下颌骨骨髓来源的间充质干细胞在多种分化、自我更新及免疫调节方面具有重要功能。它们已成为基因治疗、组织工程和再生医学中前体细胞的关键来源。本文介绍一种从大鼠下颌骨骨髓中分离间充质干细胞的独特方法。
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摘要
摘要
骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是一类具有多向分化潜能的干细胞。与来源于四肢骨的BMMSCs相比，来源于颌骨的BMMSCs具有更强的增殖能力和成骨分化能力，逐渐成为颌骨缺损修复的重要种子细胞。然而，下颌骨具有复杂的骨结构，且松质骨含量少于四肢骨，采用传统方法难以获取大量高质量的颌骨来源骨髓间充质干细胞。本研究提出一种基于“干细胞微环境”的方法，用于分离和培养大鼠颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSCs）。采用全骨髓贴壁法结合骨片消化法分离培养原代大鼠JBMMSCs，并通过细胞形态学观察、细胞表面标志物检测及多向分化诱导实验对分离细胞进行鉴定。结果表明，该方法获得的细胞呈“成纤维细胞样”梭形，细胞细长、呈梭形且类似成纤维细胞。流式细胞术分析显示，这些细胞表达CD29、CD44和CD90，而不表达CD11b/c、CD34和CD45，符合BMMSCs的表型特征。细胞具有较强的增殖能力，并可向成骨、成脂和成软骨方向分化。本研究提供了一种高效、稳定的方法，可在短时间内获得足量且高质量、具有强分化能力的JBMMSCs，有助于进一步开展其生物学功能、再生医学及相关临床应用的研究。
引言
间充质干细胞（MSCs）最初在骨髓中被发现，具有在培养中形成贴壁克隆的能力以及强大的成骨潜能1。Pittinger 等人2进一步发现其具有向骨、脂肪和软骨多向分化的潜能。尽管来源于不同组织的间充质干细胞均具备多向分化潜能，但与来自其他组织的间充质干细胞相比，骨髓间充质干细胞具有最强的软骨分化能力，因此被认为是骨组织工程中最理想的候选细胞3。然而，许多研究已证实，不同来源的骨髓间充质干细胞在成骨分化能力及细胞增殖活性等方面表现出部位特异性的特征和性质4,5。这可能是由于颌骨与四肢骨或髂嵴来源于不同的胚层所致6。
下颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSCs）起源于神经外胚层的神经嵴细胞，而股骨来源的BMMSCs则起源于中胚层7。与长骨和髂嵴来源的BMMSCs相比，JBMMSCs具有更高的增殖速率、碱性磷酸酶（ALP）活性以及成骨潜能8。此外，BMMSCs在不同组织和器官中的应用效果可能因细胞类型和微环境的不同而存在差异9。颌骨缺损的修复主....
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方案
本实验方案经中国人民解放军总医院机构动物伦理委员会批准。实验使用13周龄雄性Wistar大鼠。有关动物、试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 实验准备
- 将所有手术器械（包括眼科剪、镊子和咬骨钳）在高温高压下灭菌。
- 提前准备培养基。
- 准备含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的α-MEM完全培养基。
- 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制0.1% II型胶原酶。
- 在一次性无菌50 mL离心管中，用含1%青霉素-链霉素的PBS配制50 mL溶液。
2. 大鼠JBMMSCs的分离与培养
- 按照以下步骤分离大鼠下颌骨：
注意：为保持样本无菌，所有金属外科器械在使用前必须在酒精灯火焰上高温消毒至少三秒钟。- 通过腹腔注射 2% 戊巴比妥钠（2 mL/kg）对大鼠进行麻醉。
- 待大鼠呼吸频率降低且肌肉完全松弛后，采用颈椎脱位法处死麻醉后的大鼠（遵循机构批准的实验动物操作规程）。
- 将大鼠浸入 75% 乙醇中 30 分钟以消毒，然后转移至超净工作台。
- 将大鼠置于一....
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结果
细胞接种72小时后，大多数细胞呈悬浮状态且形态为圆形，仅有极少数细胞贴壁（图1B）。至第5天，出现贴壁细胞克隆，呈梭形或成纤维细胞样形态（图1C）。至第7天，贴壁细胞达到约90%融合度，形成“鱼群样”排列，其间散在少量间歇性悬浮细胞（图1D）。传代后细胞增殖迅速，每3天传代一次。细胞形态相对均一，主要呈梭形，融合后呈漩涡状排列（图1E-G）。
流式细胞术分析显示，间充质干细胞表面标志物 CD90、CD29 和 CD44 表达水平较高，阳性率分别为 97.2%、97.7% 和 95.7%。相反，造血干细胞表面标志物 CD45、CD34 和 CD11b/c 表达水平较低，阳性率分别为 1.37%、0.66% 和 1.49%（图 2A
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讨论
骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是一类存在于骨髓中的非造血干细胞，具有自我更新能力、多向分化潜能以及支持造血的功能。这些细胞在组织再生、血管生成及细胞活动调控等多种生理过程中发挥关键作用20。因此，BMMSCs 常被用作组织修复与再生工程中的理想种子细胞来源21。
下颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSCs）最初由Matsubara等人于2005年从人下颌骨骨髓抽吸物中分离获得22，其具有独特的分化特性，这归因于下颌骨与其他骨骼部位在起源和发育途径上的差异4,23。鉴于颅面骨独特的发育和病理机制，利用具有同源发育特征的JBMMSCs进行颅面骨缺损修复显得尤为必要23。此外，由于JBMMSCs与口腔微环境具有共同的胚胎组织来源，因而表现出更高的组织相容性
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由军事委员会后勤部医疗卫生项目（19BJZ22）、北京市 自然科学基金（7232154）和第四军医大学临床研究项目（2021XB025）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2%茜素红S溶液 | Solarbio | G1450 | |
| BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒 | Beyotime | C3206 | |
| Bio-Rad CFX96实时荧光定量系统 | Bio-Rad | ||
| CCK8试剂盒 | Dujindo | CK04 | |
| 细胞培养皿 10 cm | Corning | 353003 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 离心管 15 mL | Corning | 430790 | |
| 离心管 50 mL | Corning | 430828 | |
| CO2 培养箱 | Thermo Fisher | 3111 | |
| 恒温振荡器 | 上海智城分析仪器制造有限公司 | ZWY-100H | |
| 胎牛血清 | BI | 04-001-1ACS | |
| 流式细胞仪 | BD | FACS C6 | |
| 倒置相差显微镜 | Olympus | CKX41 | |
| 间充质干细胞（大鼠）表面标志物检测试剂盒 | Oricell | RAXMX-09011 | |
| 多功能酶标仪 | BioTek | Synergy LX Multi-Mode | |
| 油红O染色试剂盒 | Solarbio | G1262 | |
| 4%多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | |
| PBS | MACGENE | CC008 | |
| 青霉素-链霉素 0.25% | MACGENE | CC004 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher | A25742 | |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara | RR036A | |
| 大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化试剂盒 | Oricell | RAXMX-90031 | |
| 大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化试剂盒 | Oricell | RAXMX-90041 | |
| 大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化试剂盒 | Oricell | RAXMD-90021 | |
| RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP419 | |
| 超净工作台 | 北京亚泰科隆仪器技术有限公司 | KLCZ-1220A | |
| 胰蛋白酶-EDTA 0.25% | MACGENE | CC012 | |
| II型胶原酶 | Solarbio | C8150 | |
| Wistar大鼠 | 北京亚泰科隆仪器技术有限公司 | ||
| α-MEM培养基 | Gibco | C12571500BT |
参考文献
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage poten....
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