方法文章

从小组织和细胞培养样品中分离线粒体用于线粒体超复合物分析

DOI：

10.3791/66771

⸱

2024年5月3日

 , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案描述了一种在只有少量样品可用时分析呼吸超复合物的技术。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在过去的几十年里，关于呼吸超复合物 （SCs） 存在的证据积累改变了我们对线粒体电子传递链组织的理解，从而产生了"可塑性模型"的提出。该模型假设不同比例的 SCs 和复合物共存，具体取决于组织或细胞代谢状态。SCs 中组装的动态性质将使电池能够优化可用燃料的使用和电子转移的效率，最大限度地减少活性氧的产生并有利于电池适应环境变化的能力。

最近，在神经退行性疾病（阿尔茨海默病和帕金森病）、巴斯综合征、Leigh 综合征或癌症等不同疾病中报道了 SC 组装异常。SC 组装改变在疾病进展中的作用仍需确认。然而，获得足够数量的样品来确定 SC 组装状态通常是一个挑战。这种情况发生在活检或组织样本较小或必须分开进行多次分析、细胞培养物生长缓慢或来自微流控设备、一些原代培养物或稀有细胞，或者必须分析特定昂贵处理的效果（使用纳米颗粒、非常昂贵的化合物等）。在这些情况下，需要一种有效且易于应用的方法。本文提出了一种适用于从少量细胞或组织获得富集线粒体组分的方法，以通过天然电泳然后进行凝胶内活性测定或蛋白质印迹来分析线粒体 SCs 的结构和功能。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

超复合物 （SC） 是单个呼吸链复合物之间的超分子关联 1,2。自 Schägger 2,3 组最初鉴定 SC 并描述其组成以来，后来被其他组证实，确定它们在不同的化学计量中含有呼吸复合物 I、III 和 IV（分别为 CI、CIII 和 CIV）。可以定义两个主要的 SC 群体，一种含有 CI（单独含有 CIII 或 CIII 和 CIV）且分子量非常高（MW，较小的 SC 从 ~1.5 MDa 开始:CI + CIII2），另一种含有 CIII 和 CIV 但不含有 CIV，尺寸小得多（例如 CIII2 + CIV，具有 ~680 kDa）。这些 SC 在线粒体内膜中与游离复合物共存，比例也不同。因此，虽然 CI 主要以相关形式存在（即在 SC 中:~80% 在牛心脏中，在许多人类细胞类型中超过 90%）3，但 CIV 的游离形式非常丰富（在牛心脏中超过 80%），而 CIII 显示出更平衡的分布（~40% 在其更丰富的游离形式中， 作为二聚体，在牛心中）。

虽然它们的存在现在被普遍接受，但它们的确切作用仍在争论中 4,5,6,7,8,9,10。根据可塑性模型，根据细胞类型或代谢状态，可以存在不同比例的 SCs 和单个复合物 1,7,11。组装的这种动态性质将使细胞能够调节可用燃料的使用和氧化磷酸化 （OXPHOS） 系统的效率，以响应环境变化 4,5,7。SCs 还有助于控制活性氧的生成速率，并参与单个复合物的稳定和周转 4,12,13,14。已经描述了 SC 组装状态的改变与不同的生理和病理情况15,16 以及衰老过程17 有关。

因此，当葡萄糖被半乳糖4 取代时，酵母中 SC 模式的变化已经在酵母中被描述为2 和培养的哺乳动物细胞中的变化。空腹后小鼠肝脏8 和线粒体脂肪酸氧化被阻断时星形胶质细胞中也报道了修饰18。此外，在 Barth 综合征19、心力衰竭20、几种代谢21 和神经系统22、23、24 疾病以及不同的肿瘤25、26、27、28 中发现 SCs 和 OXPHOS 的减少或改变.在这些病理情况下，SC 组装和水平的这些改变是主要原因还是代表次要影响，仍在研究中15,16。不同的方法可以提供有关 SC 的组装和功能的信息;这些包括活性测量 8,29、超微结构分析30,31 和蛋白质组学32,33。一种越来越多地被采用的有用替代方案是 Schägger 小组为此开发的蓝色天然 （BN） 电泳34,35 的起点，这是前面提到的一些方法的起点。

这种方法需要可重现且高效的程序来获得和溶解线粒体膜，并且可以通过其他技术进行补充，例如凝胶内活性分析 （IGA）、二维电泳和蛋白质印迹 （WB）。BN 电泳对 SC 动力学的研究的一个限制可能是起始细胞或组织样品的数量。我们提出了一系列用于分析 SC 组装和功能的方案，这些方案改编自 Schägger 的小组方法，可应用于新鲜或冷冻的细胞或组织样品，起始剂量低至 20 mg 组织。

方案

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注: 表 1 中指定了所有培养基和缓冲液的成分，与本协议中使用的所有材料和试剂相关的详细信息列在 材料表中。

1. 从细胞培养物中分离线粒体

注意:检测的细胞的最小体积为 ~30-50 μL 的浓缩细胞（步骤 1.4）。这大约相当于至少两个或三个 100 mm 细胞培养板或一个汇合度为 80-90% 的 150 mm 板，具体取决于细胞类型（L929 来源细胞或 MDA-MB-468 中的 5 × 106 和 107 个细胞之间）。有效的细胞破损是一个关键步骤。

  1. 将贴壁细胞培养至约 80% 汇合，或将悬浮细胞培养至足够的密度。
  2. 通过以 500 × g 离心 5 分钟收获细胞（在非贴壁细胞的情况下直接从细胞悬液中收获，或者在贴壁细胞的情况下，使用含 0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的胰蛋白酶-EDTA 溶液在 1x PBS 中直接从细胞悬液中收获细胞）。
  3. 用冷的 1x PBS 洗涤细胞 2 次，并以 500 × g 离心 5 分钟沉淀。
    注意:从这一点开始，所有步骤都必须在 4 °C 下进行。 因此，所有试剂都必须是冷的，并且含有细胞或线粒体的试管必须保存在冰上。
  4. 第二次离心后，弃去上清液，估计细胞沉淀体积 （cpv），并将细胞在 -80 °C 下冷冻至少 15 分钟，以促进步骤 1.8 中的膜破裂。
    注意:此时可以停止该方案，并且细胞可以在-80°C下储存数周。通常，10 或 15 mL 锥形底刻度管是合适的。
  5. 让细胞在冰上缓慢解冻。
  6. 将填充的细胞沉淀重悬于体积等于 cpv 7 倍的低渗缓冲液（10 mM MOPS，83 mM 蔗糖，pH 7.2）中（例如，在 700 μL 缓冲液中加入 100 μL 的填充细胞）。
    注意:音量必须足以获得有效的 爆音（请参阅步骤 1.8 中的注释）。
  7. 将细胞悬液转移到适当大小的 Potter-Dounce 匀浆器中，并在冰中孵育 2 分钟，让细胞膨胀。例如，对于 700-800 μL 的细胞悬液，1 mL 容量的均质器就足够了。
  8. 通过在均质器中执行 8 到 10 次冲程来打破细胞膜，该匀浆器与以 600 rpm 旋转的电机驱动特氟龙杵相连。
    注意:在进行中风时，重要的是要产生一个真空，这将提高细胞破裂效率以及分别用于溶胀和脆弱膜的低渗和冷冻作用。如果做得好，每次冲程快速拉下均质器时，会听到"砰"的一声。
  9. 向细胞悬液中加入相同体积的高渗缓冲液（cpv 的 7 倍）（30 mM MOPS，250 mM 蔗糖，pH 7.2），以产生等渗环境。
  10. 将匀浆转移到 10-15 mL 试管中，并在固定转子中以 1,000 × g 的速度在 4 °C 下离心 5 分钟。
    注:包含未破碎细胞的原始试管可用于此目的。
  11. 将含有线粒体部分的上清液转移到 1.5 mL 聚丙烯管中。
  12. 可选:为了提高线粒体的产量，通过上下吹打，将步骤 1.10 中的沉淀重悬于缓冲液 A 的 7 倍细胞沉淀体积（10 mM Tris、1 mM EDTA、0.32 M 蔗糖，pH 7.4）中，并在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。 在进行步骤 1.13 之前，将新的上清液与前一个上清液混合。
  13. 在 4 °C 下以 16,000 × g 的微量离心机离心 2 分钟以收集线粒体粗馏分。
  14. 弃去上清液，用 0.5 mL 缓冲液 A 重悬每个富含线粒体的沉淀，将两个试管的内容物合二为一，并在步骤 1.13 中描述的相同条件下离心。重复相同的过程，直到所有材料都只在一个试管中。
  15. 弃去上清液，用 300 μL 缓冲液 A 重悬最终沉淀，并使用 Bradford 测定法定量线粒体蛋白浓度。像以前一样再次离心，然后继续进行第 3 部分。

2. 从少量动物组织中分离线粒体

注意:具有一定置信度的应用该方案的最小组织量取决于细胞类型及其线粒体丰度，但在大多数情况下可能是 ~20-30 mg 组织。组织样品可以是新鲜材料或冷冻样品。在后一种情况下，在开始程序之前，让样品在置于冰上的均质缓冲液中解冻。

  1. 称重或估计尽可能接近的组织量 （mg）。
  2. 用剪刀剪下组织，并在过滤器的帮助下在匀浆缓冲液中洗涤 3-4 次，注意避免丢失较小的碎片。
    注意:此步骤在骨骼肌或心脏等组织中比在大脑或较软的组织中更重要，后者的细胞可以很容易地通过匀浆步骤直接解聚。
  3. 添加新鲜的匀浆培养基（每克肝脏 4 mL，每克心脏、棕色脂肪组织 （BAT） 或肌肉 10 mL，以及每克大脑或肾脏 5 mL;参见 表 1 中每种情况的具体缓冲液组成）。
  4. 将含有缓冲液的组织片段转移到匀浆器中，并根据所选组织遵循最佳匀浆和线粒体分离方案。
  5. 从肝脏、脾脏和肾脏中分离线粒体
    1. 在 Elvehjem-Potter 中，用电动特氟龙杵以 600 rpm 的速度进行 4 到 6 次上下冲程的均质化。
    2. 将匀浆组织转移到无菌离心管中。在 4 °C 下以 1,000 × g 的水平转子离心 5 分钟。
    3. 用上一步获得的上清液填充 1.5 mL 聚丙烯管。在4°C的微量离心机中以16,000 × g 离心2分钟，然后如前所述进行（步骤1.13至1.15）
  6. 从心脏和肌肉样本中分离线粒体
    1. 在 Elvehjem-Potter 中，用电动特氟龙杵以 600 rpm 的速度进行 6 到 8 次冲程的均质化。将匀浆组织转移到无菌离心管中。
    2. 在 4 °C 下以 1,000 × g 的水平转子离心 5 分钟。 将上清液倒入干净的 1.5 mL 聚丙烯管中。
      注:步骤 2.6.2 中获得的沉淀的第二次匀浆可以通过 4-5 次额外的冲程和 1/2 体积的匀浆缓冲液进行，以提高线粒体产量。新的上清液（在 4 °C 下再次以 1,000 × g 离心 5 分钟后）可以在进行步骤 2.6.3 之前与前一个上清液混合。提高粗线粒体产量的另一种方法是在匀浆前在胰蛋白酶溶液中解离心脏和肌肉组织样品36,37。在这种情况下，在用洋地黄皂苷溶解线粒体膜之前，必须有效地灭活/去除胰蛋白酶（步骤 3.2）。
    3. 在微量离心机中以 16,000 × g 在 4 °C 下离心 2 分钟，以获得粗线粒体部分。
    4. 弃去上清液，用 0.5 mL 缓冲液 AT 重悬每个富含线粒体的沉淀，将两个试管的内容物合二为一，并在步骤 2.6.3 中描述的相同条件下离心。重复相同的过程，直到所有材料都只在一个试管中。
    5. 弃去上清液，用 300 μL 缓冲液 A（无 BSA）重悬最终沉淀，并使用 Bradford 测定法定量线粒体蛋白浓度。像以前一样再次离心，然后继续进行第 3 部分。
  7. 从大脑中分离线粒体
    1. 使用带有手动驱动玻璃杵的 Dounce 型玻璃均质器，以 10-15 次笔法将大脑的碎片均质化。将匀浆组织转移到无菌离心管中。
    2. 在 4 °C 下以 1,000 × g 的水平转子离心 5 分钟。
    3. 将上清液收集到干净的离心管中。
    4. 将先前离心步骤中获得的沉淀重悬于与第一次均质中使用的相同体积的培养基 AT 中。通过重复步骤 2.7.1 中描述的过程，使用 5-10 次传递重新匀浆沉淀，并在 4 °C 下以 1,000 × g 的摆动转子离心悬浮液 5 分钟。
    5. 去除上清液，将其添加到步骤 2.7.3 中制备的试管中。在固定角转子中以 10,000 × g 在 4 °C 下离心 10 分钟，以获得粗线粒体部分。
    6. 弃去上清液，将沉淀重悬至培养基 AT 初始匀浆体积（步骤 2.7.1）的 1/2 中。将线粒体悬浮液分配到干净的 1.5 mL 聚丙烯管中，并在 4 °C 下在微量离心机中以 16,000 × g 离心 2 分钟。
    7. 弃去上清液，用 0.5 mL 缓冲液 AT 重悬每个富含线粒体的沉淀，将两个试管的内容物合二为一，并在步骤 2.7.6 中描述的相同条件下离心。重复相同的过程，直到所有材料都只在一个试管中。
    8. 弃去上清液，用 300 μL 缓冲液 A（无 BSA）重悬最终沉淀，并使用 Bradford 测定法定量线粒体蛋白浓度。像以前一样再次离心，然后继续进行第 3 部分。
  8. 从 BAT 中分离线粒体
    1. 在 Elvehjem-Potter 中，用电动特氟龙杵以 600 rpm 的速度进行 8 到 10 次上下冲程的均质化。将匀浆组织转移到无菌离心管中。
    2. 在 4 °C 下以 1,000 × g 的水平转子离心 5 分钟。
    3. 用上一步获得的上清液填充 1.5 mL 聚丙烯管，避免上层脂肪层。
      注:可以对步骤 2.8.2 中获得的沉淀进行第二次均质化，以提高线粒体产量。新的上清液（在 4 °C 下再次以 1,000 × g 离心 5 分钟后）可以与前一个上清液混合，然后再进行步骤 2.8.4。
    4. 在 4 °C 的微量离心中以 16,000 × g 离心 2 分钟，2 分钟。
    5. 弃去上清液，用 0.5 mL 缓冲液 AT2 重悬每个富含线粒体的沉淀，将两个试管的内容物合二为一，并在步骤 2.8.4 中描述的相同条件下离心。重复相同的过程，直到所有材料都只在一个试管中。
    6. 弃去上清液，用 300 μL 缓冲液 A（无 BSA）重悬最终沉淀，并使用 Bradford 测定法定量线粒体蛋白浓度。像以前一样再次离心，然后继续进行第 3 部分。

3. Blue Native 分析样品的制备

  1. 在 BN 样品缓冲液（50 mM NaCl、50 mM 咪唑、5 mM 氨基己酸、4 mM PMSF）中重悬线粒体组分（从哺乳动物细胞培养物或组织中获得），以获得约 10 mg/mL 的蛋白质浓度。有关不同类型样品的预期产量，请参见 表 2 。
  2. 通过添加洋地黄皂苷（10% 储备溶液）溶解线粒体膜，以获得 4 g 洋地黄皂苷/g 线粒体蛋白的比例（4 μL 洋地黄皂苷 10% 原液与 10 μL 线粒体悬浮液在步骤 3.1 中制备）。
    注:必须针对每种类型的样品优化去污剂与蛋白质的比率 （g/g），以获得可重现的结果;发现 2-8 g 洋地黄皂苷/g 线粒体蛋白对大多数组织34,35 是最佳的。
  3. 轻轻上下移液混合。将样品在冰上孵育 5 分钟。
    注意:在此步骤之后，线粒体悬浮液应该变得更清晰（从不透明变为半透明）;否则，它可能表明去污剂的量不足以正确溶解膜。
  4. 在微量离心机（约 20,000 × g ）中在 4 °C 下全速离心 25 分钟以除去不溶性物质。
  5. 将上清液收集在新管中。向上清液中加入相当于初始重悬体积 1/3 的 5% G-250（考马斯蓝 G-250 5% 的 0.75 M 氨基己酸溶液）的体积（步骤 3.1，这对应于 1.6 克考马斯/g 蛋白质的最终比例）并通过移液混合。
  6. 上样到凝胶上之前，请放在冰上，或在 -80 °C 下冷冻等分试样。

4. Blue Native 凝胶电泳

注:电泳在冷藏室 （4-8 °C） 中进行。如果没有冷藏室设施，则可以在电泳槽中引入冷却块。使用市售的 3-13% 天然聚丙烯酰胺凝胶29，但也可以使用所需梯度浓度的自制凝胶38,39。

  1. 分别用冷阴极 A 和阳极缓冲液加载上腔室和下腔室。或者，将样品加载到孔中，然后小心地用阴极缓冲液 A 填充上腔室。
    注:我们的实验室使用市售电泳缓冲液，但可以按照 表 1 所示制备。
  2. 加载 30 至 100 μg 线粒体蛋白。
    注:通常，在 10 泳道凝胶（0.5 x 0.15 cm 孔）中，每孔上样 30-50 μg 蛋白质（用于 WB）或 40-100 μg 蛋白质（用于 IGA）。阴极 A 缓冲液含有考马斯蓝 G-250，呈深蓝色，因此很难看到上样时的凝胶孔。例如，用红色标记标记每个孔的中心很方便，以帮助在此步骤中放置移液器吸头。在设置 BN-PAGE 技术时，天然分子量标记可能很有用，以确认梯度凝胶是否正确形成，以及复合物和 SCs 模式是正确的。
  3. 在 80-100 V 下运行 25-30 分钟，然后在 160-180 V 下运行，将电流限制为 12 mA/凝胶，直到染料到达凝胶底部（总共 ~125-165 分钟）。
  4. 如果要进行凝胶内活性测定 （IGA），当染料前沿位于凝胶中间时（电泳开始后 ~1 小时），用阴极缓冲液 B 替换阴极缓冲液 A。
    注:尽管由于与 G-250 染料结合，一些条带是可见的（主要是复合物 V，可以被认为是分子量为 ~600 kDa 的"内部"制造商），因此可以在运行后记录凝胶而不进行任何染色，但通常，如果不染色或 IGA 测定，SC 和单个复合物将不可见。用于 IGA 检测或 WB 的凝胶不应染色或固定。
  5. 从凝胶盒中取出凝胶，继续进行考马斯蓝染色（第 5 节）、IGA 分析（第 6 节）或 WB 免疫检测（第 7 节）。

5. 凝胶染色

  1. 在室温 （RT） 下使用考马斯蓝染料溶液（考马斯染料 R-250，溶于 40% 甲醇、10% 乙酸中 0.25%;染色 10-15 分钟）对凝胶进行染色 10-15 分钟。
  2. 在 RT 下，在 40% 甲醇和 10% 乙酸中多次洗涤（通常为 4-5 x 15 分钟）脱色。
  3. 记录凝胶。

6. 凝胶活性 （IGA） 测定

  1. 在电泳结束前准备用于分析不同呼吸复合物的 IGA 溶液，并将其保存在黑暗中（例如，通过使用深色塑料盒或用铝箔覆盖）。 表 1 中详细介绍了每种缓冲液的组成。
  2. 将凝胶或要使用的泳道放在尽可能小的塑料盒中以容纳它。
  3. 添加足够体积的适当溶液以覆盖凝胶（通常分别为 5 或 10 mL，用于 5 或 10 个凝胶泳道），并在室温下轻轻摇动 （60-80 rpm） 孵育，避光孵育。
    注:孵育时间取决于要分析的复合物以及上样样品的性质和数量;CI 和 CIV 是最容易和最快的结果。因此，CI 活性通常会在几分钟后开始变得可见，而 CII 和 CIV 需要 ~30 分钟才能观察到，CV 需要 ~1.5-2 小时。在所有情况下，反应都可以持续数小时，并且可以通过将孵育移至冷藏室 （4-6 °C） 来降低信号增强速率，例如，进行过夜 （ON） 孵育。CIII 活性仅适用于透明的天然电泳 （CN），不适用于 BN34。
  4. 当出现适当的条带后，通过去除测定溶液，用蒸馏水洗涤 2 次，并用 40% 甲醇加 10% 乙酸固定凝胶（仅用甲醇固定的 CV 除外）30 分钟来终止反应。
    1. 要在 IGA 检测 CI 后分析 CIV 活性，请用蒸馏水洗涤凝胶 2 次，记录 CI 活性，将凝胶与 50 mM 磷酸钾缓冲液 （pH 7.2） 孵育 2 次（不固定）2 次，30 分钟，然后与完整的 CIV 反应缓冲液一起孵育，直到出现复合物 IV 条带（通常通过在室温或 4 °C 下孵育 ON）。
  5. 记录凝胶。
    注:对于 ATP 酶活性，由于显影条带为白色，因此在记录凝胶时，请将其放在深色背景上，以便看到透明条带。

7. 蛋白质印迹分析

  1. 根据 表 1 准备转移缓冲液，并保持在 4 °C 直至电泳结束。
  2. 将凝胶放入托盘中并加入转印缓冲液。在 RT 孵育 10-15 分钟。
  3. 切下一块与凝胶大小相同的 PVDF 膜，并在搅拌下在甲醇中活化 10 秒。用蒸馏水洗涤数次并加入转印缓冲液。在 RT 孵育 10-15 分钟，轻轻摇晃。
  4. 按以下顺序从下到上准备转印三明治，避免凝胶和膜之间出现气泡:盒的黑色面 - 海绵 - 吸墨纸 - 凝胶 - 膜 - 吸墨纸 - 海绵 - 盒的透明面。
  5. 关闭并锁定转印盒，将三明治按正确的转印方向放入转印槽中（黑色面朝向负极）。
  6. 用转移缓冲液填充转移槽，加入磁力搅拌器以搅动缓冲液，并在 80 V 下连接电源 2 小时或 100 V 下连接电源 1 小时。在 4 至 8 °C 之间（例如在冷藏室中）和传输系统中的冷却块进行传输。
  7. 取回膜并继续进行标准的蛋白质印迹方案，使用针对要检测的不同呼吸复合物的特异性抗体29。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

按照上述方案获得的线粒体产量取决于多种因素，例如细胞系或组织类型、样品的性质（即，是否使用新鲜或冷冻组织）或均质化过程的效率。 表 2 中收集了来自不同细胞系和组织的线粒体的预期产量。获得线粒体组分后，下一步是呼吸 SCs 模式的分析，这是在粗线粒体样品溶解和通过 BN-PAGE 电泳分离后进行的，然后是 IGA 分析或 WB 免疫检测。 图 1 显示了培养细胞系和小鼠肝脏线粒体样品电泳后未染色凝胶泳道的外观以及标准考马斯染色后的条带模式。

在图 2A、B 中，可以观察到使用 IGA 测定后人和小鼠细胞中 SC 组装模式之间的明显差异。因此，在小鼠细胞中观察到游离复合物 I，而在人线粒体中无法检测到。复合物 IV-IGA 模式在两种人类细胞系中非常相似（图 2B），同时在图 2A 中分析的两种小鼠细胞系之间存在差异。这些差异是由于 BL6 细胞表达 SCAF18 的突变变体。

SC 模式是通过此处描述的用于小样品的线粒体分离方案获得的，相对于用于较大样品的"常规"方案保持不变。这可以在 图 2C 中看出，通过将泳道 1 和 6（使用常规方案从 3 g 肝脏和 1.1 g BAT 中分离线粒体后获得）与泳道 2 和 5（使用此处提供的方案从大约 0.1 g 两个组织中获得）进行比较。正如可塑性模型中所提出的，呼吸复合物和 SCs 的相对比例根据细胞类型和代谢状态而变化。如图 2C、D 所示，不同的组织显示出不同的 SC 组装模式。因此，与其他组织相比，脑线粒体显示出非常低水平的游离复合物 I 和较高比例的 SC，并且 BAT 的特征是其低水平的 CV（图 2A）和高数量的 SC III + IV（图 2D）。心脏线粒体呈现高水平的 SCs 和 CV。培养细胞系和小鼠肝脏线粒体样品之间的 CV 组装模式非常相似（图 2E）。

SC 组装也可以通过 WB 进行分析，如图 3 所示，对于从脾控制和肿瘤细胞获得的两个样品。在这种情况下，30-50 μg 线粒体蛋白通常足以检测具有特异性抗体的不同复合物和 SC。 图 4 显示了在应用这些协议期间可能发生的一些主要陷阱。错误的凝胶梯度会产生异常和不需要的迁移模式，如图 4A 中的泳道 1 所示，由于凝胶中的丙烯酰胺浓度高于正常水平，SC 在泳道上部仍然靠近孔。样品在高温下孵育，即使相对较短的时间（此处为 37 °C 和 40 °C 持续 10 分钟）也会导致 SCs 和 CI 降解（图 4A 泳道 2-4）。同样，去污剂与蛋白质的比例对于获得良好的结果和足够的凝胶分离度至关重要。低于 2 g 洋地黄皂苷/g 蛋白质的比率时，条带分辨率逐渐降低，并且在较低浓度 （0.5 g/g） 下，在对应于 SCs 的区域中仅可见一条拖尾（图 4B）。

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图 1:从培养细胞系 （L929Balbc） 和小鼠肝脏中分离洋地黄皂苷通透性线粒体的 BNGE 后线粒体复合物和超复合物模式。 左侧的泳道（1 和 2）表示电泳后未染色凝胶的外观，其中只能检测到 CV，而右侧的泳道（3 和 4）显示考马斯染色后的条带模式。缩写:BNGE = Blue 天然凝胶电泳;CV = 复合物 V;SCs = 超复合物。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 2:从不同细胞系和小鼠组织中分离的线粒体的 IGA 分析。（A，B） 从 （A） 小鼠或 （B） 人细胞系分离的线粒体中指定复合物的凝胶内活性。L929Balbc 是我们实验室通过将线粒体从 Balb/cJ 小鼠血小板转移到 ρ°L929neo 细胞而产生的传输软粒体细胞系，如前所述 40,41。BL6 成纤维细胞是我们实验室从 BL6 小鼠耳活检中产生的永生化细胞系。（C） 使用常规方法从 3 g 肝脏（泳道 1）和 1.1 g BAT（泳道 6）开始，或采用此处介绍的方案，在所有情况下从大约 0.1 g 组织开始（泳道 2，肝脏;泳道 3，心脏;泳道 4，大脑和泳道 5 BAT）从小鼠线粒体分离的 CI-IGA 模式。（D） 小鼠肝脏、心脏、大脑和 BAT 线粒体中的 CIV-IGA 模式（在 CI-IGA 后执行，如图 2C 泳道 2-5 所示）。（E） 在小鼠培养细胞和肝脏中分析 CV-IGA 活性。每个泳道加载约 60-75 μg 线粒体蛋白。缩写:IGA = 凝胶内活性;SCs = 超复合物;CI = 复合物 I;BAT = 棕色脂肪组织。请单击此处查看此图的较大版本。

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图 3:脾脏样本中不同线粒体复合物和超复合物的 WB 免疫检测。从脾脏对照 （脾脏 M9） 和肿瘤 （肿瘤 M9） 样品中获得的线粒体复合物和 SC 的蓝色天然 PAGE 分离后，将它们转移到 PVDF 膜上，并依次与识别指定 CI、CIII、CIV 和 CII 亚基的抗体杂交（分别为图 A-D）。每个泳道加载约 50 μg 线粒体蛋白。星号表示先前 western 印迹的剩余信号。缩写: SC = 超复数;CI = 复合物 I;CIII = 复合物 III;CIV = 复合物 IV;CII = 复合物 II。请单击此处查看此图的较大版本。

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图 4:Blue-Native PAGE 的 SC 分析中的陷阱。 在不同溶解条件下从 （A） 新鲜小鼠肝脏和 （B） 冷冻大鼠肝脏中分离的线粒体的 CI IGA 分析。（A） 泳道 1，凝胶梯度浓度错误（8-13%，而不是正常的 3-13%）。泳道 2-4，样品分别在冰上或在 37 °C 和 40 °C 下孵育。（B） 使用不同的洋地黄皂苷/蛋白质比例进行溶解，从冷冻大鼠肝脏获得的线粒体 CI 的 IGA 模式。缩写: SC = 超复数;PAGE = 聚丙烯酰胺凝胶电泳;CI = 复合物 I;IGA = 凝胶内活性。 请单击此处查看此图的较大版本。

中等组成
低渗缓冲液10 mM MOPS，83 mM 蔗糖，pH 7.2
高渗缓冲液30 mM MOPS，250 mM 蔗糖，pH 7.2
均质缓冲液 A10 mM Tris、1 mM EDTA、0.32 M 蔗糖，pH 7.4
均质缓冲液 AT225 mM 甘露醇、1 mM EGTA、75 mM 蔗糖、0.01% BSA pH 7.4
均质缓冲液 AT2225 mM 甘露醇、1 mM EGTA、75 mM 蔗糖、0.02% BSA pH 7.4
BN 样品缓冲液50 mM 氯化钠、50 mM 咪唑、2 mM 氨基己酸、1 mM EDTA（pH 7.0）
洋地黄皂苷溶液10% 洋地黄皂苷的 50 mM NaCl、50 mM 咪唑、5 mM 氨基己酸、4 mM PMSF
BN 上样缓冲液5% 考马斯蓝 G 的 0.75 M 氨基己酸溶液
BN 阴极缓冲液 A50 mM tricine，15 mM Bis-Tris pH =7.0 （4 °C），0.02% G-250（考马斯亮蓝 G-250）
BN 阴极缓冲液 B50 mM 三辛，15 mM Bis-Tris pH=7.0 （4 °C），0.002% G-250
BN 阳极缓冲器50 毫米 Bis-Tris，pH = 7.0
复合物 I IGA 底物5 mM Tris-HCl pH 7.4、0.1 mg/mL NADH、2.5 mg/mL 硝基蓝四唑 （NBT）
复合物 II IGA 底物50 mM 磷酸钾缓冲液 pH 7.4、20 mM 琥珀酸钠、0.2 mM 吩嗪甲基硫酸盐 （PMS）、2.5 mg/mL NBT
复合物 III IGA 底物50 mM 磷酸钾缓冲液 pH 7.2,0.05% 二氨基联苯胺 （DAB）
复合物 IV IGA 底物与 CIII 加 50 μM 细胞色素 c 的溶液相同
复合物 V IGA 底物35 mM Tris、270 mM 甘氨酸 pH 8.3、14 mM MgSO4、0.2% Pb（NO3）2、8 mM ATP
染色液考马斯染料 R-250，浓度为 0.25%，溶于 40% 甲醇和 10% 乙酸中
脱色/固定液40% 甲醇，10% 乙酸
转移缓冲液48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、20% 甲醇

表 1:缓冲区和媒体组成。

细胞类型/组织起始金额预期产量（μg 线粒体蛋白）泳道数 （50-60 μg/泳道）
培养细胞
MDA-MB-468100 μL vpc300-400 微克6-9
143B 衍生100 μL vpc200-350 微克4-7
小鼠成纤维细胞100 μL vpc150-200 微克3-5
心100 毫克400-500 微克10-12*
骨骼肌100 毫克300-400 微克8-10*
肝100 毫克400-500 微克8-10
脾50 毫克150-250 微克3-5
蝙蝠100 毫克200-300 微克4-6
脑100 毫克250-300 微克5-8

表 2:来自不同细胞类型和小鼠组织的线粒体的预期产量。 从心脏或骨骼肌获得的线粒体部分比从其他组织获得的线粒体部分更纯净。因此，可以在凝胶中上样少量 （*）。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处描述的方案中引入的方法学调整旨在避免损失并提高产量，同时保持线粒体复合物活性（当足够量的样品的可用性受到损害时，这一点至关重要）并复制组织或细胞系预期的 SCs 模式（参见 图 2C).为此，由于不需要高线粒体纯度来正确检测 SC，因此只要有可能，步骤、时间和体积的数量就会减少。

因此，在通过低速离心匀浆和去除细胞核和未破碎的细胞后，将含有线粒体的上清液转移到 1.5 mL 聚丙烯管中，随后的离心以获得粗线粒体组分，通过提高速度并减少相对于常规方案的时间和体积，在微量离心机中进行。这允许在相对较短的时间内处理多个样品:据估计，可以在 ~2-2.5 小时内处理 10 个样品（从均质化开始（方案步骤 1.6. 或组织的等效步骤）到获得准备加载到凝胶中的 SCs 级分（方案步骤 3.7），并在保持活性的同时最大限度地减少损失。关于原始 Schägger 组方案的另一个变化是在膜溶解后用简单的微量离心离心代替 SCs 级分的超速离心步骤（方案步骤 3.4）。

该程序中有一些关键步骤。首先，细胞破损的效率，特别是在培养细胞的情况下（参见方案步骤 1.8 后的注释），特别是在小细胞的情况下。组织和细胞系在细胞断裂方面表现出不同的难度程度:例如，在心脏和肌肉中，此步骤通常不如肝脏或脾脏有效，但由于前者具有较高的线粒体含量，因此在产量上得到补偿。从肌肉或心脏中分离时提高线粒体产量的一种替代方法是在均质化前用胰蛋白酶处理样品。大脑是另一种在细胞破损方面效率低的组织，因为手动匀浆更温和且效率更低，也可能是因为该组织中细胞类型的变化较高，正如之前报道的那样 42。这可以通过我们方案中建议的第二个均质化步骤（步骤 2.7.4）来部分补偿。另一方面，如果细胞破损过多，则含有 SC 的最终样品可能会被核 DNA 片段污染，这可能会干扰电泳运行。当添加洋地黄皂苷以溶解线粒体膜时，这个问题表现为样品粘度的增加，可以通过用 DNAse I 处理来解决。

其次，如果去污剂与蛋白质的比例太低，则会导致膜溶解效率降低，并有可能形成聚集体。这可能在凝胶中表现为高分子量 SC 的分离度差（见 图 4）或 CIV 给出对应于寡聚物的多个条带43。如果比率过高，可能会导致 SC （主要是 CI-SCs） 的分解。第三，重要的是要在整个过程中避免加热样品（见 图 4），并避免重复的冻融循环，因为它们可能会影响 SC 组装状态。

在表 2 中，总结了几种细胞类型和组织样品的预期产量。这些值是近似值，将取决于电池破损效率和来源的性质。对于组织，如果起始材料是冷冻的，则往往比新鲜样品的产量更高。给出了可以加载的泳道数的估计值（考虑到每个泳道 50 到 60 μg 线粒体蛋白的负载）。

这里介绍的方案涵盖了各种组织和细胞类型，但差异很小，它们可用于新鲜或冷冻样品，需要简单的设备和相对较低的成本，不涉及使用昂贵的纯化试剂盒或梯度。然而，它们可能需要一些适应才能与特定的细胞类型或样品一起使用，以及当特定的线粒体群体（例如脑突触线粒体或肌肉肌膜下线粒体）是分析对象时。

由于 SCs 的确切生理作用以及 SCs 在病理情况下的潜在参与仍有待定义，因此需要分析它们的动力学以及影响其组装、稳定性和功能的因素。我们的方案可以代表有价值的工具，这些工具允许在小样本量以及各种细胞类型和组织上的 SCs 模式上获得可重复的结果，特别是当需要比较多个实验条件时29。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了 Ministerio de Ciencia e Innovación （https://ciencia.sede.gob.es/） 的资助号"PGC2018-095795-B-I00"和阿拉贡总局 （DGA） （https://www.aragon.es/） 对 PF-S 和 RM-L 的资助号"Grupo de Referencia: E35_17R"和资助号"LMP220_21"。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸PanReac131008
氨基己酸Fluka 分析7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons 有机物327721000
Bradford 分析Biorad5000002
考马斯蓝 G-250Serva17524
考马斯蓝 R-250默克1125530025
细胞色素 cSigma-AldrichC2506
二氨基  联苯胺 （DAB）Sigma-AldrichD5637
洋地黄霉素Sigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
不含脂肪酸的 BSA罗氏10775835001
甘氨酸PanReacA1067
均质器 特氟龙杵Deltalab196102
咪唑Sigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
甘露醇Sigma-AldrichM4125
甲醇LabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
小型反式印迹细胞BioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1单克隆抗体Invitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 至 12% 小型蛋白凝胶InvitrogenBN1001BOX
NativePAGE 阴极缓冲液添加剂 （20x）InvitrogenBN2002
NativePAGE 电泳缓冲液 （20x） InvitrogenBN2001
NDUFA9 单克隆抗体Invitrogen459100
硝基蓝四唑盐 （NBT）Sigma-AldrichN6876
Pb（NO3）2Sigma-Aldrich228621
PDVF 膜Amersham10600023
吩嗪甲基硫酸盐 （PMS）Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL 底物Thermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA 单克隆抗体Invitrogen459200
琥珀酸钠Sigma-AldrichS2378
链霉素/青霉素PAN 生物技术P06-07100
蔗糖Sigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 单克隆抗体Invitrogen459140
XCell SureLock Mini-CellInvitrogen （SureLock）编号 EI0001
小型细胞

参考文献

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