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获取急性 LCMV 感染小鼠中病毒特异性滤泡辅助性 CD4+ T 细胞早期分化的研究方法

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DOI：

10.3791/66752

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2024年4月26日

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1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究展示了评估病毒特异性TFH细胞早期命运决定的方案，以及对这些细胞中基因表达进行操控的方法。

摘要

滤泡辅助性T（TFH）细胞被视为一种独立的CD4+ T细胞谱系，能够辅助同源B细胞产生高亲和力抗体，从而建立长期的体液免疫。在急性病毒感染过程中，病毒特异性TFH细胞的命运决定发生在感染早期阶段，因此对早期分化TFH细胞的研究对于理解T细胞依赖性体液免疫机制以及优化疫苗设计至关重要。本研究利用急性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染的小鼠模型，以及T细胞受体转基因的SMARTA（SM）小鼠（其CD4+ T细胞特异性识别LCMV糖蛋白表位I-AbGP66-77），描述了基于流式细胞术染色分析病毒特异性TFH细胞早期命运决定的技术流程。此外，通过逆转录病毒转导SM CD4+ T细胞的方法，还提供了在早期分化的病毒特异性TFH细胞中调控基因表达的技术手段。因此，这些方法将有助于深入探究病毒特异性TFH细胞早期命运决定的分子机制。

引言

面对不同的病原体或威胁，初始CD4+ T细胞通过分化为具有特定功能的多种辅助性T（TH）细胞亚群，从而定制其免疫应答1。在急性病毒感染的情况下，大量初始CD4+ T细胞会分化为滤泡辅助性T（TFH）细胞，以辅助B细胞2,3。与其他CD4+ TH细胞亚群（如TH1、TH2、TH9和TH17细胞）不同，TFH细胞表达高水平的CXCR5，这是一种B细胞归巢趋化因子CXCL13的趋化因子受体，使TFH细胞能够迁移至B细胞滤泡中。在B细胞滤泡内，TFH细胞协助同源B细胞启动并维持生发中心反应，从而促进快速产生高亲和力抗体并形成长期体液免疫记忆2,3。

急性病毒感染后，病毒特异性T细胞的早期命运决定FH 细胞在72小时内发生4,5并由转录抑制因子B细胞淋巴瘤-6（Bcl-6）调控5,6,7,8，其作用是作为 "主调控因子" 调控 TFH 细胞命运决定。Bcl-6 缺陷会严重削弱 TFH 细胞分化，而异位表达的 Bcl-6 显著促进 TFH 细胞命运决定。除了 Bcl-6 之外，还有多种分子参与指导早期 TFH 细胞命运决定。转录因子 TCF-1 和 LEF-1 启动 TFH 细胞分化 通过 Bcl-6 的诱导9,10,11Blimp1 受 Bcl-6 和 TCF-1 的共同抑制，是早期 T 细胞发育所必需的FH 细胞命运决定11,12STAT1 和 STAT3 也在早期 T 细胞发育中起必需作用FH 细胞分化13此外，组蛋白甲基转移酶EZH2介导的表观遗传学修饰14,15m6A甲基转移酶METTL316 有助于稳定 TFH 细胞转录程序（尤其是 Bcl6 和 Tcf7）从而启动早期T细胞FH 细胞命运决定。尽管已有进展，包括上述分子及其他分子，已在别处总结3，已在理解早期T细胞转录及表观遗传调控方面取得进展FH 细胞命运决定，仍有此前未知的分子有待揭示。

在急性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染的小鼠模型中，过继转移的同源型TCR转基因SMARTA（SM）CD4+ T细胞可特异性识别LCMV糖蛋白表位I-AbGP66-77，并在病毒感染过程中分化为TFH或TH1细胞。这种TFH/TH1双相分化模式推动了SM/急性LCMV感染模型在病毒特异性TFH细胞生物学研究中的应用。事实上，SM/急性LCMV感染模型已被广泛应用于TFH细胞研究领域，并在TFH细胞生物学的多项里程碑式发现中发挥了关键作用。这包括鉴定出前述的Bcl-6作为TFH细胞谱系决定性转录因子5,6，以及其他调控TFH细胞分化的关键转录因子（如Blimp-16、TCF-1/LEF9,10,11、STAT1/STAT313、STAT517、KLF218和Itch19），TFH细胞分化的转录后调控机制（如METTL316和miR-17~9220），TFH细胞的记忆性与可塑性21,22，以及靶向TFH细胞的合理化疫苗策略（如硒元素的应用23）。

本研究描述了可重复的方法，用于研究病毒特异性TFH细胞的早期命运决定，包括：（1）建立适用于获取早期分化TFH细胞的急性LCMV感染SM嵌合小鼠模型；（2）对与早期分化TFH细胞相关的分子进行流式细胞术染色；（3）在SM CD4+ T细胞中进行基于逆转录病毒载体的基因操作。这些方法将有助于研究病毒特异性TFH细胞的早期命运决定过程。

方案

所有动物实验均按照第三军医大学机构动物护理和使用委员会批准的程序进行。本研究中使用的小鼠品系如下：C57BL/6J（B6）小鼠（两种性别），6至8周龄，体重25-30 g；CD45.1+SM TCR转基因小鼠（B6 CD45.1 × SM TCR转基因），两种性别，6至8周龄，体重25-30 g；以及CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR转基因小鼠（B6 CD45.1 × SM TCR转基因 × CXCR5-GFP基因敲入），两种性别，6至8周龄，体重25-30 g。转基因品系的构建依据先前发表的文献24。研究中所用试剂、缓冲液和设备的详细信息列于材料表中。

1. 收集用于过继转移的 CD45.1+ SM CD4+ T 细胞

  1. 按照机构批准的方案，对所需数量的6至8周龄CD45.1+ TCR转基因SM小鼠实施安乐死24。使用手术剪在安乐死小鼠腹壁左侧做一英寸切口，从腹膜中分离脾脏，并撕裂脾脏后方的结缔组织25,26。
  2. 将每只脾脏置于培养皿（60 mm × 15 mm）中的70 µm细胞筛网上，用1 mL注射器活塞研磨脾脏，加入3 mL红细胞裂解液（RBC lysis buffer）。
    注意：使用注射器活塞的圆形端研磨脾脏，直至仅剩结缔组织。
  3. 向每个培养皿中加入6 mL RPMI + 2% FBS（RPMI 2%），以稀释3 mL红细胞裂解液。用移液器将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。再用额外3 mL的2% RPMI冲洗培养皿，并将冲洗液转移至同一锥形管中。
  4. 将细胞悬液在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，倾去上清液。用分离缓冲液重悬细胞，调整细胞密度至约~1 × 108 个细胞/mL。将试管置于冰上。
  5. 在分离缓冲液中配制1×生物素化抗体混合液，靶向CD8a、CD19、NK1.1、F4/80、CD11c和Ter119，用于富集CD4+ T细胞。
    注意：按照材料表中注明的稀释比例，将生物素化抗体加入分离缓冲液中。抗体混合液的总体积应与步骤1.4中分离缓冲液的体积相同。
  6. 将细胞悬液在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，倾去上清液。
  7. 在锥形管中用指定体积的1×生物素化抗体混合液重悬细胞沉淀。
  8. 将锥形管置于冰上，在摇床上以45 rpm振荡30分钟。
  9. 在与生物素化抗体孵育的同时，根据生产商说明书准备所需体积的链霉亲和素包被磁珠。
    注意：一只未经处理小鼠的总脾细胞需要200 µL链霉亲和素包被磁珠。
  10. 在4 °C条件下，用8–10 mL分离缓冲液以800 × g离心5分钟洗涤细胞，弃去上清液。重复此步骤两次。
  11. 用预先准备好的链霉亲和素包被磁珠重悬细胞沉淀。
  12. 将试管置于冰上，在摇床上以45 rpm振荡40分钟。
  13. 随后将试管置于磁力架上3–4分钟，直至所有磁珠聚集于磁性一侧。
  14. 小心收集上清液，并转移至新的15 mL锥形管中。
  15. 将细胞悬液在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，倾去上清液。
    注意：市面上有其他可用于CD4+ T细胞富集的商用试剂盒，可替代本方案中步骤1.5–1.15所述的CD4+ T细胞富集流程。
  16. 用2–3 mL 2% RPMI重悬细胞沉淀。吸取50 µL细胞悬液用于流式细胞术分析CD4+ T细胞富集效率（CD4和Vα2）及细胞活力。
  17. 将细胞悬液在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，倾去上清液。用RPMI重悬细胞沉淀，调整细胞密度至每毫升含1 × 107 个CD4+Vα2+ SM细胞。将试管置于冰上，进入下一步的过继性细胞转移操作。

2. 建立急性LCMV感染的SM嵌合小鼠模型以获取早期分化的SM TFH 细胞

  1. 使用红外灯加热6至8周龄的C57BL/6受体小鼠，以扩张尾静脉，便于静脉注射。
  2. 用胰岛素注射器吸取100 µL细胞悬液，其中含有步骤1.17中制备的1 × 106个SM细胞。
    注意：注射体积应由每位研究人员根据实际情况调整，且不得超过所在机构及当地法律法规允许的最大注射体积。
  3. 将小鼠固定在小鼠固定器中，拉直尾巴，并用蘸有75%乙醇的棉球擦拭尾部，使尾静脉清晰可见。
  4. 将胰岛素注射器针头插入尾静脉，平稳缓慢地注入细胞悬液。随后，让受体小鼠过夜休息。
  5. 次日，用RPMI培养基稀释LCMV Armstrong病毒原液，使其终浓度达到1 × 107斑块形成单位/mL。
  6. 向受体小鼠尾静脉注射100 µL稀释后的LCMV Armstrong溶液（含1 × 106斑块形成单位）。
    注意：每位研究人员应谨慎确认推荐的感染滴度是否符合所在机构及当地法律法规的要求。

3. 早期分化的 SM TFH 细胞的流式细胞术染色

  1. 在感染后第3天，按照机构批准的方案处死第2.6步中的小鼠，并按第1步所述方法从脾脏中分离淋巴细胞。将细胞密度调整至约 2 × 107 个细胞/mL。
  2. 向圆底96孔板中每孔加入50 µL细胞悬液（约1 × 106 个细胞），再向每孔加入150 µL染色缓冲液。将板置于冰上。
  3. 在离心管中，用50 µL TFH 细胞染色缓冲液将纯化的大鼠抗小鼠CXCR5抗体混合物（即CXCR5一抗）按1:50稀释，每份样品对应一管。充分涡旋混匀后，在4 °C下以15,000 × g 离心3分钟以沉淀颗粒。将管置于冰上保存。
  4. 将96孔板在4 °C下以800 × g 离心1分钟，倾去上清液，短暂涡旋振荡板，然后每孔加入200 µL染色缓冲液。
  5. 重复步骤3.4，每孔加入50 µL CXCR5一抗，通过反复吹打混匀，在冰上孵育1小时。
  6. 在新的离心管中，用50 µL TFH 细胞染色缓冲液将生物素标记的山羊抗大鼠抗体混合物（即CXCR5二抗）按1:200稀释，每份样品对应一管。涡旋混匀后，在4 °C下以15,000 × g 离心3分钟以沉淀颗粒。将管置于冰上保存。
  7. 将板在4 °C下以800 × g 离心1分钟，倾去上清液，短暂涡旋振荡板，然后每孔加入200 µL染色缓冲液。
  8. 重复步骤3.7两次，并将板保持在冰上。
  9. 向每孔加入50 µL CXCR5二抗，通过反复吹打充分混匀，在冰上孵育30分钟。
  10. 在每份样品中，用50 µL TFH 细胞染色缓冲液将荧光标记的链霉亲和素（即CXCR5三抗）按1:200稀释。同时，在加入CXCR5三抗时，一并加入针对其他表面标志物（如CD45.1、CD4、PD-1、CD25及其他感兴趣分子）的抗体以及死细胞染料。
  11. 涡旋混匀管后，在4 °C下以15,000 × g 离心3分钟以沉淀颗粒。将管置于冰上保存。
  12. 将板在4 °C下以800 × g 离心1分钟，倾去上清液，短暂涡旋振荡板，然后每孔加入200 µL染色缓冲液。
  13. 重复步骤3.12两次，并将板置于冰上避光保存。
  14. 向每孔加入50 µL CXCR5三抗混合物，通过反复吹打充分混匀，在冰上避光孵育30分钟。
  15. 根据试剂盒说明书，为每孔配制200 µL固定/通透缓冲液。
  16. 将板在4 °C下以800 × g 离心1分钟，倾去上清液，短暂涡旋振荡板，然后每孔加入200 µL染色缓冲液。
  17. 重复步骤3.16两次，并将板置于冰上避光保存。
  18. 向每孔加入200 µL固定/通透缓冲液，通过反复吹打混匀，在室温下避光孵育30分钟。
    注：根据试剂盒说明书配制1×通透缓冲液。
  19. 在新的离心管中，用50 µL 1×通透缓冲液为每孔配制针对转录因子（包括Bcl-6、TCF-1、T-bet及其他感兴趣分子）的抗体混合物。
  20. 涡旋混匀管后，在4 °C下以15,000 × g 离心3分钟以沉淀颗粒。
  21. 将板在4 °C下以800 × g 离心1分钟，倾去上清液，短暂涡旋振荡板，然后每孔加入50 µL转录因子抗体混合物。充分混匀后，在冰上避光孵育30分钟。
  22. 将板在4 °C下以800 × g 离心1分钟，倾去上清液，通过倾倒短暂涡旋振荡板，然后每孔加入200 µL 1×通透缓冲液。
  23. 重复步骤3.22。
  24. 向每孔加入200 µL染色缓冲液，将板在4 °C下以800 × g 离心1分钟，倾去上清液，并短暂涡旋振荡板。
  25. 用每孔200 µL染色缓冲液重悬细胞沉淀，将细胞转移至流式细胞仪检测管中，立即进行流式细胞术分析。
    注：也可选择在每管中加入200 µL 2%多聚甲醛，于4 °C避光保存，在3天内完成检测。

4. 逆转录病毒的制备

  1. 将传代次数少于十次的293T细胞接种于10 cm培养皿中，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，持续2–3个传代周期。
  2. 当细胞融合度达到90%时，弃去旧培养基，用PBS轻柔洗涤细胞两次，随后在室温下加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，短暂消化293T细胞1分钟。
  3. 用2 mL预热的含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞以终止消化反应，转移至15 mL锥形离心管中，在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。
  4. 弃去上清液，用移液器反复吹打2 mL预热的含10%胎牛血清的DMEM培养基，重悬细胞沉淀。
  5. 定量细胞数量，并将5 × 105个细胞接种于6孔板的每个孔中，每孔加入2.5 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。
    注意：轻柔晃动培养皿，使293T细胞均匀分布于孔内。
  6. 当293T细胞融合度超过80%时，按照步骤4.7至4.9准备转染试剂。
  7. 对于6孔板的每一孔，向无菌的1.5 mL离心管中加入250 µL预热的Opti-MEM培养基，然后加入3 µg质粒DNA（包含2 µg逆转录病毒载体和1 µg pCL-Eco），再通过轻柔吹打确保充分混匀。
    注意：本研究中作为示例使用的逆转录病毒载体为MigR1，以及在IRES-GFP上游插入Bcl6编码序列（CDS）的改良型MigR1载体（MigR1-Bcl6）。
  8. 随后，向混合液中加入7.5 µL预热的转染试剂（商品化产品），轻柔吹打混匀，确保充分混合。
  9. 将混合液在室温下孵育20分钟。
  10. 将混合液逐滴加入293T细胞培养孔的不同区域，然后轻柔地前后左右摇动培养容器，使混合液均匀分布。
  11. 将293T细胞置于含5% CO2的37 °C培养箱中继续培养72小时。
  12. 通过荧光显微镜或流式细胞术检测转染后293T细胞中逆转录病毒载体标签的表达情况，作为评估转染效率的指标。
    注意：例如，我们在大量转染MigR1载体的293T细胞中观察到明显的GFP荧光信号，表明转染质量较高。
  13. 收集细胞培养上清液，在4 °C条件下以2,500 × g离心10分钟，去除细胞碎片。小心收集所得上清液，可长期保存于-80 °C，或短期存放于4 °C。

5. 在体 活化、逆转录病毒转导及SM CD4的过继性转移+ T细胞

  1. 注射一份 CD45.1+ 通过静脉向6至8周龄SM小鼠注射200 µg LCMV GP61-77 肽11,14 在100 µL RPMI培养基中。
    注意：注射体积应由每位研究人员根据各机构及当地法律法规允许的最大注射体积进行调整，不得超过规定上限。
  2. 在注射肽后16–18小时处死SM小鼠（遵循机构批准的实验方案）。按照步骤1中所述方法获取脾细胞。
    注：或者， 体外 抗CD3/抗CD28刺激法27,28 可用于激活SM CD4+ T细胞替代 体内 按照步骤5.1和5.2中所述进行肽刺激。
  3. 用含2% RPMI的培养基重悬脾细胞，并将细胞密度调整至约1 × 108 每毫升细胞悬液置于15 mL离心管中。将离心管置于冰上。
  4. 将50 µL细胞悬液加入圆底96孔板中，每孔补充150 µL染色缓冲液。
  5. 将96孔板在800 × g条件下离心 g 4 °C下离心1分钟以沉淀细胞，小心倾倒去除上清液，短暂涡旋混匀板孔，每孔加入200 µL染色缓冲液。
  6. 重复步骤 5.5，用 50 µL 表面抗体混合液（包括 CD4、CD25 和 CD69）重悬细胞，以检测 SM CD4 T 细胞的活化状态+ T细胞。用移液器反复吹打充分混匀，置于冰上避光孵育30分钟。
  7. 每个孔用染色缓冲液补至 200 µL，随后将板在 800 × g 4 °C 下离心 1 分钟。倾去上清液，短暂涡旋振荡平板。
  8. 重复步骤5.7两次。
  9. 将细胞重悬于200 µL染色缓冲液中，并转移至流式细胞术检测管中。
  10. 使用流式细胞术分析荧光标记抗体染色的细胞，以评估SM CD4的活化状态+ T细胞
    注意：活化的 SM CD4+ 与初始T细胞相比，T细胞表现出丰富的CD25和CD69表达，从而能够进行后续的转导操作。
  11. 加入 1 × 106 SM CD4+ 将步骤 5.3 中的 T 细胞每孔接种至 24 孔板中。在 800 × g 4 °C 下孵育 3 分钟，然后小心倾去上清液。
  12. 按照步骤4.13所述，向每个孔中加入1 mL逆转录病毒培养基和8 µg多聚素（polybrene）。
  13. 以 800 × g 离心细胞 g 37 °C 下孵育 2 小时。
  14. 用移液器小心弃去逆转录病毒培养基，每孔加入1 mL预热的含10 ng/mL重组小鼠IL-2的10% RPMI培养基。
  15. 在含5% CO₂的37 °C培养箱中培养细胞48 h2.
  16. 将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，以800 × g 4 °C下离心6分钟。
  17. 通过倾倒法去除上清液，并用适当体积的2% RPMI重悬细胞，调整细胞密度至1 × 108 每毫升细胞悬液置于15 mL锥形管中。将管子置于冰上。
  18. 将50 µL细胞悬液加入圆底96孔板中，每孔补充150 µL染色缓冲液。
  19. 将96孔板在800 × g条件下离心 g 在4 °C下离心1分钟以沉淀细胞，小心倾去上清液，短暂涡旋混匀平板，每孔加入200 µL染色缓冲液。
  20. 重复步骤5.19，用50 µL表面抗体混合液重悬细胞，抗体混合液包括CD4、Vα2和载体标签相关抗体。通过上下吹打充分混匀，置于冰上避光孵育30 min。
  21. 每孔用染色缓冲液补至 200 µL，随后将培养板在 800 × g 1 分钟。倾倒弃去上清液，并短暂涡旋振荡平板。
  22. 重复步骤 5.21 两次。
  23. 用 200 µL 染色缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中。
  24. 使用流式细胞术分析荧光标记抗体染色的细胞，以评估SM CD4中的转导效率+ T细胞
    注意：高效转导的 SM CD4+ T细胞在该研究中表现出对逆转录病毒标签（如GFP）的高表达。
  25. 将步骤 5.17 中的细胞悬液在 800 × g 4 °C 下离心 5 分钟，倾倒弃去上清液。用 RPMI 重悬细胞沉淀，并调整细胞密度至 1 × 107 CD4+Vα2+ SM 细胞/mL
  26. 过继转移总共 1 × 106 CD45.1+ SM CD4+ 通过静脉注射步骤5.25中制备的100 µL细胞悬液，将T细胞注入每只C57BL/6受体小鼠（6至8周龄）。
  27. 第二天，用 1 × 106 通过静脉注射LCMV Armstrong的噬斑形成单位

6. 早期急性 LCMV 感染阶段经逆转录病毒转导的 SM TFH 细胞的流式细胞术分析

  1. 在感染后第3天，从C57BL/6小鼠中获取脾细胞（步骤5.25）。
  2. 按照步骤3所述方法，对脾细胞进行表面标志物的流式细胞术染色，包括CD4、CD45.1、CXCR5、CD25及其他感兴趣的分子。
  3. 为了检测经携带荧光蛋白标签的逆转录病毒转导的SM CD4+ T细胞中转录因子的表达，向每孔加入200 µL的2%多聚甲醛，在室温避光孵育20分钟。
  4. 按照步骤3所述方法进行固定/透化处理、对目标转录因子进行流式细胞术染色，并进行流式细胞术分析。

结果

早期分化的病毒特异性T细胞的特征FH 急性LCMV感染期间的细胞
为了探究病毒特异性T细胞的早期命运决定FH 细胞，幼稚型同源SM CD4+ 特异性识别 LCMV GP 表位 I-A 的 T 细胞bGP66-77 被过继转移至CD45.2+ C57BL/6 受体。次日，这些受体通过静脉注射感染高剂量的急性清除型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 Armstrong 株（LCMV Armstrong）图1A). 感染后第3天，通过流式细胞术分析C57BL/6受体小鼠的脾细胞，结果表明有大量转输的CD45.1+ SM CD4+ T细胞（约占总CD4的10%）+ T细胞) (图1B)，这提供了足够数量的病毒特异性CD4+ 用于进一步研究的T细胞。对过继转移的SM CD4进行进一步分析+ T细胞表现出CXCR5与Bcl-6/TCF-1的共表达，以及CXCR5与CD25/T-bet的相互排斥表达，从而定义了TFH (CXCR5+Bcl-6+ 或 CXCR5+TCF-1+）和 TH1（CXCR5-CD25+ 或 CXCR5-T-bet+）谱系（图1C）。为了评估本研究中CXCR5抗体染色的特异性和敏感性，我们进一步将上述的CD45.1+ SM 小鼠品系与 CXCR5-GFP 基因敲入小鼠品系杂交，后者通过将 IRES-GFP 构建体插入开放阅读框下游而获得 Cxcr529。然后，CD45.1+ 将CXCR5-GFP报告基因SM细胞转移至C57BL/6受体小鼠。这些受体小鼠感染LCMV Armstrong后，在感染后第3天分析其脾细胞。结果表明，本研究中通过CXCR5抗体染色法检测的荧光信号与转移的CXCR5-GFP报告基因的GFP信号高度重叠。29 SM CD4+ 感染后第3天的T细胞图1D），表明三步CXCR5抗体染色法具有高特异性。

基于逆转录病毒的SM CD4中Bcl-6过表达+ T细胞
Bcl-6 是促进 T 细胞发育过程中最重要的分子之一FH 细胞分化6,7,8. 为确定本方案在获取早期分化T细胞方面的可靠性FH 细胞，CD45.1+ SM CD4+ T细胞被 体内 用携带MigR1质粒或MigR1-Bcl6过表达质粒转染的293T细胞产生的逆转录病毒上清液激活并转导（图2 和 图 3A). 逆转录病毒转导的 SM CD4+ 随后将T细胞过继转移至C57BL/6受体小鼠，然后用LCMV Armstrong感染图3B。感染后第3天，我们发现T细胞的平衡分支FH 和 THMigR1-SM CD4 中的 1 个细胞+ T细胞，尽管是主要的TFH MigR1-Bcl6-SM CD4 细胞定向分化+ T细胞（图3C）。一致地，MigR1-Bcl6-SM CD4中的Bcl-6表达水平升高+ 与MigR1-SM CD4中的T细胞相比+ T细胞（图3D）。因此，异位表达Bcl-6所驱动的T细胞表型FH 细胞分化6 按照当前方案被精确地重现。

病毒特异性T<sub>FH</sub>细胞分化过程、流式细胞术、设门策略、共染色分析。
图1：LCMV Armstrong感染期间SM TFH细胞早期命运决定的流式细胞术分析。（A）实验设计。从CD45.1+ SM小鼠中分离脾脏CD4+ T细胞，并过继性转移至C57BL/6受体小鼠（CD45.2+）中。次日，用LCMV Armstrong病毒感染这些受体小鼠。感染后第3天，通过流式细胞术分析受体小鼠脾脏中转移的CD45.1+ SM细胞。（B）代表性流式细胞术数据，显示感染后第3天受体小鼠脾脏中转移的CD45.1+ SM CD4+ T细胞的设门策略。（C）代表性流式细胞术数据，显示感染后第3天受体小鼠脾脏中转移的CD45.1+ SM细胞中CXCR5与其他TFH细胞相关分子（Bcl-6、TCF-1、CD25和T-bet）的共染色结果。（D）代表性流式细胞术数据，显示感染后第3天受体小鼠脾脏中转移的CD45.1+ CXCR5-GFP报告基因SM细胞中荧光标记的抗CXCR5抗体与GFP信号的共染色结果。请点击此处查看该图的高清版本。

SM CD4+ T 细胞中逆转录病毒的病毒转导；示意图、GFP 信号、流式细胞术分析
图2：SM CD4 中的逆转录病毒转导+ T细胞 (A逆转录病毒制备及SM CD4细胞中逆转录病毒转导的示意图+ T细胞。进行逆转录病毒生产时，当293T细胞在6孔板中培养至密度达到≥80%汇合度时，转染目标DNA质粒。转染后72 h收集含逆转录病毒的细胞培养上清液，可立即使用或于-80 °C保存。80 °C. 用于SM CD4中的逆转录病毒转导+ T 细胞，CD45.1+ SM 小鼠通过静脉注射 200 µg LCMV GP的61-77 肽。随后，在注射肽后16-18小时处死SM小鼠并分离脾脏，分析脾脏CD4+ 检测到T细胞。活化的SM CD4+ T细胞用含有逆转录病毒的培养上清液转导并进行培养 体外 48 小时后检测转导效率。 (B质粒DNA转染的293T细胞中GFP的荧光显微镜成像。比例尺： 400 µm. (C) 流式细胞术分析脾脏初始CD4⁺ T细胞中CD25和CD69表达水平+ 来自未致敏小鼠（未致敏，左）或脾脏 SM CD4 的 T 细胞+ LCMV GP 的 T 细胞61-77 肽注射的SM小鼠（激活状态，右侧）。(D) 逆转录病毒转导的 SM CD4 细胞中 GFP 表达的流式细胞术分析+ T细胞（转导，左侧）或逆转录病毒非转导SM CD4+ T细胞（非转导，左） 请点击此处以查看此图的放大版本。

MigR1 和 MigR1-Bcl6 质粒示意图、流式细胞术、T 细胞分化分析。
图 3：Bcl-6 过表达对记忆性 TFH 细胞命运决定的影响。 （A）逆转录病毒 MigR1 载体骨架的线性图谱（上图）以及在 IRES-GFP 上游插入 Bcl6 编码序列（CDS）的改良型 MigR1 载体（MigR1-Bcl6）（下图）。 （B）实验设计。将 MigR1 或 MigR1-Bcl6 转导的记忆性 CD4+ T 细胞过继转移至 C57BL/6 受体小鼠（CD45.2+），并于次日感染 LCMV Armstrong 病毒。感染后第 3 天，从受体小鼠脾脏中分离出供体来源的 CD45.1+ 记忆性 CD4+ T 细胞，并通过流式细胞术进行分析。 （C）对 MigR1 或 MigR1-Bcl6 转导的 GFP+ 记忆性 CD4+ T 细胞中 CXCR5 和 CD25 的流式细胞术分析。门控区域旁的数字表示记忆性 CD4+ T 细胞中 TFH 细胞的频率。 （D）对 MigR1 或 MigR1-Bcl6 转导的记忆性 CD4+ T 细胞中 Bcl-6 表达水平的流式细胞术分析。MFI 表示平均荧光强度。 请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

自发现TFH细胞在辅助B细胞方面的特化功能以来，TFH细胞领域的研究备受关注。越来越多的研究表明，TFH细胞的分化是一个多阶段、多因素参与的过程30，其中TFH细胞命运的决定发生在早期阶段5。因此，深入理解早期分化TFH细胞背后的分子机制，对于TFH细胞生物学研究和合理设计疫苗至关重要。本文中，我们提供了利用LCMV Armstrong病毒感染模型、TCR转基因SM小鼠以及逆转录病毒介导的转导技术，来研究病毒特异性TFH细胞早期命运决定及调控早期分化TFH细胞基因表达的方法。

趋化因子受体CXCR5是一种重要的表面标志物，可将TFH细胞与其他CD4+ TH细胞亚群区分开来6,7,8,31，因此在TFH细胞研究中，需要具有高特异性和高灵敏度的CXCR5染色方法。本研究展示了一种三步链霉亲和素-生物素法CXCR5染色技术，用于鉴定TFH细胞亚群（图1C）。尽管高灵敏度的两步或三步链霉亲和素抗体染色方法常存在特异性下降的问题，但研究发现，在感染后第3天，三步法CXCR5抗体染色的荧光信号与CXCR5-GFP29报告小鼠SM CD4+ T细胞中的GFP信号几乎完全重叠（图1D），表明该三步法CXCR5抗体染色技术同时实现了高特异性和高灵敏度。事实上，这种三步链霉亲和素CXCR5染色策略已被广泛验证，帮助研究人员更深入地研究TFH细胞生物学11,14,15,21，以及其他表达CXCR5的T细胞类型29,32。

感染或免疫后，TFH细胞的命运决定通常被建模为初始CD4+ T细胞分化为TFH细胞或非TFH效应TH细胞的双歧分化过程2,3,30。本研究展示了在过继转移的SM CD4+ T细胞中TFH细胞与TH1细胞之间平衡的双歧分化。此外，这些过继转移的SM CD4+ T细胞在感染早期具有足够的细胞数量，因此可作为研究TFH细胞分化的合适模型。确实，与对照组SM CD4+ T细胞相比，通过逆转录病毒介导在过继转移的SM CD4+ T细胞中异位表达Bcl-6会显著偏向于TFH细胞分化（86.6% 对比 53.8%）（图3C），该结果与先前报道一致6，并进一步验证了本研究中所述实验方案的准确性。此外，上述实验方案也可用于在早期活化的SM CD4+ T细胞中通过逆转录病毒介导敲低目的基因（例如 bcl6、Tcf7）11（数据未显示）。

该方案的一个局限性在于耗时较长（总计超过2小时）以及三步法CXCR5染色过程的多步骤操作。 alternatively，一步法18,33或两步法4,9,34的CXCR5染色方法也已被应用于TFH细胞研究。有必要对这些CXCR5染色方法的特异性和灵敏度进行比较。

综上所述，本研究提供了获取早期分化的病毒特异性TFH细胞以及研究可能调控TFH细胞分化的目的基因的实验方案。这些方案将推动对早期TFH细胞命运决定机制的深入研究。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本研究由国家自然科学基金（项目编号：32300785，资助对象：X.C.）、中国博士后创新人才支持计划（项目编号：BX20230449，资助对象：X.C.）以及国家科技重大专项（项目编号：2021YFC2300602，资助对象：L.Y.）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTACorning25-052-CI
4% 多聚甲醛固定液，4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm 细胞筛MerckCLS431751
Alexa Fluor 647 抗小鼠 TCR Vα2（克隆 B20.1）Biolegend1278121:200 稀释
Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD45.1（克隆 A20）Biolegend1107241:200 稀释
APC 抗小鼠 CD25（克隆 PC61）Biolegend1019101:200 稀释
B6 CD45.1（B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ）小鼠The Jackson Laboratory002014
BeaverBeads 链霉亲和素磁珠Beaver22321-10
生物素标记抗小鼠 F4/80 抗体（克隆 BM8）Biolegend1231061:200 稀释
生物素标记大鼠抗小鼠 CD11c（克隆 N418）Biolegend1173041:200 稀释
生物素标记大鼠抗小鼠 CD19（克隆 6D5）Biolegend1155041:200 稀释
生物素标记大鼠抗小鼠 CD8a（克隆 53-6.7）Biolegend1007041:200 稀释
生物素标记大鼠抗小鼠 NK-1.1（克隆 PK136）Biolegend1087041:200 稀释
生物素标记大鼠抗小鼠 TER-119/红系细胞（克隆 TER-119）Biolegend1162041:200 稀释
牛血清白蛋白，BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 抗 T-bet（克隆 4B10）Biolegend6448161:100 稀释
Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD279（PD-1）（克隆 29F.1A12）Biolegend1352201:200 稀释
C57BL/6J（B6）小鼠The Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP 基因敲入报告小鼠本实验室自备；CXCR5-GFP 基因敲入小鼠品系通过在 Cxcr5 开放阅读框后插入 IRES-GFP 构建体获得。
DMEM 10% 培养基含 10% FBS 的 DMEM 培养基
DMEM 培养基Gibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
胎牛血清，FBSSigmaF8318
FlowJo（版本 10.4.0）BD Biosciences
Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒Invitrogen00-5523-00该试剂盒包含三种试剂：a. 固定/透化浓缩液（4X）；b. 固定/透化稀释液；c. 透化缓冲液。
山羊抗大鼠 IgG 抗体（H+L），生物素化Vector laboratoriesBA-9400-1.51:200 稀释
Invitrogen EVOS FL Auto 细胞成像系统ThermoFisher Scientific
分离缓冲液含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 FACS 缓冲液
LCMV GP61-77 肽段（GLKGPDIYKGVYQFKSV）中国肽公司
LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒（适用于 633 或 635 nm 激发）Life TechnologiesL101991:200 稀释
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM 培养基Gibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE 抗小鼠 CD69（克隆 H1.2F3）Biolegend1045081:200 稀释
PE 小鼠抗 Bcl-6（克隆 K112-91）BD Biosciences5615221:50 稀释
磷酸盐缓冲液，PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
纯化大鼠抗小鼠 CXCR5（克隆 2G8）BD Biosciences5519611:50 稀释
大鼠单克隆 PerCP 抗小鼠 CD4（克隆 RM4-5）Biolegend1005381:200 稀释
重组小鼠 IL-2Gibco212-12-1MG
红细胞裂解缓冲液BeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 培养基SigmaR8758
RPMI 2%含 2% FBS 的 RPMI 1640 培养基
SMARTA（SM）TCR 转基因小鼠本实验室的 SM TCR 转基因品系由 Emory 大学 Rafi Ahmed 博士惠赠。此外，该小鼠品系也可从 The Jackson Laboratory（品系编号：030450）获得。
染色缓冲液含 2% FBS 和 0.01% NaN3 的 PBS
链霉亲和素 PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 稀释
TCF1/TCF7（C63D9）兔单克隆抗体（Alexa Fluor 488 偶联） Cell signaling technology6444S1:400 稀释
TFH 细胞染色缓冲液含 1% BSA 和 2% 小鼠血清的 FACS 缓冲液
TransIT-293 转染试剂Mirus BioMIRUMIR2700

参考文献

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