人和小鼠肿瘤组织样本的解离用于单细胞RNA测序

摘要

本方案概述了快速解离人和小鼠肿瘤样本以进行单细胞RNA测序的实验步骤。

摘要

人类肿瘤样本蕴含了大量关于其微环境和免疫组库的信息。将人类组织样本有效解离为具有活性的单细胞悬液，是进行单细胞RNA测序（scRNAseq）流程所必需的前期步骤。与传统的批量RNA测序方法不同，scRNAseq能够使我们在单细胞水平上推断肿瘤样本中的转录异质性。近年来，该技术的应用已带来诸多发现，例如识别出与免疫治疗及其他类型治疗临床应答相关的免疫细胞和肿瘤细胞状态及分子程序。此外，应用于解离组织的单细胞技术还可结合DNA条形码标记的抗体（CITEseq），用于鉴定可及的染色质区域、T细胞和B细胞受体组库，以及蛋白质的表达情况。

在使用这些技术时，解离后样本的活力和质量是关键变量，因为这些因素会显著影响单细胞与环境RNA之间的交叉污染、数据质量及结果解读。此外，过长的解离流程可能导致敏感细胞群体的丢失以及应激反应基因特征的上调。为克服这些局限性，我们设计了一种快速通用的解离方案，并已在多种人类及小鼠肿瘤样本中得到验证。该流程首先进行机械和酶解解离，随后依次进行过滤、红细胞裂解和活死细胞富集，适用于细胞起始量较低的样本（如穿刺针芯活检组织）。本方案可确保获得洁净且具有活性的单细胞悬液，这对于成功生成凝胶珠-油包水乳滴（GEMs）、条形码标记及后续测序至关重要。

引言

尽管癌症研究领域的诸多进展已推动了靶向免疫细胞和肿瘤细胞上表达的抑制性受体（即检查点阻断抑制剂）的药物开发并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，但治疗耐药性以及识别驱动患者应答的机制仍是当前面临的挑战¹。由于肿瘤在分子多样性方面的异质性，以及肿瘤细胞与免疫微环境之间存在复杂的相互作用，要在单细胞分辨率下解析这一复杂生态系统，亟需新的研究方法。深入理解肿瘤内部及其微环境中的分子复杂性，对于推进治疗策略和揭示癌症进展背后的复杂生物学机制至关重要²。单细胞RNA测序（scRNA-seq）因其能够对复杂肿瘤样本中的单个细胞进行高分辨率分析，近年来应用日益广泛^3,4。

肿瘤异质性包含遗传、表观遗传和表型多样性，这为揭示癌症生物学的复杂性带来了挑战⁵。传统的批量RNA测序方法往往会掩盖肿瘤内异质性细胞群体的独特表达谱和表型，因为这些方法对整个细胞群体的信号进行平均处理⁴。相比之下，单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够解析不同类型的单个细胞，揭示出以往被忽视的多样基因表达、抑制模式及细胞状态^4,

方案

本研究遵守所有关于人体组织取样的机构指南。已从患者处获得知情同意，且可识别的样本数据均已匿名化处理。样本在手术室采集后，置于RPMI、生理盐水或PBS溶液中，并经病理科确认为癌组织后方可用于研究。除特别说明外，所有步骤均应在4 °C或冰上进行。处理人体组织时应在生物安全柜内操作。有关本方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 获取样本

1. 将实体瘤样本放入含有培养基的离心管中，并置于冰上。
   1. 指示手术室工作人员将样本置于含有足够RPMI、生理盐水或PBS的离心管中，液面需完全浸没组织，以避免样本脱水。
      注意：确保样本不发生干燥非常重要，因为脱水会降低细胞活性。
2. 将所有离心机预冷至4 ˚C，并将温控混匀仪升至37 ˚C。
3. 取出预先配制的人源或鼠源肿瘤解离酶（材料表），在37 ˚C温控混匀仪上解冻，解冻后立即置于冰上。
4. 取20 mL RPMI培养基。
5. 记录相关样本信息（例如，患者编号、去标识化编号、样本类型）。
6. 将样本转移至60 mm细胞培养皿中（培养皿预先置于冰上），通过反复倒置离心管并将内容物倒入培养皿，确保所有样本材料均被转移。若样本送达时未浸泡在培养基中，则向培养皿....

结果

获取一份悬浮于RPMI中的黑色素瘤活检组织，并立即置于冰上。将样本转移至含有420 µL RPMI和消化酶的1.5 mL微量离心管中，用剪刀剪成小块，随后在37 °C垂直放置的恒温混匀仪中进行15分钟的酶消化（图1）。消化完成后，样本经50 µm无菌一次性滤器过滤，并用新鲜RPMI冲洗滤器以提高细胞得率（图1）。洗涤后残留的组织部分被弃去，因为这些为不需要的生物材料（例如脂肪组织）。

根据细胞沉淀的颜色，需要使用15 mL的ACK裂解缓冲液以去除红细胞（图2）。重悬于 3 mL RPMI 培养基后，总细胞数为 1 × 10⁶/mL，且存活率 <80% (图 3A）。这表明在进行10x Genomics上样前，需使用试剂盒1（第6节方案）对活细胞进行一轮富集。图4

讨论

本方案描述了使用10x Genomics微流控系统将人或小鼠肿瘤样本解离为单细胞悬液以进行单细胞RNA测序的步骤。在处理常来源于罕见癌症的组织样本，或涉及小鼠肿瘤的临床试验及长期实验样本时，必须在各步骤之间对样本进行最佳且谨慎的保存。所有操作步骤均应迅速在冰上或4 ˚C条件下进行，以维持细胞内源性RNA的原始状态并防止其降解，因为在室温下长时间操作将影响转录组质量^17,18。

为确保整个操作过程中细胞损失最小化，应采取多个步骤，尤其是在处理细针穿刺活检样本时尤为关键¹⁷。确保肿瘤样本的所有碎片均被纳入消化过程，将获得最理想的结果，因为从样本中提取的细胞越多，后续10x Genomics的微滴包裹与测序效果越好，最终回收用于分析的细胞数量和转录本总数也越多。若样本卡在送达时所用的管壁中，可加入培养基，将管子颠倒混匀，再转移至培养皿中进行处理。若初始样本已发生破碎或溶液浑浊，提示已有细胞悬浮于液体中，则应将样本连同送达时的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL 刻度移液管	Corning	357551
1000 μL 低吸附移液器吸头	Rainin	30389213
1000 μL 低吸附宽口移液器吸头	Rainin	30389218
1000 μL 移液器吸头	Rainin	30389212
10x 磁力分离器	10x Genomics	120250
15 mL 圆锥形离心管	Corning	430052
2 mL 吸液移液管	Corning	357558
20 μL 低吸附移液器吸头	Rainin	30389226
20 μL 移液器吸头	Rainin	30389225
200 μL 低吸附移液器吸头	Rainin	30389240
200 μL 移液器吸头	Rainin	30389239
50 mL 聚丙烯圆锥形离心管	Falcon	352098
60 x 15 mm 组织培养皿	Falcon	353004
ACK 裂解缓冲液	Gibco	A10492-1
BD 1 mL 注射器	Becton, Dickinson and Company	3090659
亮线血细胞计数板	Hausser Scientific	551660
氯化钙溶液	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
TC20 细胞计数仪专用细胞计数载片	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm 无菌一次性滤膜	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm 无菌一次性滤膜	Sysmex	04-004-2327
死细胞去除试剂盒	Miltenyi Biotec	130-090-101	于 -20 °C 保存；试剂盒 2
精细解剖镊	VWR	82027-386
DNA LoBind 微量离心管，1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM 死细胞去除 （Annexin V）试剂盒	STEMCELL Technologies	17899	于 4 °C 保存；试剂盒 1
Eppendorf 离心机 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf 离心机 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 电子移液控制器	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 型号 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	于 4 °C 保存，在生物安全柜中使用
德国不锈钢剪刀	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 显微镜	Leica Microsystems	454793
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS 多功能支架	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS 磁铁	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 培养基（1x）	Gibco	21870-076	于 4 °C 保存
TempAssure 0.2 mL PCR 8 管联排管	USA Scientific	1402-4700
台盼蓝染液 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
肿瘤解离试剂盒（人源）	Miltenyi Biotec	130-095-929	于 -20 °C 保存，按试剂盒说明配制酶液： 将冻干的酶 H 小瓶用 3 mL RPMI 1640 重悬 将冻干的酶 R 小瓶用 2.7 mL RPMI 1640 重悬 将冻干的酶 A 小瓶用试剂盒提供的 1 mL Buffer A 重悬
肿瘤解离试剂盒（小鼠源）	Miltenyi Biotec	130-096-730	于 -20 °C 保存，按试剂盒说明配制酶液： 将冻干的酶 D 小瓶用 3 mL RPMI 1640 重悬 将冻干的酶 R 小瓶用 2.7 mL RPMI 1640 重悬 将冻干的酶 A 小瓶用试剂盒提供的 1 mL Buffer A 重悬
UltraPure 去离子水	Invitrogen	10977-015	于 4 °C 保存