

4. 检查幼虫的"孵化"情况

  1. 检查 "孵化" 交配后1周观察试管中幼虫情况；取出试管中的塞子，使用解剖显微镜观察并记录幼虫。幼虫的黑色颚部会反复开合，并缓慢向前移动。如果幼虫数量较少，请记录 "少数" 在小瓶标签上做标记，以提醒减少对该小瓶的喂食量。检查该次交配所设的培养板中每个带有该标记的小瓶，将含有幼虫的小瓶数量记录在笔记本上，紧邻该次交配所设置的小瓶总数一栏旁。
    注意：深黄色的卵无法发育。白色的卵则有可能发育，在幼虫孵化前1天，卵的前端会出现黑色色素（未来的颚部）。不要将霉菌误认为幼虫，霉菌呈白色丝状，末端带有黑色球状结构，但不会移动；而幼虫可在琼脂上向前爬行。
  2. 向每个装有幼虫的样品瓶中加入少量稻草（仅一次），以控制过高的湿度，并为幼虫提供遮蔽或藏身处。
  3. 将托盘转移至培养箱（例如，21 °C）将前几周交配杂交所得的幼虫培养皿一并放置，并开始向装有新孵化幼虫的试管中添加食物（参见下文关于喂养的部分）。
    注意：幼虫通常会聚集在它们已死亡的母亲附近，并开始取食母体；推测这一过程可将母体肠道中的酵母转移至幼虫肠道内。可在幼虫孵化当天或孵化后两天内开始喂食。警告：若延迟喂食，幼虫将相互取食，最终每支试管中仅剩一只肥胖的幼虫！
  4. 继续每周检查3次尚未出现幼虫的试管。若7至10天后仍无幼虫出现，弃置该试管或留存用于清洗。

5. 制备食物

注意：所有食品原料均应无农药残留！

  1. 使用汤匙按体积量取以下成分，并将其放入金属或玻璃容器中（例如 8 英寸 × 8 英寸的金属烤盘）：4 份燕麦草（8 汤匙）、2 份香菇粉（4 汤匙）、1 份菠菜粉（2 汤匙）、1 份荨麻粉（2 汤匙）。用汤匙在容器中将各成分充分混合。
    注意：也可用 2 份菠菜粉或 2 份荨麻粉替代 1 份菠菜粉加 1 份荨麻粉。
  2. 用铝箔纸盖住容器，在干燥循环条件下进行高压灭菌处理 20–30 分钟。然后静置过夜或更长时间，使其冷却至室温。
  3. 移去容器上的铝箔纸，用汤匙以研磨动作将已灭菌结块的食物混合物打散，制成粉末状混合物。
  4. 加入 1 份（2 满汤匙）酿酒酵母，并与高压灭菌后的食物混合物充分混合。
    注意：酿酒酵母不进行高压灭菌，以免杀死酵母。
  5. 将食物混合物转移至无菌带盖玻璃瓶中。
    注意：可使用与大规模交配实验相同的 240 mL 玻璃瓶，上述配方恰好可装满一瓶。同样，应将相同类型的无菌带盖玻璃瓶装入仅经高压灭菌处理的稻草（稻草需在覆有铝箔纸的容器中灭菌）。

6. 喂养

注意：根据幼虫的年龄和数量调整投喂食物的量。对于大量交配后产生的含有较多幼虫的培养瓶，应给予充足的食物。而对于仅需存放数天以进行发育阶段鉴定的培养皿中的幼虫，则只需轻轻撒上少量食物。下述投喂方法由 Charles Metz 实验室研发29，其实验室以及 Helen Crouse、Susan Gerbi 等人已成功使用该方法长达一个世纪之久。

  1. 洗手并彻底冲洗以去除肥皂残留。
    注意：不建议戴手套，因为手套会降低手指的触感，从而影响对每支试管喂食量的控制。
  2. 在幼虫培养的培养箱（例如 21 °C）中，存放一个带盖的无菌瓶，内装粉碎的稻草，另存一个无菌瓶，内装培养基。打开瓶盖，将部分培养基倒入干净的容器（例如糖果碟）中以便取用；将剩余培养基的瓶子重新盖好。将盛有培养基的敞口容器置于金属或玻璃小托盘中，以防止螨虫或其他昆虫爬过托盘壁进入食物容器。
  3. 用中指和无名指之间（或拇指与中指之间）夹取适量培养基。另一只手从托盘中取出一支试管，拔去塞子，并在喂食时用手指夹住塞子。观察试管内幼虫的发育阶段和数量，通过旋转夹有食物的两根手指，将适量培养基加入试管中。刚孵化幼虫的试管只需加入几粒食物；较年长幼虫的试管则应加入一层薄薄的培养基，覆盖琼脂表面。
  4. 若试管内出现白色霉菌，可用70%乙醇喷湿实验室擦拭纸，清洁一根长金属探针（例如带木质手柄的探针），拔去试管塞后，将清洁的探针插入试管，轻敲以压下琼脂表面的霉菌。若霉菌较多，可旋转探针使霉菌缠绕其上，从而将其从试管中移除。注意不要扰动琼脂表层，因为幼虫生活于此；仅需添加少量食物，然后重新塞上试管塞。在存放探针或用于清洁其他试管前，须用蘸有70%乙醇的擦拭纸将探针擦拭干净。
  5. 当托盘内所有试管均完成喂食后，将该托盘放回培养箱，并取出下一个托盘进行喂食，操作同步骤6.3。
  6. 喂食结束后，将容器中剩余的培养基倒回先前灭菌的瓶子中，盖紧瓶盖，并存放于培养箱内。

7. 在培养皿上收集幼虫或蛹

  1. 对于少量幼虫，使用经70%乙醇擦拭的金属探针或刮铲插入小瓶中琼脂表层，将附着有部分幼虫的琼脂转移至直径100 mm、内含半量2.2%（wt/vol）琼脂的无菌培养皿中。
  2. 对于较大量的幼虫，将刮铲沿小瓶底部内壁插入，轻轻将琼脂塞从小瓶中推出，并将其正面朝上置于一个空的培养皿中。在解剖显微镜下找到位于琼脂塞顶部的幼虫，用尖头镊子将其转移至一个直径为100 mm、内含半量2.2%（wt/vol）琼脂的无菌培养皿中。
  3. 使用解剖显微镜和尖头镊子将幼虫按相同的发育阶段分组。
    注意：由于轻微的发育不同步，含有2.2%（wt/vol）琼脂的培养皿中会出现多个不同群集的分选幼虫。
  4. 加入少量食物，将含有幼虫的培养皿放入培养箱中。每天取出培养皿，在体视显微镜下观察，以挑选目标发育阶段的幼虫。
    注意：在DNA泡研究中，早期眼斑幼虫会依次经历10x5、12x6、14x7以及边缘眼/垂颌阶段，每个阶段大约持续1天 30,31选择复眼为深色的蛹 ¼ 至 ½ 充满色素，以显示蛹期精巢中的减数分裂I和II阶段。

8. 幼虫的冷室储存

  1. 作为备用，将连续两周杂交所得的雌性幼虫和雄性幼虫各约四管，保存在冷室中。
  2. 用于备份储存时，饲喂处于早期四龄的幼虫th 幼虫（眼点前期）放入冷室货架上的开口托盘中，每月仅喂食一次。
  3. 将连续两周交配杂交产生的16个西林瓶从低温环境中取出（可在日历上标记以作提醒），放置于培养箱中（例如21℃） °C）正常喂养，使其发育为成虫用于杂交实验。
  4. 当从冷藏室取出小瓶后，立即放入一组新的、含有早期4th 在冷室中保存各龄期幼虫，以便这些小瓶可随时作为品系的备用储备。
    注意：不同发育阶段的样品在冷藏保存后的存活率尚未经过系统测试，但根据我们的经验，早期4th 幼虫龄期效果良好。

9. 小瓶清洗

  1. 成虫死亡后（约羽化后 2-3 周），将培养瓶从培养箱中取出，并置于 60-70 °C 环境中 1 小时，以杀死任何残留的生物体。
  2. 移除棉塞，并将其存放在塑料盒中。
  3. 使用刮勺将培养瓶中的琼脂塞刮入废液桶中。
  4. 将培养瓶浸泡在水槽的水中过夜或更长时间。
  5. 使用专为此用途保留的试管刷（切勿用于接触过化学试剂或肥皂的容器），在流动的自来水下上下刷洗培养瓶内部。将清洗后的培养瓶口朝下放置于金属篮中。将清洗干净的培养瓶陆续放入篮中。
    注意：切勿在培养瓶中使用肥皂，因为任何残留的肥皂都可能杀死 B. coprophila。
  6. 为篮子加盖金属网盖，用手按住盖子，将篮子倒置，使去离子水充满所有培养瓶。继续保持盖子固定，再次将篮子翻转以排空去离子水。重复此去离子水冲洗步骤 4 次。
  7. 将装有清洁培养瓶的篮子置于纸巾或开放式网状平台（如实验推车）上，晾干过夜或更长时间。将干燥后的培养瓶存放在抽屉中。
    注意：切勿让含有死亡成虫的培养瓶长时间未清洗，以免引发螨类污染。

10. 倒琼脂

  1. 取一个大容器（金属篮或金属托盘），放入干净的小瓶，并在每个小瓶中塞入一个棉塞。清洗旧小瓶时取出的棉塞可重复使用，直到棉塞降解破损后才应丢弃。将装有棉塞的小瓶放入容器中，在干燥模式下高温灭菌约 30 分钟，然后冷却至室温，存放于灭菌容器中备用。应始终准备两个这样的容器（一个正在使用，一个备用），以确保随时有已灭菌并带棉塞的小瓶可用。
  2. 将 11.0 g 琼脂粉加入 1 L 锥形瓶中，加入 500 mL 蒸馏水，配制成 2.2%（质量/体积）的琼脂溶液，该体积足够灌注约 24 个小瓶（每瓶约 21 mL）。轻轻旋转混匀，然后将锥形瓶放入微波炉中。
    注意：从此时起，操作锥形瓶时应始终佩戴耐热的灭菌手套。若需要，相同的 2.2%（质量/体积）琼脂溶液也可倒入培养皿（用于单只幼虫筛选）或广口瓶（用于大规模交配）中。
  3. 微波加热 1 分钟，取出锥形瓶轻轻旋转混匀，再放回微波炉中继续加热 1 分钟。重复此过程数次。
  4. 通过微波炉的玻璃门观察锥形瓶内情况。当琼脂溶液开始起泡并沸腾上升时，立即手动停止加热。此时切勿摇动锥形瓶（以防暴沸），小心将其从微波炉中取出，放置在实验台上静置数分钟。
  5. 取下一个已灭菌小瓶的棉塞，用一只手握住；另一只手将约 2.5 cm 高的 2.2% 琼脂溶液倒入该灭菌小瓶中，然后重新塞上棉塞。重复此操作，直至所有琼脂溶液用完。
    注意：若倒入小瓶的琼脂过少，使用过程中会较快干燥并从瓶壁收缩；若琼脂过多，则在使用体视显微镜观察幼虫的"baby-hatch"现象时，难以聚焦于表面层。
  6. 将灌注好的小瓶在室温下静置于实验台上 1–2 天，使琼脂完全凝固且水分充分蒸发。随后可用于交配实验，或平放在带紧密盖子的塑料盒中保存；在盖上盖子前，于小瓶上方放置一张用水润湿的纸巾（以防止琼脂干燥收缩脱离瓶壁）。灌注后的小瓶可在室温下保存数天，或置于 4 °C 冰箱或冷室中保存最多 2 周。使用前，将小瓶从储存盒中取出，并在室温下放置 1–2 小时，使瓶内冷凝水蒸发（否则成虫会粘附在冷凝水上而溺亡）。

11. 制备小瓶用塞子

  1. 将一个洁净的小瓶放入聚苯乙烯材质的50 mL试管 架中（用力插入，使其直立）。剪一块纱布（2–4层厚），覆盖在小瓶口上。
  2. 将之前制作塞子时剩余的纱布碎片叠放在纱布上，以形成更厚的一层。在纱布上方放置棉花，并将其压入小瓶中，确保小瓶顶部约一英寸的区域被紧密填满。
  3. 捏住纱布边缘的顶端，用绳子绑紧。剪去多余的绳子和纱布（保留足够长度的绳尾以确保绑紧，并保留适量纱布以便于抓握塞子）。
    注意：塞子应贴合紧密。当用一只手握住小瓶时，应能用食指和拇指将塞子轻松拔出。若提起小瓶时塞子脱落，则说明过松；若拔出时发出明显的“砰”声，则可能过紧。若塞子过紧，或其表面有一层坚硬干燥的琼脂，果蝇可能会窒息。若塞子稍松或沿瓶壁滑动，可将其轻敲在实验台面上，压成稍宽的形状以增加贴合度。

12. 典型的每周工作安排（为达到最高效率，请按所列顺序执行各项任务）

  1. 周一（约30分钟）
    1. 为含有幼虫的试剂瓶喂食。
    2. 将琼脂倒入带有塞子的无菌干净试剂瓶中。
  2. 周三（约2小时）
    1. 将装有死亡成虫的试剂瓶放入烘箱中加热1小时，随后保存以备清洗。
    2. 检查幼虫孵化情况"baby-hatch"。
    3. 为含有幼虫的试剂瓶喂食。
    4. 进行每周的交配杂交实验。
    5. 根据需要完成其他任务：对带有塞子的干净试剂瓶进行高压灭菌，以备随时使用；根据需要制备新培养基并高压灭菌吸管；根据需要对培养瓶进行高压灭菌以用于储存培养基和吸管。
  3. 周五（约30分钟）
    1. 检查幼虫孵化情况"baby-hatch"。
    2. 为含有幼虫的试剂瓶喂食。

结果

本文所述方案在饲养B. coprophila方面已取得明确成功。选择刚羽化且体型肥大的成虫进行交配（图4）时，超过90%的杂交组合具有生育能力并可产生后代。不同品系之间的繁殖成功率存在差异（表2）。7298品系（X'染色体携带Wavy标记）原本是最健康的品系，但曾经历一段衰退期，这可能是由于DNA转座元件被激活，导致基因组发生重排32。HoLo2品系源自7298品系，其基因组重排似乎已趋于稳定，目前该品系已在品系保藏中心取代了亲本7298品系。HoLo2品系已被用于B. coprophila基因组测序，并被多个实验室广泛使用。近期，研究人员利用CRISPR诱变技术对HoLo2果蝇进行编辑，获得了具有白眼表型的W14品系，可用于携带荧光眼标记的转基因实验（Yamamoto和Gerbi，未发表数据）。W14品系生命力极强。6980品系（具有Wavy翅和肿胀翅脉标记）活力稍弱，而91S品系（具有petite翅标记）的活力更弱。

成功的杂交会产生胚胎（图5）。胚胎在7细胞阶段会消除带有印记的父源X染色体th 至 9th 卵裂分裂。此外，生殖系限定的L染色体在胚胎的体细胞谱系中于第5次分裂时被消除th 至 6th 卵裂分裂。胚胎以幼虫形式孵出，应注意不要将其与可能同时存在的霉菌混淆（图6）。眼点（成体眼的雏形）出现在第4期的后半段th 幼虫龄期（图7）。眼斑的大小为DNA泡扩增的起始与进展提供了一个便捷的表型标记，而DNA泡扩增是目前已知仅有的两种自然发生的、发育调控的染色体内特定位点DNA（基因）扩增现象之一。随后，蛹体继续发育，其眼部色素的积累量可作为精子发生过程中减数分裂I和II的发育标志。图8）及其在这些分裂过程中独特的染色体行为。

性别决定示意图；X-w-X，XX为雌性，XO为雄性；昆虫表型；遗传学研究。
图4：B. coprophila 成虫的交配行为。 上图显示了HoLo2品系中的三种成虫类型：产生雌性后代的波状翅母本（X'WX 成虫雌性）、产生雄性后代的直翅母本（XX 成虫雌性），以及直翅雄性（X0 成虫雄性）。注意雌蝇后端尖形的产卵器和雄蝇后端钩状的抱握器。下图显示了一对正在交配的雌雄个体，其中雄性的抱握器已抓住雌性的产卵器。精子将被储存在雌性个体的受精囊中，并在卵子排出体外时完成受精。成虫体长为2.0 mm（雄性）和2.5 mm（雌性）。 请点击此处查看该图的放大版本。

果蝇胚胎发育，细胞周期进程，荧光显微镜，延时分析。
图5: B. coprophila 胚胎 左上角图示为在解剖显微镜下使用普通透射光观察的胚胎图像，合胞体细胞质中的细胞核呈现为黑色小点。右侧图示采用荧光显微镜观察经碘化丙啶染色的胚胎细胞核。胚胎平均长度为200微米，平均宽度为150微米。生殖细胞的细胞核在第6周期（胚胎向前倾斜）以及第7至第9周期聚集于胚胎后极，之后与体细胞核交错分布。体细胞谱系中的L染色体在第5或第6次卵裂分裂时被消除；X染色体在体细胞谱系中的消除发生在第7次卵裂分裂th, 8th，或 9th 卵裂分裂。细胞化发生在第11个周期的间期。左侧表格显示了每个分裂周期的平均持续时间 22 °C左侧的表格和右侧的图示经 de Saint Phalle 和 Sullivan 许可改编35. 请点击此处以查看此图的放大版本。

真菌-昆虫相互作用示意图；真菌在昆虫宿主上生长的显微图像。
图6：B. coprophila 胚胎孵化为幼虫。 在产卵后死亡的成年雌虫产卵器附近可见一群胚胎（蓝色粗箭头所示）。产卵约一周后，胚胎发育为初孵幼虫，其中数条由黑色箭头标示。新孵化的幼虫前端具有黑色口器，身体呈半透明状。它们可在琼脂表面爬行，不应与不移动的霉菌混淆。插图为部分霉菌结构，显示白色菌丝（红色箭头）及其顶端的黑色孢子（绿色箭头），其整体尺寸略小于新孵化的幼虫。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的高清版本。

幼虫发育阶段；显微镜图像；不同阶段的细胞模式形成。
图7：B. coprophila 幼虫的眼斑发育阶段。 眼斑在幼虫前端、下颌后方形成，由色素颗粒组成，且颗粒数量逐渐增加。眼斑是成虫眼的原基。上图显示的是在解剖显微镜下观察到的幼虫；下图是使用相差显微镜对载玻片上一滴蒸馏水中的幼虫进行观察时获得的眼斑放大图像，盖玻片轻轻漂浮在液滴表面。眼斑发育阶段的命名依据 Gabrusewycz-Garcia30 的方法，即统计最长一行中的颗粒数（例如12），并记录除最长行外的额外行数（例如眼斑阶段12×6中的6）。在唾腺多线染色体中，位点特异性DNA扩增始于眼斑阶段10×5，并在阶段14×7完成，此时基因座处出现转录激增，DNA泡扩张31。在随后的边缘眼/下颌脱落阶段，眼斑颗粒开始融合，并从身体中线向外侧移动；幼虫体长缩短。此外，此阶段DNA泡发生凝缩。在21 °C条件下，通过每个眼斑阶段约需一天时间。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

果蝇化蛹阶段比较示意图；图A-D显示了逐步发育的阶段。
图8：B. coprophila 蛹的发育过程。 在化蛹过程中，除神经系统外，所有幼虫组织均发生组织溶解，并由来自成虫盘细胞分裂产生的成体组织所取代。虫体颜色由白色逐渐变为浅褐色，再变为棕色，最终变为黑色。色素逐渐填充蛹眼；在蛹眼色素填充程度为1/4至1/2的雄性蛹中，会发生减数分裂I和II36。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的高清版本。

品系名称标记性状生育率备注
7298卷翅 (W)~75%
HoLo2卷翅 (W)~90%源自 7298
W14卷翅 (W)；白眼~95%源自 HoLo2
6980卷翅 (W)；肿胀翅脉 (sw)~65%
91S弱卷翅 (W)；小型翅 (p)~50%通过杂交引入卷翅标记以拯救 91S

表2：储备液 Bradysia (Sciara) coprophila. Gerbi 表 16 列出这些标记以及其他已不存在的标记。在X染色体着丝粒端有五种易位（T1、T23、T29、T32、T70）27 总结于 图8 的格比6 但已不再存在。

补充文件 1：HoLo2（以及 7298 和 W14）杂交、91S 杂交与拯救实验、6980 杂交、易位杂交。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述的B. coprophila饲养方案，将有助于希望在实验室中培养该生物以研究其独特生物学特性的科研人员。最初描述的饲养方法是将酵母和蘑菇粉撒在琼脂培养基上以维持B. coprophila29，Metz实验室曾利用该方法成功培育了14种不同的 Sciarid 蚊类5。随后发现，添加荨麻粉和/或菠菜粉可进一步提高B. coprophila的活力（Gabrusewycz-Garcia，个人交流）。这些方法在维持 Sciaridae 科其他相关物种方面也取得了成功，包括目前仍在培养中的Bradysia impatiens和Lycoriella ingenua （Robert Baird，个人交流）。

已尝试其他方法（例如下文所述的替代喂养方法）来饲养B. coprophila，但此处描述的方案已优化，使每单位面积琼脂上的幼虫数量达到最适比例，以获得最多可育的健壮成虫，并最大限度地抑制霉菌生长。如需扩大规模，可按照上述方案2所述，在玻璃小瓶中进行大规模交配。或者，也可将少量（2–4只）成年雌虫与两倍数量的成年雄虫一同放入培养瓶中，例如用于饲养Drosophila的容器（一次性6盎司＝177.4 mL平底Drosophila聚丙烯培养瓶）。在这两种情况下，研究人员必须完全确认培养瓶中的母本均为仅产雌性后代或仅产雄性后代的个体。

仅需喂养幼虫，因为蛹和成虫不进食。一旦幼虫化蛹（早期羽化的成虫果蝇出现即为标志），则不要再向瓶内添加食物。成虫羽化后，如有条件，应将培养瓶置于低温培养箱（例如16 °C）中，以延长成虫寿命。每周喂食三次（例如周一、周三、周五），并随着幼虫的生长逐渐增加每瓶的食物量。喂食应充足，这样将获得体型肥大且繁殖力强的成虫。然而，若喂食过多，会出现白色霉菌，这是需要减少每瓶投食量的信号。此外，喂食过多还会在琼脂表面形成一层厚厚的食团，阻碍成虫羽化（可用镊子去除食团，但需小心避免将幼虫一同取出——最好从一开始就避免出现这种情况）。幼虫数量较少的培养瓶（标记为"few"）所需食物较少。若喂食不足，幼虫会爬向培养瓶壁寻找食物。营养不良的幼虫将发育为体型较小且繁殖力较低的成虫。

替代喂养方法
已有多种方法被尝试用于在幼虫阶段仅喂食一次，而非每周喂食三次。 B. coprophila 无法在果蝇（Drosophila）标准培养基上生长。John Urban（个人交流）曾尝试将 B. coprophila 的食物与琼脂混合，但导致霉菌过度生长。他发现，单独或联合使用两种防霉剂（tegosept 和丙酸），并在不同浓度下进行测试，均在抑制霉菌的浓度下对 B. coprophila 具有毒性。琼脂的 pH 应为 6–7（中性），因为 B. coprophila 在酸性 pH 条件下会生长不良（例如丙酸存在时）。作为替代方案，为避免每周三次喂食，他尝试使用无针头的刮刀或注射器，在交配后一周（即幼虫即将开始孵化时），将浓酵母糊（用少量蒸馏水润湿的 Red Star 活性干酵母）以小团形式直接点加在每支试管琼脂表面。

另一种避免每周三次喂食的方法是在每个小瓶中添加真菌的活体培养物。 Bath 和 Sponsler37 报道称 ，应在含沙保弱氏培养基的斜面琼脂表面划线接种Chaetoconidia属（最佳）或其他如Baplosporangia或Xllescheria属的真菌培养物。在引入B. coprophila之前，需先将真菌培养数天至一周。此后无需再进行喂食。Ellen Rasch 也采用过该方法的一种变体（个人交流）。但在我们的实验中，此法导致小瓶内湿度过高，幼虫因而溺亡；不过仍可再次尝试，以优化幼虫数量与含活真菌小瓶之间的比例。

Arthur Forer（个人交流）在饲养方面已取得一定成功 B. coprophila 与 crane flies 相同的方式38. 采用该方法，将蛹饲养在湿润环境中 纸浆随后，将成虫进行交配，并在新鲜湿润的基质上产卵 纸浆糊将获得的幼虫继续培养于 纸浆 在培养皿中饲养，每周两次喂食粉末状荨麻叶。将蛹放入笼中以重复该生活周期。

Yukiko Yamashita（个人交流）曾尝试在土壤中饲养B. coprophila，模拟其在盆栽植物和高湿度温室中的自然生存环境，但未获成功。然而，当湿度升高时，容易滋生霉菌。尽管如此，已有成功使用湿润土壤在塑料盒中饲养Pseudolycoriella（先前称为Bradysia）hygida幼虫的报道；饲养过程中以分解的巴拉圭冬青（Ilex paraguariensis）叶片作为食物，并在幼虫发育后期补充含有1.2%酵母提取物、1.4%玉米淀粉、0.8%燕麦粉和1.2%琼脂的饲料12。类似地，湿润的泥炭藓混合碾碎的芸豆也可替代湿润土壤用于饲养蕈蚊（Sciarid flies）39,40。

还有其他一些方法被用于维持Bradysia的实验室培养：（i）添加酵母和干血肥料的灭菌马铃薯41；（ii）动物粪便42,43,44，可额外添加干血45；（iii）塑料容器内放置棉垫和湿润的纸巾，并加入磨碎的黄豆46。

螨虫
螨虫可能从黑腹果蝇（Drosophila）传播到粪生短柄 molds（B. coprophila）。为尽量减少此类传播，最好将B. coprophila饲养在独立的培养箱或房间中，远离Drosophila种群。此外，应在每天早些时候先完成所有B. coprophila的维护操作，再处理Drosophila。螨虫也可能通过室内盆栽植物传入B. coprophila培养物，因此切勿在饲养B. coprophila的房间内放置植物。若培养管已被螨虫侵入，可在B. coprophila体表观察到微小的白色球形生物爬行。用于杀灭Drosophila中螨虫的化学药剂不适用于B. coprophila，因为这些化学物质会杀死B. coprophila（B. coprophila对苯酚等有机挥发物也十分敏感）。清除B. coprophila种群中螨虫的唯一方法是：人工在琼脂平板上收集胚胎，逐一检查确认无螨虫存在后，再用细毛笔将其转移至新的琼脂培养管中。使用填充棉花的纱布塞或醋酸纤维素泡沫塞（类似于用于Drosophila聚丙烯培养管的塞子）均有助于防止螨虫进入培养管内。

饲养方案的实用性
本文所述方案将使日益壮大的科研群体能够培育B. coprophila，作为一种新兴/重新兴起的模式生物，用于研究其独特的生物学特征。鼓励新的实验室加入这一不断发展的研究群体，共同维护并深入探究Bradysia（Sciara）的独特生物学特性。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

特别感谢以往的 B. coprophila 菌种保藏人员（Jacob E. Bliss、Paula Bonazinga、Anne W. Kerrebrock、Ingrid M. Mercer、Heidi S. Smith）以及研究人员（尤其是 Robert Baird、Michael S. Foulk、Donna Kubai、John M. Urban、Yutaka Yamamoto）对饲养方案的优化所做出的贡献。最初关于 B. coprophila 培养的指导由 Helen V. Crouse、Natalia Gabrusewycz-Garcia、Reba M. Goodman、Charles W. Metz 和 Ellen Rasch 提供。衷心感谢 Yukiko Yamashita 和 Anne W. Kerrebrock 承担了 Bradysia（Sciara）菌种保藏中心的工作。非常感谢以下人员在图例制备方面提供的帮助：Brian Wiegmann（图1）、John M. Urban（图4 上图）、Laura Ross（图4 下图）、Yutaka Yamamoto（图5 左图）、Leo Kadota（图7 和 图8）。诚挚感谢 Ava Filiss 及布朗大学多学科实验室在摄影与视频拍摄方面提供的协助。感谢 Robert Baird 对本手稿提出的宝贵意见。我们对 B. coprophila 的研究与保藏工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）和国家科学基金会（NSF）的资助，其中包括 NIH GM121455 项目对 S.A.G. 的最新支持。有关 B. coprophila 的更多详细信息，请访问目前正在建设中的 Bradysia（Sciara）菌种保藏中心网站（https://sites.brown.edu/sciara/ 和 https://sciara.wi.mit.edu）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂（细菌学用）U.S. BiologicalA0930https://www.usbio.net 
CO2 FlyStuff 脚踏开关Genesee Scientific59-121
CO2 FlyStuff 吹管Genesee Scientific54-104
CO2 FlyStuff UltimaterFlypadGenesee Scientific59-172https://www.geneseesci.com
乙醚通风橱Labconco 3955220放置在实验台台面上
         滤膜更换  货号 # 6961300
食物：啤酒酵母’酵母粉Solgar   从亚马逊或健康食品商店购买
         https://www.solgar.com
食物：荨麻粉  （无农药）Starwest Botanicals209460-51
食物：香菇（无农药）Starwest Botanicals202127-5https://www.starwest-botanicals.com
食物：菠菜粉（无农药）Starwest Botanicals209583-5
食物：稻草（无农药）Starwest Botanicals209465-3
广口瓶：透明玻璃，聚丙烯盖Fisher Scientific:FB0291176573 mm 直径，89 mm 高（240 ml）
https://www.fishersci.com
针探针，木质手柄US Geo Supply Inc货号：41905.75” 长探针，
不锈钢针
https://usgeosupply.com; (970)-434-3708
小瓶：玻璃材质，优先选用：Wilmad LabGlass
Wilmad玻璃定制小瓶内径28-33毫米，外径33毫米，高9.5厘米
Wilmad：https://www.SP-WilmadLabglass.com
小瓶：玻璃材质（较便宜且可用） Fisher Scientific03-339-26H29 mm 外径，9.5 cm 高
 https://www.fishersci.com 
小瓶：玻璃材质（略窄） Genesee Scientific 32-20124.5 mm 外径，9.5 cm 高
https://www.geneseesci.com
小瓶：聚丙烯 Genesee Scientific32-11428.5 mm 外径，9.5 cm 高
小瓶塞
非吸收性棉卷Fisher Scientific22-456881
纱布Fisher Scientific22-055053https://www.fishersci.com

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下双翅目蝇类 Bradysia (Sciara) coprophila 的实验室培养：一种新兴/传统的模式生物
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