利用恒定气压反馈控制微注射针尖开口的湿法倒角技术

摘要

本方案描述了气动系统的组装过程，该系统可在针头开刃过程中向针头输送加压空气。本方案进一步介绍了制备锋利显微注射针头的开刃步骤，以及如何评估针头相对开口尺寸的方法。

摘要

显微注射针是将基因组修饰试剂、CRISPR 组分（引导 RNA、Cas9 蛋白和供体模板）以及转座子系统组分（质粒和转座酶 mRNA）递送至发育中昆虫胚胎的关键工具。在递送这些修饰因子时，尖锐的显微注射针尤为重要，因为它们有助于最大限度地减少对被注射胚胎的损伤，从而提高胚胎存活率，相较于使用非斜面针头进行注射具有明显优势。此外，经过斜面处理的针头在针头间的一致性优于通过随机折断针尖（如将针尖轻触盖玻片边缘或待注射胚胎表面等物体）来开孔的针头。采用持续气压向针内通气并结合湿法斜面处理显微注射针，可使操作者明确判断针头是否已打开（通过观察是否有气泡产生），并相对评估针头开口的大小。通过调节输送至针头的气压，直至达到平衡状态且针尖不再有气泡流出，即可确定针头的相对开口尺寸。达到平衡所需的气压越低，表明针头开口越大；反之，所需气压越高，则针头开口越小。

引言

昆虫基因改造是一种最初由Rubin和Spradling在果蝇中开发的技术，多年来该技术已被改进并应用于其他物种的基因改造¹。该技术依赖于在胚胎发育的特定时间窗口和空间位置，将基因改造组分精确地显微注射到胚胎中^2,3,4。锋利的显微注射针是某些昆虫（如蚊子^4,5,6,7,8,9和白蛉¹⁰）基因改造过程中的关键工具，而在其他昆虫（如家蚕¹¹）中则不那么重要。在尝试创建转基因昆虫时，注射针的锋利程度往往是决定成败的关键因素之一^2,4。通常，显微毛细玻璃针通过加热玻璃至其变得具有弹性，然后将其拉制成尖端闭合的锥形细针。在使用前，需要以特定方式打开针尖，使其形成适合注射的锋利开口。传统方法是将针尖轻轻刷过某个物体表面（如载玻片或盖玻片边缘，或胚胎本身等），使针尖少量碎裂，随机形成一个锋利的开口^2,3。另一种随机性稍低的方法是干斜面打磨法（dry beveling），即将针头快速接触一个光学平整、高速旋转的研磨盘表面，短暂研磨后使针尖少量玻璃被磨除，从而形成锋利的斜面开口。干斜面打磨法比直接刷针尖的方式更具可控性。下述方案在斜面打磨的基础上进一步改进：在液层下进行打磨，同时向针内通入压缩空气，一旦针尖被打开，即可观察到气泡产生。本方案详细描述了一种可稳定制备锋利显微注射针的方法。在液层下进行斜面打磨优于上述随机断裂针尖的方法以及干斜面打磨法，因为操作者可在打磨过程中获得实时反馈，从而判断针尖是否已打开以及开口的大致尺寸。了解针尖开口的相对大小，可使操作者根据需要制备不同开口尺寸的针头。不同开口尺寸的针头具有各自的优势；例如，较大开口的针头可适应高黏度的注射液，而较小开口的针头则对被注射胚胎造成的损伤更小。

使用调节器和基于改进型气压调节注射系统的聚氨酯管路向针头供气²。在以恒定压力向针头供气的同时，将针头在液层下方进行斜面打磨。该打磨过程包含重复执行的五个步骤：1）将针头下降至研磨表面；2）使针头在研磨表面短时间打磨形成斜面；3）在保持针头仍处于液面以下的前提下，将针头从研磨板上抬起；4）停止研磨板的旋转，观察是否有气泡出现。若无气泡产生，则重复步骤1至4，直至观察到气泡；5）一旦出现气泡，即可调节气压以确定针头开口的相对大小。停止气泡形成所需的气压越低，表明针尖开口越大。

方案

注意：下述方案使用 Sutter BV-10 微量毛细管斜面仪。然而，本方案可修改后适用于任何型号的微量毛细管斜面仪。

1. 调节器、压力表和气源管路的组装

1. 剪取一段聚氨酯管，用于连接气源与调压阀（R）底部（第1部分，图1）。该段管子的长度取决于气源到调压阀的距离，调压阀将位于切边器旁边。
2. 将一个软管夹套入聚氨酯管中，然后将一个软管接头插入管端。通过将软管接头抵住硬质表面，确保其完全插入。在靠近软管接头处握住管子，用力将管子压入接头，直至软管接头完全插入。软管夹与软管接头共同构成连接件HC（图1）。
3. 将软管夹滑向插入了软管接头的管端。旋转软管夹，使其覆盖插入的带刺端部，从而形成气密连接。
4. 用手将软管接头拧入调压阀（R）底部，然后使用小扳手完成紧固。确保连接处气密，但不要过度拧紧。
5. 用手将T型接头（T）拧入调压阀的侧端口，然后使用小扳手完成紧固。
6. 剪取一小段聚氨酯管（图1，第2部分），长度约为3–5 cm。在该段管子上套入两个软管夹，然后在管子两端各插入一个软管接头，并按照步骤1.2–1.4所述方法完成两端的连接（HC）。
7. 将短管的一端拧入压力表底部，然后如步骤1.5所述，使用扳手完成紧固。
8. 将短管的另一端拧入T型接头（T）的一个端口中，该T型接头已在步骤1.5中连接至调压阀。
9. 剪取一段聚氨酯管（图1，第3部分），用于连接调压阀与针头夹持器（NH）。该段管子的长度取决于切边器到调压阀位置的距离。
10. 在该段管子上套入一个软管夹，然后按照步骤1.2–1.4所述方法插入软管接头。
11. 在该段管子的另一端，安装针头夹持器（NH）配套提供的雌性鲁尔接头（LC）。
12. 从操纵器上拆下固定夹和尼龙垫圈（图2，f）。固定夹和垫圈仅设计用于固定玻璃微毛细管，不能承受微毛细管夹持器、螺纹杆和气源管路的额外重量。
13. 剪取一块1.5 cm × 2 cm的矩形橡胶垫片，用于包裹自行车挡泥板夹中的螺纹杆。这有助于在自行车挡泥板夹中更牢固地固定螺纹杆和针头夹持器。使用两把尖嘴钳打开自行车挡泥板夹，将矩形橡胶垫片在距螺纹杆一端3.5 cm处折叠覆盖在螺纹杆上，使其在杆上形成U形。将覆盖橡胶垫片的螺纹杆插入打开的自行车挡泥板夹中，并用钳子将夹子闭合并夹紧螺纹杆和橡胶垫片。将自行车夹和螺纹杆组件安装到操纵器螺栓上，重新安装固定夹（不带尼龙垫圈），并拧紧固定夹，使其牢固固定螺纹杆组件。
14. 将针头夹持器旋入螺纹杆。确保鲁尔接头末端的位置在连接时不会使聚氨酯管受力或扭曲（图2，g）。
15. 将雌性鲁尔接头连接至针头夹持器（图2，d）的雄性鲁尔接头（图2，g）。
16. 将图1中第1部分管子的自由端连接至气源（具体连接方式取决于所用气源）。气源应为洁净、干燥且无油残留的空气。气源可来自实验室集中供气系统或气体钢瓶，气体可为压缩空气或氮气（Nitrogen）。

2. 硼硅酸盐玻璃针的斜面处理

1. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管，在仪器上采用以下参数拉制显微注射针：加热温度：305，拉力：4，速度：70，延迟：235，气压：160，循环时间：12.24。
2. 根据制造商说明书组装研磨组件，该组件包括磨砂板和带磁铁的固定环¹²。
   注意：可能需要用一层薄的透明薄膜包裹磨砂板，以防止润湿剂（如Photo-Flo）过早泄漏。如果润湿剂溶液提前渗入底座油中，导致研磨板停止旋转，则需要采取此措施。润湿剂可降低玻璃针在斜面研磨后出现干燥痕迹的风险。使用润湿剂对研磨过程并非至关重要，可用清水替代。
3. 在底座的光学平整表面上滴加10滴底座油，并将研磨组件放置其上。启动研磨组件。
4. 打开光源以照亮表面。确保光源位于斜面后方，并以45°角照射到磨砂板和针尖上。此照明角度可使针尖的阴影清晰可见。在90倍放大倍数下，原位旋转显微镜头部。短暂停止磨砂板旋转，并将显微镜聚焦于磨砂板表面。
5. 向灯芯中加入1%润湿剂，直至灯芯完全湿润。再向磨砂板表面添加1%润湿剂。确保润湿剂覆盖整个磨砂表面，但不泄漏至黑色固定环上。
6. 当磨砂板旋转时，将预先润湿的灯芯放置在其表面。确保灯芯位于磨砂板左侧（从上方俯视时），并从11点钟方向延伸至6点钟方向（将磨砂板视为钟面）。确保灯芯不接触固定环的黑色部分。
7. 将针插入针夹（图2，d）中，并拧紧固定环以固定针头。打开调节阀（图1，R），将压力调至24 psi。
8. 旋转粗调旋钮（图2，a）提升针夹。确保针头升至足够高，高于旋转磨砂板的表面，然后旋转整个操纵器，使针头摆动至旋转磨砂板上方。待研磨的针头应放置在旋转磨砂板上，方向应使磨砂板的旋转方向远离针尖（图3A）。
9. 从侧面观察，使用粗调旋钮（图2，a）将针头缓慢下移靠近磨砂板表面。当针头接近液体表面时停止下移。
10. 降低显微镜放大倍数，移动显微镜使针头位于视野中央。一旦针头居中，提高放大倍数，并调整操纵器位置，使针尖保持在视野中心。达到最大放大倍数后，停止研磨板旋转，将显微镜聚焦于磨砂板表面，然后立即重新启动研磨板旋转。此时针头可能不在视野中。
11. 使用操纵器的粗调旋钮将针头继续向磨砂板靠近。在视野中，可看到针头及其阴影。当针头与其阴影接近接触时，切换至操纵器的微调旋钮，继续缓慢下移针头，直至针头与其阴影看似接触。此时读取游标卡尺读数（图2，c）并记录。磨砂板表面位于该读数处或更低位置。
    注意：由于难以准确判断针头是否接触旋转磨砂板表面，此时针头可能尚未实际接触磨砂板。
12. 保持针头在此游标读数位置5–10秒。
13. 使用操纵器微调旋钮将针头略微上提，确保其始终位于润湿剂液面以下。停止磨砂板旋转数秒，观察针尖是否有气泡逸出。若有气泡产生，则进入步骤2.15；若无气泡产生，则进入步骤2.14。
14. 使用操纵器微调旋钮将针头移回原游标读数位置，再略微下移并记录新的游标读数，然后重复步骤2.12–2.13。
15. 重新启动磨砂板旋转，观察旋转过程中是否出现气泡形成现象。若在旋转过程中可见气泡形成，则针尖开口可能过大，不适合对敏感胚胎（如蚊子胚胎）进行显微注射。若旋转过程中未见气泡形成，则针尖开口大小理想，适用于需要锐利且微小开口针头的操作。
16. 使用操纵器粗调旋钮将针头提升至高于磨砂板的位置，确保在旋转整个操纵器以将针头移离磨砂板和显微镜时，针头不会触碰任何部件。
17. 当针头处于可安全取出的位置时，将气压降至零，取下针头，并将其放入针头储存盒（如培养皿内附双面胶或橡皮泥以固定斜面针头）中，待后续使用。

3. 确定斜面针头的相对开口大小

注意：斜面针头相对开口大小的确定在步骤 2.13 中完成。以下步骤将进一步描述此过程。

1. 当步骤 2.13 中观察到气泡时，在研磨板不旋转的情况下，通过旋转调压阀调节旋钮（图 1，R）缓慢降低气压，直至针尖停止有气泡流出。记录气泡停止从针尖流出时的压力值。
2. 逐渐增加气压，直至针尖重新开始产生气泡。气压越高，针尖开口越小。
3. 继续移动针头至可安全移除的位置，执行步骤 2.16–2.17。

结果

上述步骤可稳定制备出尖锐的显微注射针。尖锐的针头能够轻松插入软壳昆虫胚胎（例如蚊子胚胎）中，几乎不会受到胚胎膜的阻力。在对蚊子胚胎进行遗传修饰的显微注射过程中，胚胎膜具有相对弹性。当使用钝针推压胚胎膜时，会导致膜发生凹陷（图4B）。当针头回撤后，膜会恢复原有形状。若施加足够压力，钝针最终会撕裂膜结构，导致胚质外泄。针头越锋利，当其压向胚胎膜时产生的凹陷就越小（图4E）。锋利的针头不会撕裂膜，而是顺利穿过膜层，对胚胎造成极小甚至无损伤。使用理想的针头时，针头插入胚胎过程中胚胎膜几乎不会发生形变。

马里兰大学昆虫转化中心（UM-ITF）是一家为学术界和工业界客户提供转基因昆虫创制服务的技术平台。该中心使用斜面针头对蚊子胚胎进行显微注射。在2023年1月至2023年12月期间，UM-ITF在56个客户项目中累计注射了12,795枚埃及伊蚊（Aedes）胚胎（表1）。使用斜面针头使UM-ITF在各项目中的平均注射后孵化率达到31%（表2）。此外，根据项目结束后的客户回访结果，UM-ITF的注射成功率维持在96%（表2）。注射成功率是指所注射的材料（如CRISPR向导RNA、Cas9蛋白、转座子载体质粒等）是否成功递送至胚胎中，并能够有效引发遗传修饰，即是否存在CRISPR插入缺失（Indel）形成的证据、客户提供的基于转座子的载体插入，或注射质量控制载体（含有启动子和标记基因的转座子末端）的插入。换句话说，若注射组分功能正常，注射操作本身是否足够优质以产生遗传修饰。影响遗传修饰项目成功的因素众多，而使用锋利针头进行高质量的显微注射是成功的关键因素之一。采用上述方案中描述的方法对针头进行斜面处理，使UM-ITF能够持续稳定地制备高质量的锋利显微注射针头，从而保障注射结果的一致性与成功率。

图 1：气路系统组件及其与微毛细管连接的示意图。 气源（可为室内供气或气瓶）通过聚氨酯管路将空气输送至毛细管针头。聚氨酯管路通过软管接头（HC）连接至调压阀（R）和压力表，软管接头由软管连接件和软管夹组成。该软管接头旋入调压阀（R）和压力表底部的10-32内螺纹接口。调压阀（R）上连接一个三通接头（T），用于将气流分配至压力表和针头夹持器（NH）。聚氨酯管路通过针头夹持器（NH）配套提供的鲁尔接头（LC）与针头夹持器相连。与气源的连接方式将根据所使用的气源类型而有所不同。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：操纵器部件及气路装置。 操纵器部件：a. 粗调旋钮，b. 微调旋钮，c. 卡尺，d. WPI 针持器，e. 角度计，f. 固定夹和自行车挡泥板夹，g. 鲁尔接头和鲁尔软管连接器，以及 h. 聚氨酯管。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：针头放置位置与磨砂盘旋转方向的关系。（A）修尖过程中正确的针头放置方式。待修尖的针头应放置在旋转的磨砂盘上，其方向应介于垂直于旋转方向与沿旋转方向之间，且旋转方向应远离针尖。（B）不正确的针头放置方式。在此取向下，磨砂盘的旋转会使磨砂表面直接推向针尖，而非从针尖下方经过。在此取向下，修尖过程可能无法顺利进行。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：非锐利针头与锐利针头穿刺效果的比较。 （A-C）非锐利针头，以及（D-F）锐利针头。（A）和（D）为针头接触胚胎前拍摄；（B）和（E）为针头即将刺穿胚胎膜的瞬间；（C）和（F）为针头刚刺穿后的状态。（B）中的白色箭头显示胚胎膜发生凹陷，这是由于非锐利针头需要施加更大的压力才能刺穿。（E）中的黑色箭头显示，由于使用锐利针头可轻松刺穿，因此未出现膜的凹陷现象。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：2023年1月至2023年12月马里兰大学ITF埃及伊蚊项目。 列出马里兰大学ITF埃及伊蚊显微注射项目，包括每个项目的注射胚胎数量、从这些注射胚胎中孵化的幼虫数量，以及每批注射胚胎的幼虫孵化百分比。请点击此处下载此表格。

表2：UM-ITF埃及伊蚊项目结果。 UM-ITF是一个提供昆虫遗传改造显微注射服务的技术平台。该表格列出了ITF在2023年1月至2023年12月期间完成的埃及伊蚊项目的注射数量。其中包括在项目后续跟踪调查中作出回应的客户数量，其回应表明了注射项目的成功或失败。成功项目指在胚胎发育的适当时间和位置将注射材料进行显微注射，且具备产生遗传修饰能力的项目；未成功项目指因未实现遗传修饰而被视为失败的项目。表格还列出了2023年1月至2023年12月期间埃及伊蚊显微注射项目的平均孵化率、项目成功率以及客户回应率。请点击此处下载该表格。

讨论

蚊子的基因改造依赖于将改造材料（质粒、引导RNA或蛋白质）精确地显微注射到囊胚前胚胎中^3,4,5,6,7,8。该过程的关键在于使用尖锐的注射针，以便在注射过程中轻松刺入胚胎^2,4。一根锋利的注射针能够顺利穿过胚胎膜，递送改造材料，并在显微注射后从胚胎中抽出，而不会导致注射部位出现胚胎质泄漏（个人观察）。

拉制完成的显微注射针头最初是封闭的，在注射前需要将其打开²。传统上，显微注射针头通常通过轻轻触碰盖玻片边缘、承载胚胎的载玻片边缘、胚胎本身或其他材料来打开²。然而，通过触碰物体来打开针头的方法结果不一致（个人观察）。有时针头会断裂成尖锐的形状，而其他时候则变得非常钝，正如之前所述，这可能会损伤待注射的胚胎，导致胚胎无法被成功修饰，严重时甚至导致胚胎死亡。另一种方法是将针头插入胚胎内以打开针尖，此过程可使针头破裂并具备注射条件。但这种方法同样产生随机结果，偶尔能形成非常尖锐的针头，但更常见的是在针头投入使用前被胚胎组织堵塞。尽管斜面打磨针头需要额外的时间和精力，但该方法能更稳定地制备出尖锐的针头。

对蚊子进行基因改造是一个依赖时间的过程，需要在胚胎发育至细胞化阶段之前对其进行显微注射^4,5,6,7,8。当通过将针头在物体表面轻刷或插入胚胎来开针时，开针并找到锋利针头所需的时间，恰好是胚胎已准备就绪并持续发育的阶段。在理想情况下，开针并获得合适针头仅需一到两分钟；但在其他情况下，该过程可能耗时较长，导致当合适的针头准备好时，已准备用于注射的卵已因过时而不再适合注射。斜面打磨法的优势在于其可预先完成，针头可提前准备好，一旦胚胎进入注射准备状态，即可立即使用，从而确保胚胎处于最适合注射的发育阶段。

尽管上述方案是为Sutter BV-10斜面仪开发并使用该设备，但该方案可修改后适用于任何斜面仪。主要因素是斜面加工表面必须能够容纳少量液体，针头在该液体下完成斜面加工。

在对显微注射针进行斜面打磨时，通过气源向针的尾部提供压缩空气具有两个优点。首先，气压有助于制备出一致性良好的针尖。当每次开始打磨时所施加的气压保持一致，并且在首次观察到气泡出现时立即停止打磨，即可获得锋利程度一致的针尖。关键在于，为了观察气泡的初始形成，必须暂时停止磨砂板的转动，以免其旋转运动掩盖气泡初现的迹象。如果仅在磨砂板转动时才能观察到气泡存在的证据，则针尖开口可能已过大。因此，必须确保每次开始打磨时供气压力相同，在气泡刚开始逸出时（即当磨砂板静止时可观察到）立即停止打磨，并且在磨砂板转动时无法看到气泡逸出。第二个优点是，一旦针尖开口形成，可通过逐步降低供气压力直至气泡停止从针尖逸出，来相对地评估开口大小。记录气泡停止从针尖流出时的压力值，即可推断出相对的开口尺寸：气泡停止流动时的压力越低，表明针尖开口越大；反之，压力越高，则针尖开口越小。了解针尖的相对开口大小，对于使用黏度较高、因而更容易堵塞注射针的注射混合液时尤为有用。利用这种相对开口大小的测量方法，可以制备出适用于高黏度注射液的注射针。当然，使用开口较大的针尖也会带来一些权衡。具体而言，注射后的胚胎更可能出现泄漏现象，且注射胚胎的存活率可能较低。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.0 mm 外径微毛细管	World Precision Instruments
斜面研磨台用油	Sutter Instruments	008
自行车挡泥板夹	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
臂式支架显微镜	AmScope		AMScope 3.5X-90X 三目 LED 臂式支架体视显微镜或同等产品
BV-10 斜面研磨仪	Sutter Instruments	BV-10
金刚石研磨板	Sutter Instruments	104F	金刚石研磨板 — 超细规格（尖端尺寸 0.2 µ 至 1.0 µ）
丁腈橡胶垫圈	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	用于密封 T  或 L 型接头的连接处（若接头本身未附带）
软管夹	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
软管接头	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	需准备 5 个软管接头
显微注射针持针器	World Precision Instruments	MPH3-10	适用于外径为 1 mm 的微毛细管的持针器
P-2000	Sutter Instruments		任意型号的拉针仪
Photo-Flo 200 溶液	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	润湿剂
压力表	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	量程 0–100 psi 的压力表
参比棉芯	Sutter Instruments	X050300
参比棉芯支架	Sutter Instruments	M100019
调压阀	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	连接端口需为 #10-32 规格
橡胶垫片（6 英寸 × 6 英寸）	Danco	Model # 59849
T 型接头	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
螺纹杆			可使用全螺纹杆或一端带螺纹的杆，螺纹规格必须为 10-32
聚氨酯管	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050