本文介绍了氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料作为一种抗菌纳米材料。评估了GO/Cu纳米复合材料对耐药性革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌效果。
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摘要
摘要
抗生素目前是最常用的杀菌抗菌治疗方法。然而，细菌在持续过度暴露于抗生素的情况下会逐渐产生耐药性。开发 开发能够替代现有抗生素的抗菌剂至关重要，因为耐药性细菌对所有当前抗生素均具有耐药机制，并可能促进医院内感染的发生。为应对这一挑战，本研究提出以氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料作为可替代现有抗生素的抗菌材料。采用透射电子显微镜和扫描电子显微镜对GO/Cu纳米复合材料进行表征，结果显示铜（Cu）纳米颗粒在氧化石墨烯片层上良好生长。此外，采用微量稀释肉汤法验证该抗菌物质对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）以及 铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa），这些细菌常与医院内感染相关。具体而言，99.8% 的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和 84.7% 的 P. aeruginosa 通过500 µg/mL的GO/Cu纳米复合材料可完全消除。金属纳米复合材料可通过释放离子、产生活性氧以及对细菌造成物理损伤来杀灭耐药菌。本研究证实了抗菌性GO/Cu纳米复合材料在清除耐药菌方面的潜力。
引言
细菌感染对公共健康具有重大影响。特别是致病性细菌能够逃避人体的保护机制并引发疾病1。抗生素被广泛用于治疗细菌感染。然而，抗生素的不当使用已加速了耐药细菌的出现。目前，由耐药细菌引起的医院内感染已在医疗机构中导致显著的临床难题2。不幸的是，针对目前所有抗生素，细菌均已存在相应的耐药机制3。因此，开发新型抗生素至关重要， 尽管 耐药机制出现的可能性仍然很高。
由于金属纳米颗粒具有显著的抗菌特性，其作为对抗耐药菌的有效制剂已受到广泛关注4,5,6。细菌难以对金属纳米颗粒产生耐药机制，因为这些颗粒不会与特定的细菌受体结合7。特别是银、铜和氧化锌纳米颗粒，因其卓越的抗菌效果，已成为大量研究的重点8,9,10,11,12,13。金属纳米颗粒对细菌的毒性主要归因于三种机制：1）金属离子的释放；2）活性氧（ROS）的产生，如•OH和•O2−；以及3）物理相互作用与附着4,14。
在本研究中，开发了氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料作为抗菌剂。铜（Cu）能够有效杀灭接触其表面的病原体，并干扰细菌的基因复制。然而，铜是人体必需的微量元素，由于哺乳动物细胞具有调节细胞内铜浓度的稳态机制，因此对哺乳动物细胞的毒性较低4。当铜纳米颗粒被氧化时，会生成铜离子，这些离子对带负电荷的细菌具有相对较高的亲和力15,16。铜离子可结合细胞结构（如蛋白质、膜和DNA），破坏细胞功能17。通过在氧化石墨烯（GO）表面合成铜纳米颗粒，可以控制金属离子的释放速率18,19,20。此外，氧化石墨烯（GO）本身也具有抗菌作用，其粗糙表面可通过氧化应激或活性氧（ROS）的形成来抑制细菌黏附21,22。更重要的是，GO/Cu纳米复合材料通过Cu2+的化学作用比GO产生更多的ROS，从而损伤细菌的蛋白质和DNA，导致细菌死亡23,24。
本文概述了氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料的合成方案，并介绍了一种针对临床细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和P. aeruginosa的抗菌测试方法，这两种细菌是最常见的多重耐药菌株，可引起医院内感染25。本方案旨在介绍一种简便的化学还原法，用于合成能够抑制耐药细菌生长的GO/Cu纳米复合材料。我们分别使用氯化铜（II）（CuCl2）和硼氢化钠（NaBH4）作为前驱体和还原剂。该方案还详细描述了采用微量稀释肉汤法将这些纳米复合材料应用于细菌的具体操作步骤。为排除金属纳米颗粒吸收干扰带来的误差并实现准确评估，抗菌能力通过菌落计数法进行评价。
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方案
1. GO/Cu 纳米复合材料的制备
注意：在氧化石墨烯纳米片上生长的铜纳米颗粒的尺寸和形貌由氧化石墨烯的氧化程度、铜前驱体的浓度以及还原剂的浓度决定26。
- 在玻璃瓶中配制10 mL浓度为1 mg/mL的氧化石墨烯（GO）悬浮液。将GO悬浮液超声处理1小时，直至GO在去离子水（DI水）中充分分散。
- 配制 20 mM CuCl 溶液2 溶液置于玻璃小瓶中。对CuCl进行超声处理2 溶液直至 CuCl2 在去离子水中分散良好。
- 加入10 mL的20 mM CuCl溶液2 将溶液加入GO溶液中，并对混合物进行超声处理 70 °C 1小时。
- 配制 20 mM NaBH₄4 溶液
警告：该步骤必须在化学通风橱中进行。还原剂 NaBH₄ 加入后立即发生氧化还原反应。4 加入水中。制备 NaBH4 实验前立即配制溶液。 - 配制 NaBH₄ 混合液4，GO 和 CuCl2
- 加入 20 mL 20 mM NaBH4 GO 和 CuCl 的溶液2 混合物，同时用磁力搅拌器以200 rpm的速度搅拌。加入NaBH后4 溶液，持续搅拌30分钟。
警告：此操作必须在化学通风橱中进行。
- 加入 20 mL 20 mM NaBH4 GO 和 CuCl 的溶液2 混合物，同时用磁力搅拌器以200 rpm的速度搅拌。加入NaBH后4 溶液，持续搅拌30分钟。
- 混合物的离心
- 将步骤1.5.1中的混合物转移至离心管中，在23,000 × g 室温孵育10分钟。弃去上清液。
警告：操作离心机时，务必通过放置重量相等的离心管来保持平衡。
- 将步骤1.5.1中的混合物转移至离心管中，在23,000 × g 室温孵育10分钟。弃去上清液。
- 用10 mL去离子水重悬GO/Cu纳米复合材料混合物，并进行超声处理，使沉淀物均匀分散于溶液中。
- 在 23,000 × g 条件下离心溶液 g 室温孵育10分钟，然后移除上清液。
- 重复步骤 1.7–1.8 一次，以去除未反应的化学物质。
- 向GO/Cu纳米复合材料中加入1 mL蒸馏水，超声处理混合物，使沉淀物在液相中均匀分散。
注意：将所有GO/Cu纳米复合材料溶液收集至一个锥形管中。 - 在 −80 °C 下冷冻干燥该溶液60 °C 在真空条件下干燥过夜，直至氧化石墨烯/铜纳米复合材料完全干燥，得到氧化石墨烯/铜纳米复合粉末。
- 将GO/Cu纳米复合粉末在−20 °C下保存20 °C 直至使用。
2. 抗菌试验用细菌的制备
警告：此操作必须在生物安全柜中进行，并使用酒精灯。细菌废弃物必须经高压灭菌后方可丢弃。处理耐抗生素细菌时，必须佩戴手套、防护服和口罩，实验结束后须使用肥皂或手部消毒剂彻底洗手。应始终彻底消毒；若实验区域发生污染，须立即使用70%乙醇进行消毒。
- 细菌培养基制备
- 在锥形瓶中混合 20 g 胰蛋白胨大豆琼脂和 500 mL 蒸馏水。将混合物在高压灭菌器中于 121 °C 灭菌 15 分钟。
- 在琼脂凝固前，将 15 mL 琼脂溶液倒入培养皿中以制备琼脂平板。将琼脂平板储存于 4 °C，待用。
注意：必须在琼脂溶液凝固前迅速操作。为防止污染，在琼脂凝固过程中使用紫外线照射灭菌 15 分钟。 - 在锥形瓶中混合 15 g 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和 500 mL 蒸馏水。将混合物在高压灭菌器中于 121 °C 灭菌 15 分钟。
- 将 40–50 mL 肉汤溶液分装至 50 mL 锥形管中。将肉汤储存于 4 °C，待用。
注意：为防止污染，对分装后的肉汤使用紫外线照射灭菌 15 分钟。
- 细菌培养
- 使用接种环将 MSRA 或 P. aeruginosa 菌种接种至琼脂平板上。将琼脂平板置于 37 °C 摇床培养箱中培养 24 小时。
- 使用接种环将单个细菌菌落接种至 10 mL 肉汤中。将肉汤置于 37 °C 摇床培养箱中，以 200 rpm 振荡培养 24 小时。
- 重复步骤 2.2.1–2.2.2 一次，以获得具有相同特性的细菌。
- 培养 24 小时后，使用无菌蒸馏水对细菌溶液进行十倍系列稀释。取 100 µL 稀释后的细菌悬液接种至琼脂平板上，并用涂布棒均匀涂布。将琼脂平板置于 37 °C 摇床培养箱中培养 24 小时。
注意：稀释程度取决于细菌种类。目标是使一个琼脂平板上的菌落数少于 100 个。 - 培养 24 小时后计数细菌菌落，利用公式（1）计算菌落形成单位（CFU）。
（1） - 重复步骤 2.2.4–2.2.5 至少三次，以确认细菌的 CFU 是否相对恒定。
3. 采用微量稀释肉汤法进行抗菌试验
- 第1天）用接种环从琼脂平板上挑取单个细菌菌落，接种至10 mL液体培养基中。将培养基置于37 °C、200 rpm的摇床培养箱中孵育24小时。
- 第2天）使用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）配制至少三种浓度的GO/Cu纳米复合材料混合液。对GO/Cu纳米复合材料悬浮液进行超声处理，直至纳米复合材料在DPBS中充分分散。
注意：本实验方案中测试了500、250、125和62.5 µg/mL的GO/Cu纳米复合材料混合液浓度。 - 制备对照溶液。阴性对照为DPBS，阳性对照为含1%青霉素/链霉素的DPBS溶液，可杀死细菌。
- 将100 µL GO/Cu纳米复合材料悬浮液及对照溶液加入96孔板中。所有样品均设三个复孔。
注意：在施加于细菌前，需用紫外光对样品灭菌15分钟。 - 根据孵育24小时后的菌落形成单位（CFU）数值，用TSB培养基将细菌悬浮液稀释至1 × 106 CFU/mL。
注意：本研究中，根据步骤2.2.5，MRSA和P. aeruginosa的初始培养悬浮液浓度分别为4.5 × 109 CFU/mL和3 × 109 CFU/mL。通过分别稀释4,500倍和3,000倍，获得1 × 106 CFU/mL的细菌浓度。 - 向96孔板的各样品孔中加入100 µL浓度为1 × 106 CFU/mL的稀释细菌悬浮液。将96孔板置于37 °C、200 rpm的摇床培养箱中孵育24小时。
注意：与100 µL样品混合后，细菌的终浓度为5 × 105 CFU/mL。 - 第3天）使用200 µL移液枪头剧烈混匀样品与细菌悬浮液。用无菌蒸馏水对样品-细菌混合物进行10倍系列稀释。
注意：稀释程度取决于细菌种类。目标是在琼脂平板上获得少于100个菌落。 - 取100 µL稀释后的细菌悬浮液接种于琼脂平板上，并用涂布棒均匀涂布。将琼脂平板置于37 °C摇床培养箱中孵育24小时。
- 第4天）计数细菌菌落，利用公式（2）计算CFU值，以确认GO/Cu纳米复合材料的抗菌活性。
(2)
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结果
通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）分析，确认了GO/Cu纳米复合材料的形成。图1A、B显示，非均相的Cu纳米颗粒生长在GO片层上。如图1C所示，EDS元素分布图证实了GO片层上的颗粒为Cu纳米颗粒。
图 1：GO/Cu 纳米复合材料的特性。（A）透射电子显微镜...
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讨论
本文报道了一种低成本且简便的方法，用于制备负载铜纳米颗粒的氧化石墨烯（GO）纳米片，该方法有望高效清除耐药性细菌。合成GO/Cu纳米复合材料的关键步骤是将GO和CuCl2在溶液中充分分散，并在混合过程中维持较高温度。此外，还原反应步骤必须迅速进行，因为还原剂一旦接触水即刻引发还原反应。通常情况下，铜纳米颗粒极易发生自聚集，在生理介质中稳定性较差28。GO可作为锚定纳米颗粒的基底，有效促进铜纳米颗粒在水中的分散29。本研究中，鉴于其潜在的生物医学应用价值，我们在合成GO/Cu纳米复合材料时未使用额外的表面活性剂和封端剂。
因此，干燥的氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料表现出明显的静电和团聚现象，但在水中分散良好。我们采用临床耐药菌模拟真实环境，以帮助确定在实际条件下影响耐药菌所需的GO/Cu纳米复合材料浓度。在我们之前的研究中，50 µg/mL的GO/Cu对非临床来源的P. aeruginosa生长抑制率达到67%
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披露
Jonghoon Choi 博士是纳米医学公司费曼技术研究所的首席执行官兼创始人，Yonghyun Choi 博士是该研究所的首席技术官。
致谢
本研究得到了2022年中央大学研究基金（在Jonghoon Choi教授学术休假期间）的支持。 本研究还得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的资助，该计划由教育部长资助（编号：RS-2023-00275006），以及韩国环境产业 & 科技研究院（KEITI）资助项目，由韩国环境部（MOE）提供资金支持（编号：2022002980003）。临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及 P. aeruginosa 来自韩国中央大学医院。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | |
| 临床多重耐药细菌菌株 | Chung-Ang University Hospital (韩国首尔) | ||
| 二水合氯化铜(II) | Duksan | 10125-13-0 | |
| 场发射扫描电子显微镜（FE-SEM） | Carl Zeiss | SIGMA | |
| 氧化石墨烯 | Sigma | 796034 | |
| 硼氢化钠 | Sigma | 71320 | |
| 透射电子显微镜（TEM） | JEOL | JEM-2100 | |
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | BD difco | 236950 | |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | BD difco | 211825 |
参考文献
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