本方案描述了一种在样品量有限的情况下分析呼吸链超级复合物的技术。
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摘要
摘要
近几十年来，关于呼吸链超复合物（SCs）存在的证据不断积累，改变了人们对线粒体电子传递链结构的认识，从而提出了“可塑性模型”。该模型认为，不同组织或细胞代谢状态下，超复合物与独立复合物以不同比例共存。超复合物组装的动态特性使细胞能够优化可用燃料的利用和电子传递效率，减少活性氧的产生，并增强细胞适应环境变化的能力。
最近，已有报道称，在多种疾病中存在线粒体超复合物（SC）组装异常，例如神经退行性疾病（阿尔茨海默病和帕金森病）、Barth综合征、Leigh综合征或癌症。SC组装改变在疾病进展中的作用仍有待证实。然而，获取足够数量的样本以确定SC组装状态常常面临挑战。这种情况常见于体积较小或需用于多项分析的活检或组织样本、生长缓慢或来自微流控装置的细胞培养物、某些原代培养细胞或稀有细胞，以及需要分析特定昂贵处理方法（如纳米颗粒、价格高昂的化合物等）效应的实验场景。在这些情况下，亟需一种高效且易于操作的方法。本文介绍了一种经过优化的方法，可从小量细胞或组织样本中获得富集的线粒体组分，进而通过天然电泳结合凝胶内活性检测或蛋白质印迹法分析线粒体SC的结构与功能。
引言
超复合物（SCs）是各呼吸链复合物之间形成的超分子复合结构1,2。自Schägger研究团队首次鉴定出SCs并描述其组成2,3，并经其他研究团队后续证实以来，已明确SCs包含呼吸链复合物I、III和IV（分别为CI、CIII和CIV），且具有不同的化学计量比。可定义出两类主要的SCs：一类包含CI（以及单独的CIII或CIII与CIV的组合），分子量（MW）极高（较小的SC：CI + CIII2的分子量约为1.5 MDa）；另一类包含CIII和CIV，但不含CI，分子量明显更小（例如CIII2 + CIV，分子量约为680 kDa）。这些SCs与游离的呼吸复合物共同存在于线粒体内膜中，且比例各异。因此，CI主要以结合形式存在（即存在于SCs中：在牛心组织中约占80%，在多种人类细胞类型中超过90%）3，而CIV则大量以游离形式存在（在牛心组织中超过80%），CIII的分布则相对均衡（在牛心组织中，其较丰富的游离二聚体形式约占40%）。
尽管其存在目前已普遍被接受，但其确切作用仍存在争议4,5,6,7,8,9,10。根据可塑性模型，不同比例的超复合物（SCs）和单个复合物的存在可能取决于细胞类型或代谢状态1,7,11。这种组装结构的动态特性可使细胞根据环境变化调节可用燃料的利用以及氧化磷酸化（OXPHOS）系统的效率4,5,7。超复合物还可能有助于控制活性氧的生成速率，并参与单个复合物的稳定与更新4,12,13,14。已有研究报道，超复合物组装状态的改变与多种生理和病理状况15,16以及衰老过程17相关。
因此，已发现酵母中呼吸链超复合物（SC）的模式会随生长所用碳源的不同而发生变化2 ，在培养的哺乳动物细胞中，当葡萄糖被半乳糖取代时也观察到类似变化4。小鼠肝脏在禁食后8以及星形胶质细胞在线粒体脂肪酸氧化受阻时18，也报道过类似的修饰。此外，在Barth综合征19、心力衰竭20、多种代谢性疾病21和神经系统疾病22,23,24以及不同类型的肿瘤25,26,27,28中，均发现SCs和氧化磷酸化（OXPHOS）水平降低或发生异常。目前仍在研究这些病理状态下SC的组装和含量变化究竟是原发性病因，还是继发性效应15,16。多种方法可用于获取有关SC组装与功能的信息，包括酶活性测定8,29、超微结构分析30,31以及蛋白质组学分析32,33。一种日益广泛应用的有用替代方法，也是前述部分方法的基础，是通过Schägger团队为此目的开发的蓝色天然电泳（Blue native, BN）直接测定SC的组装状态34,35。
该方法需要可重复且高效的步骤来获取并溶解线粒体膜，并可结合其他技术进行补充，如凝胶内活性分析（IGA）、第二维电泳和蛋白质印迹（WB）。通过BN电泳研究超复合物（SC）动态变化的一个限制因素是起始细胞或组织样本的数量。本文介绍了一系列用于分析超复合物组装与功能的实验方案，这些方案改编自Schägger研究组的方法，适用于新鲜或冷冻的细胞及组织样本，起始样本量可低至20 mg组织。
方案
注意：所有培养基和缓冲液的成分详见表1，本实验方案中使用的所有材料和试剂的相关信息均列在材料表中。
1. 从细胞培养物中分离线粒体
注意：检测细胞的最小体积约为30-50 µL的压紧细胞（步骤1.4）。这大致相当于两到三个100 mm细胞培养皿，或一个150 mm培养皿在80-90%汇合度时的细胞量，具体取决于细胞类型（L929衍生细胞或MDA-MB-468细胞中约为5 × 106至107个细胞）。高效的细胞破碎是关键步骤。
- 将贴壁细胞培养至约80%汇合度，或悬浮细胞培养至适当密度。
- 通过离心（500 × g，5分钟）收集细胞（悬浮细胞直接离心；贴壁细胞则先用含0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA的1×PBS胰蛋白酶溶液进行常规消化后再离心）。
- 用预冷的1× PBS洗涤细胞两次，每次以500 × g离心5分钟。
注意：从本步骤起，所有操作均需在4 °C下进行。因此，所有试剂必须预冷，含有细胞或线粒体的离心管必须置于冰上。 - 第二次离心后，弃去上清液，估算细胞沉淀体积（cpv），并将细胞在-80 °C下冷冻至少15分钟，以利于步骤1.8中的细胞膜破裂。
注意：本方案可在此处暂停，细胞可在-80 °C下保存数周。通常使用10或15 mL带锥形底的刻度离心管较为合适。 - 将细胞置于冰上缓慢解冻。
- 用相当于细胞沉淀体积7倍的低渗缓冲液（10 mM MOPS，83 mM蔗糖，pH 7.2）重悬细胞沉淀（例如，100 µL压紧的细胞用700 µL缓冲液）。
注意：缓冲液体积应足够，以确保获得有效的pops （见步骤1.8的注释）。 - 将细胞悬液转移至适当规格的Dounce匀浆器中，在冰上孵育2分钟使细胞膨胀。例如，对于700–800 µL的细胞悬液，使用1 mL容量的匀浆器即可。
- 使用电动驱动的特氟龙研杵（转速600 rpm），在匀浆器中进行8至10次匀浆，以破坏细胞膜。
注意：匀浆过程中应形成负压，以增强细胞破裂效率，结合低渗处理和冷冻作用分别促进细胞膨胀和膜脆化。若操作得当，每次快速下拉匀浆器时会听到明显的"pop"声。 - 向细胞悬液中加入等体积的高渗缓冲液（7倍cpv）（30 mM MOPS，250 mM蔗糖，pH 7.2），以形成等渗环境。
- 将匀浆液转移至10–15 mL离心管中，在固定角转子离心机中以1,000 × g、4 °C离心5分钟。
注意：可使用原先盛有未破碎细胞的离心管进行此步骤。 - 将含有线粒体组分的上清液转移至1.5 mL聚丙烯离心管中。
- 可选：为提高线粒体得率，用相当于细胞沉淀体积7倍的缓冲液A（10 mM Tris，1 mM EDTA，0.32 M蔗糖，pH 7.4）通过吹打重悬步骤1.10所得沉淀，并在4 °C下以1,000 × g离心5分钟。将新获得的上清液与前次上清液合并，再进入步骤1.13。
- 在微量离心机中以16,000 × g、4 °C离心2分钟，收集粗线粒体组分。
- 弃去上清液，将每份富含线粒体的沉淀用0.5 mL缓冲液A重悬，将两管内容物合并为一管，并按步骤1.13所述条件再次离心。重复此过程，直至所有样品集中于同一离心管中。
- 弃去上清液，用300 µL缓冲液A重悬最终沉淀，采用Bradford法测定线粒体蛋白浓度。再次按前述条件离心，随后进入第3部分。
2. 从少量动物组织中分离线粒体
注意：使用本方案并获得可靠结果所需的最小组织量取决于细胞类型及其线粒体丰度，但在大多数情况下约为 20–30 mg 组织。组织样本可以是新鲜材料，也可以是冷冻样本。若为后者，在开始操作前，需将样本置于冰上的匀浆缓冲液中解冻。
- 尽可能准确地称量或估算组织的重量（mg）。
- 用剪刀将组织剪碎，并借助滤网在匀浆缓冲液中清洗3–4次，注意避免丢失较小的组织碎片。
注意：此步骤在骨骼肌或心脏等组织中比在脑组织或较软的组织中更为重要，因为后者可通过匀浆步骤直接轻松地解离细胞。 - 加入新鲜的匀浆介质（每克肝脏加4 mL，每克心脏、棕色脂肪组织（BAT）或肌肉加10 mL，每克脑或肾加5 mL；各情况的具体缓冲液组成见表1）。
- 将含缓冲液的组织碎片转移至匀浆器中，并根据所选组织类型，遵循最佳的匀浆及线粒体分离方案进行操作。
- 从肝脏、脾脏和肾脏中分离线粒体
- 使用电动驱动的聚四氟乙烯研杵，在Elvehjem-Potter匀浆器中以600 rpm的速度上下匀浆4至6次。
- 将匀浆后的组织转移至无菌离心管中，在4 °C条件下，于摆动转子离心机中以1,000 × g离心5分钟。
- 取上清液分装至1.5 mL聚丙烯离心管中（每管1.5 mL），在4 °C条件下，于微量离心机中以16,000 × g离心2分钟，随后按前述步骤（步骤1.13至1.15）继续操作。
- 从心脏和肌肉样品中分离线粒体
- 使用电动驱动的聚四氟乙烯研杵，在Elvehjem-Potter匀浆器中以600 rpm的速度上下匀浆6至8次。将匀浆后的组织转移至无菌离心管中。
- 在4 °C条件下，于摆动转子离心机中以1,000 × g离心5分钟。将上清液倒入干净的1.5 mL聚丙烯离心管中。
注意：可对步骤2.6.2中获得的沉淀物进行第二次匀浆，额外进行 4–5次研磨，并加入½体积的匀浆缓冲液，以提高线粒体得率。新的上清液（再次在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟后）可在进入步骤2.6.3前与前次上清液合并。另一种提高粗线粒体得率的方法是在匀浆前用胰蛋白酶溶液解离心脏和肌肉组织样品36,37。在此情况下，必须在使用洋地黄皂苷溶解线粒体膜（步骤3.2）之前，有效灭活或去除胰蛋白酶。 - 在4 °C条件下，于微量离心机中以16,000 × g离心2分钟，获得粗线粒体组分。
- 弃去上清液，将每份富含线粒体的沉淀物用0.5 mL AT缓冲液重悬，将两管内容合并为一管，并在与步骤2.6.3所述相同的条件下离心。重复此过程，直至所有材料集中于同一管中。
- 弃去上清液，将最终沉淀物用300 µL A缓冲液（不含BSA）重悬，并使用Bradford法测定线粒体蛋白浓度。再次按前述条件离心，然后进入第3部分。
- 从脑组织中分离线粒体
- 使用Dounce型玻璃匀浆器及手动驱动的玻璃研杵，对脑组织碎片进行10–15次匀浆。将匀浆后的组织转移至无菌离心管中。
- 在4 °C条件下，于摆动转子离心机中以1,000 × g离心5分钟。
- 将上清液收集至干净的离心管中。
- 将前次离心步骤中获得的沉淀物用第一次匀浆时所用的等体积AT介质重悬。重复步骤2.7.1所述过程，进行5–10次研磨，重新匀浆沉淀物，然后在4 °C条件下，于摆动转子离心机中以1,000 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，并将其加入步骤2.7.3中准备的离心管中。在4 °C条件下，于固定角转子离心机中以10,000 × g离心10分钟，获得粗线粒体组分。
- 弃去上清液，将沉淀物用相当于初始匀浆体积一半（步骤2.7.1）的AT介质重悬。将线粒体悬液分装至干净的1.5 mL聚丙烯离心管中，在4 °C条件下，于微量离心机中以16,000 × g离心2分钟。
- 弃去上清液，将每份富含线粒体的沉淀物用0.5 mL AT缓冲液重悬，将两管内容合并为一管，并在与步骤2.7.6所述相同的条件下离心。重复此过程，直至所有材料集中于同一管中。
- 弃去上清液，将最终沉淀物用300 µL A缓冲液（不含BSA）重悬，并使用Bradford法测定线粒体蛋白浓度。再次按前述条件离心，然后进入第3部分。
- 从BAT中分离线粒体
- 使用电动驱动的聚四氟乙烯研杵，在Elvehjem-Potter匀浆器中以600 rpm的速度上下匀浆8至10次。将匀浆后的组织转移至无菌离心管中。
- 在4 °C条件下，于摆动转子离心机中以1,000 × g离心5分钟。
- 将前一步骤获得的上清液分装至1.5 mL聚丙烯离心管中，注意避免取到上层脂肪层。
注意：可对步骤2.8.2中获得的沉淀物进行第二次匀浆，以提高线粒体得率。新的上清液（再次在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟后）可在进入步骤2.8.4前与前次上清液合并。 - 在4 °C条件下，于微量离心机中以16,000 × g离心2分钟。
- 弃去上清液，将每份富含线粒体的沉淀物用0.5 mL AT2缓冲液重悬，将两管内容合并为一管，并在与步骤2.8.4所述相同的条件下离心。重复此过程，直至所有材料集中于同一管中。
- 弃去上清液，将最终沉淀物用300 µL A缓冲液（不含BSA）重悬，并使用Bradford法测定线粒体蛋白浓度。再次按前述条件离心，然后进入第3部分。
3. 蓝色天然电泳分析样品的制备
- 将线粒体组分（来自哺乳动物细胞培养物或组织）重悬于BN样品缓冲液（50 mM NaCl，50 mM 咪唑，5 mM 氨基己酸，4 mM PMSF）中，使蛋白浓度约为10 mg/mL。不同样品类型的预期产量见表2。
- 加入去氧胆酸钠（10%储存液），使去氧胆酸钠与线粒体蛋白的质量比达到4 g/g（即在步骤3.1制备的10 µL线粒体悬液中加入4 µL 10%去氧胆酸钠储存液），以溶解线粒体膜。
注意：为了获得可重复的结果，需针对每种样品类型优化去污剂与蛋白的质量比（g/g）；大多数组织的最优范围为每克线粒体蛋白使用2–8 g去氧胆酸钠34,35。 - 轻轻吹打混匀，将样品置于冰上孵育5分钟。
注意：此步骤后，线粒体悬液应变得更透明（由不透明转为半透明）；否则可能表明去污剂用量不足以有效溶解膜结构。 - 在4 °C下，以最大速度（约20,000 × g）离心25分钟，去除不溶性物质。
- 将上清液转移至新管中，加入相当于初始重悬体积1/3的5% G-250溶液（0.75 M氨基己酸中的考马斯亮蓝G-250 5%溶液）（对应最终比例为每克蛋白含1.6 g考马斯亮蓝），并通过移液混匀。
- 上样前保持样品在冰上，或分装后于-80 °C冷冻保存。
4. 蓝色天然凝胶电泳
注意：电泳在低温室（4-8 °C）中进行。若无低温室设备，可在电泳槽中加入冷却块。可使用商用的3-13%非变性聚丙烯酰胺凝胶29，也可使用自制的所需梯度浓度的凝胶38,39。
- 分别在上层和下层电泳槽中加入冷阴极缓冲液A和阳极缓冲液。
注意：本实验室使用商用电泳缓冲液，但也可按照表1所示方法自行配制。 - 每孔上样30至100 µg线粒体蛋白。
注意：通常在10孔胶（孔尺寸为0.5 × 0.15 cm）中，每孔上样30–50 µg蛋白（用于WB）或40–100 µg蛋白（用于IGA）。阴极缓冲液A含有考马斯亮蓝G-250，呈深蓝色，会遮蔽凝胶加样孔的视野。建议使用红色记号笔标记每个加样孔的中心位置，以便在此步骤中准确定位移液器枪头。在建立BN-PAGE技术时，可使用天然分子量标准蛋白，以确认梯度胶正确形成，并验证超复合物（SCs）及各复合物的电泳条带模式是否正确。 - 以80–100 V电压运行25–30分钟，随后提高至160–180 V，并将电流限制在每块凝胶12 mA，直至染料迁移至凝胶底部（总时长约125–165分钟）。
- 若需进行凝胶内活性检测（IGA），当染料前沿迁移至凝胶中部时（约电泳开始后1小时），将阴极缓冲液A更换为阴极缓冲液B。
注意：尽管电泳结束后部分条带（主要是复合物V，因其结合G-250染料而可见，可视为分子量约600 kDa的"内参"标记）无需染色即可观察，但通常情况下，超复合物（SCs）及各个复合物在未染色或未进行IGA检测时不可见。用于IGA分析或WB检测的凝胶不应进行染色或固定处理。 - 电泳结束后拆卸凝胶，随后进行考马斯亮蓝染色（第5节）、IGA分析（第6节）或WB免疫检测（第7节）。
5. 凝胶染色
- 使用考马斯亮蓝染色液（0.25% 考马斯亮蓝 R-250，溶于 40% 甲醇和 10% 乙酸）在室温下染色 10–15 分钟。
- 在室温下用 40% 甲醇加 10% 乙酸溶液多次漂洗（通常为 4–5 次，每次 15 分钟）以脱色。
- 对凝胶进行成像记录。
6. 凝胶内活性（IGA）检测
- 在电泳结束前准备好用于分析不同呼吸复合物的IGA溶液，并避光保存（例如使用深色塑料盒或用铝箔包裹）。表1详细列出了每种缓冲液的组成。
- 将凝胶或需使用的泳道放入尽可能小的塑料盒中。
- 加入足量的相应溶液以完全覆盖凝胶（通常每5或10个泳道分别加入5或10 mL），在室温下避光、轻柔振荡（60–80 rpm）孵育。
注意：孵育时间取决于待分析的复合物以及上样样品的性质和量；复合物I（CI）和复合物IV（CIV）最容易且最快显色。通常，CI活性在数分钟后即可开始显现，CII和CIV约需30分钟可见，CV则需约1.5–2小时。所有反应均可持续数小时，若将孵育转移至冷室（4–6 °C）可减缓信号增强速度，例如进行过夜（ON）孵育。复合物III（CIII）活性仅适用于清晰天然电泳（CN），不适用于BN34。 - 当出现适当的条带后，移除检测溶液，用蒸馏水洗涤2次，再用40%甲醇加10%乙酸固定30分钟（CV除外，仅用甲醇固定）。
- 若需在IGA检测CI活性后进一步分析CIV活性，应先用蒸馏水洗涤凝胶2次，记录CI活性，然后将凝胶（切勿固定！）先后在50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.2）中孵育2次，每次30分钟，再转入完整的CIV反应缓冲液中孵育，直至复合物IV条带显现（通常在室温或4 °C过夜孵育）。
- 对凝胶进行成像记录。
注意：对于ATP酶活性检测，由于显色后条带为白色，成像时应将凝胶置于深色背景下，以便清晰观察透明条带。
7. 蛋白质印迹分析
- 根据表1配制转膜缓冲液，并在电泳结束前置于4 °C保存。
- 将凝胶放入托盘中，加入转膜缓冲液，在室温下孵育10–15分钟。
- 裁剪与凝胶相同大小的PVDF膜，在振荡条件下用甲醇活化10秒，用蒸馏水洗涤数次后加入转膜缓冲液，在室温下轻轻振荡孵育10–15分钟。
- 按从下至上的顺序制备转膜“三明治”结构，注意避免凝胶与膜之间产生气泡，顺序如下：胶盒黑色面–海绵–滤纸–凝胶–膜–滤纸–海绵–胶盒透明面。
- 关闭并锁紧胶盒，将“三明治”结构按正确方向放入转膜槽中（黑色面朝向阴极）。
- 用转膜缓冲液充满转膜槽，加入磁力搅拌子以搅动缓冲液，连接电源，80 V转膜2小时或100 V转膜1小时。转膜过程应在4–8 °C条件下进行（例如在冷室中），并使用冷却装置对转膜系统进行降温。
- 取出膜后，继续按照标准Western blot流程操作，使用针对不同呼吸链复合物的特异性抗体进行检测29。
结果
按照上述方案获得的线粒体得率受多种因素影响，例如细胞系或组织类型、样品性质（即使用新鲜或冷冻组织）以及匀浆过程的效率。不同细胞系和组织的线粒体预期得率汇总于表2中。获得线粒体组分后，下一步是分析呼吸链超复合物（SCs）的模式，该分析在粗制线粒体样品溶解后进行，通过BN-PAGE电泳分离，随后进行IGA分析或WB免疫检测。图1展示了电泳运行结束后未染色凝胶泳道的外观，以及培养细胞系和小鼠肝脏线粒体样品经标准考马斯亮蓝染色后的条带模式。
在图2A、B中，通过IGA检测可观察到人和小鼠细胞中SC组装模式之间的明显差异。因此，在小鼠细胞中可观察到游离的复合物I，而在人线粒体中则无法检测到。复合物IV-IGA模式在两种人细胞系中非常相似（图2B），而在图2A中分析的两种小鼠细胞系之间则存在差异。这些差异的原因在于BL6细胞表达一种SCAF1的突变变体8。
采用本方案中所述的适用于小样本的线粒体分离流程所获得的SC图谱，与用于较大样本的“常规”流程相比，其图谱模式保持一致。这一点可从以下结果中看出 图2C，通过比较第1道和第6道（分别采用传统方法从3 g肝脏和1.1 g棕色脂肪组织中分离线粒体所得）与第2道和第5道（分别采用本文所述方法从约0.1 g上述两种组织中分离所得）。根据可塑性模型的假设，呼吸链复合物与超复合物的相对比例随细胞类型及代谢状态的不同而变化。如图所示 图 2C，D不同组织表现出不同的超复合物（SC）组装模式。因此，与其它组织相比，脑线粒体中游离复合物I的水平极低，而超复合物的比例较高，棕色脂肪组织（BAT）的特征则是复合物V（CV）的水平较低图2A）以及高含量的SC III + IV（图 2D）。心脏线粒体中表现出高水平的超复合物（SCs）和复合物V（CV）。培养细胞系与小鼠肝脏线粒体样品之间的CV组装模式非常相似。图2E).
如图3所示，可通过蛋白质印迹法（WB）分析来自脾脏对照和肿瘤细胞的两个样品的超复合物（SC）组装情况。在此情况下，通常使用30–50 µg线粒体蛋白即可利用特异性抗体检测出不同的呼吸链复合物及超复合物。图4展示了在应用这些实验方案时可能出现的一些主要问题。不合适的凝胶梯度会导致异常且不理想的迁移模式，如图4A第1泳道所示，由于凝胶中丙烯酰胺浓度高于正常水平，超复合物滞留在泳道上部靠近加样孔的位置。即使在较高温度（此处为37 °C和40 °C）下孵育样品较短时间（10分钟），也会导致超复合物和复合物I（CI）的降解（图4A第2–4泳道）。同样，去垢剂与蛋白的比例对获得良好结果和适当的凝胶分辨率至关重要。当皂苷（digitonin）与蛋白的比例低于2 g/g时，条带分辨率逐渐降低；在较低浓度（0.5 g/g）下，仅能在对应超复合物区域观察到弥散的 smear 条带（图4B）。
图1：L929Balbc 细胞系和小鼠肝脏来源的十二烷基麦芽糖苷透化线粒体经BNGE分离后线粒体复合物及超复合物的分布模式。 左侧泳道（1和2）显示电泳结束后未染色凝胶的外观，此时仅可观察到CV；右侧泳道（3和4）显示考马斯亮蓝染色后的条带分布。缩写：BNGE = 蓝色天然凝胶电泳；CV = 复合物V；SCs = 超复合物。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：从小鼠不同细胞系和组织中分离的线粒体的凝胶内活性分析（IGA）。 （A,B）从小鼠（A）或人源（B）细胞系中分离的线粒体中指定复合物的凝胶内活性。L929Balbc 是本实验室通过将 Balb/cJ 小鼠血小板中的线粒体转移至 ρ°L929neo 细胞而构建的线粒体置换细胞系，方法如前所述40,41。BL6 成纤维细胞系是本实验室通过 BL6 小鼠耳部活检组织建立的永生化细胞系。（C）使用传统方法（起始材料为 3 g 肝组织（泳道 1）和 1.1 g 棕色脂肪组织（BAT）（泳道 6））或本方案（所有情况下起始组织量约为 0.1 g）从小鼠组织中分离线粒体后检测的 CI-IGA 图谱（泳道 2：肝；泳道 3：心；泳道 4：脑；泳道 5：BAT）。（D）在完成图 2C 中泳道 2-5 所示的 CI-IGA 后，对小鼠肝、心、脑和 BAT 线粒体进行的 CIV-IGA 图谱分析。（E）在小鼠培养细胞和肝组织中检测的 CV-IGA 活性。每泳道上样线粒体蛋白约 60–75 µg。缩写：IGA = 凝胶内活性；SCs = 超复合物；CI = 复合物 I；BAT = 棕色脂肪组织。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：脾脏样品中不同线粒体复合物及超复合物的WB免疫检测。 经蓝非变性PAGE分离来自脾脏对照（Spleen M9）和肿瘤（Tumor M9）样品的线粒体复合物及超复合物, 它们被转移至PVDF膜，并依次与识别所示CI、CIII、CIV和CII亚基的抗体杂交（图中各面板） A-D，分别）。大约 50 µg 每泳道上样线粒体蛋白量相同。星号表示之前一次Western blot残留的信号。缩写：SC = 超级复合物；CI = 复合物I；CIII = 复合物III；CIV = 复合物IV；CII = 复合物II。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：通过蓝色天然PAGE分析超复合物（SC）时的常见问题。 对从（A）新鲜小鼠肝脏和（B）冷冻大鼠肝脏分离的线粒体进行复合物I（CI）凝胶内活性（IGA）分析，使用不同的溶解条件。（A）泳道1：凝胶梯度浓度错误（8–13% 而非正常的3–13%）；泳道2–4：上样前样品分别在冰上、37 °C 和 40 °C 孵育10分钟。（B）使用不同皂苷素/蛋白比例溶解从冷冻大鼠肝脏获得的线粒体后，进行CI凝胶内活性检测的图谱。缩写：SC = 超复合物；PAGE = 聚丙烯酰胺凝胶电泳；CI = 复合物I；IGA = 凝胶内活性。请点击此处查看该图的放大版本。
| 培养基 | 成分 | ||
| 低渗缓冲液 | 10 mM MOPS, 83 mM 蔗糖, pH 7.2 | ||
| 高渗缓冲液 | 30 mM MOPS, 250 mM 蔗糖, pH 7.2 | ||
| 匀浆缓冲液 A | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M 蔗糖, pH 7.4 | ||
| 匀浆缓冲液 AT | 225 mM 甘露醇, 1 mM EGTA, 75 mM 蔗糖, 0.01% BSA, pH 7.4 | ||
| 匀浆缓冲液 AT2 | 225 mM 甘露醇, 1 mM EGTA, 75 mM 蔗糖, 0.02% BSA, pH 7.4 | ||
| BN 样品缓冲液 | 50 mM NaCl, 50 mM 咪唑, 2 mM 氨基己酸, 1 mM EDTA, pH 7.0 | ||
| 皂苷溶液 | 10% 皂苷溶于 50 mM NaCl, 50 mM 咪唑, 5 mM 氨基己酸, 4 mM PMSF | ||
| BN 上样缓冲液 | 5% 考马斯亮蓝 G 溶于 0.75 M 氨基己酸 | ||
| BN 阴极缓冲液 A | 50 mM 三羟甲基甘氨酸, 15 mM Bis-Tris, pH = 7.0 (4 °C), 0.02% G-250 (考马斯亮蓝 G-250) | ||
| BN 阴极缓冲液 B | 50 mM 三羟甲基甘氨酸, 15 mM Bis-Tris, pH = 7.0 (4 °C), 0.002% G-250 | ||
| BN 阳极缓冲液 | 50 mM Bis-Tris, pH = 7.0 | ||
| 复合物 I IGA 底物 | 5 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.1 mg/mL NADH, 2.5 mg/mL 硝基蓝四氮唑 (NBT) | ||
| 复合物 II IGA 底物 | 50 mM 磷酸钾缓冲液, pH 7.4, 20 mM 琥珀酸钠, 0.2 mM 甲基蓝吩嗪硫酸盐 (PMS), 2.5 mg/mL NBT | ||
| 复合物 III IGA 底物 | 50 mM 磷酸钾缓冲液, pH 7.2, 0.05% 二氨基联苯胺 (DAB) | ||
| 复合物 IV IGA 底物 | 与复合物 III 相同的溶液，另加 50 μM 细胞色素 c | ||
| 复合物 V IGA 底物 | 35 mM Tris, 270 mM 甘氨酸, pH 8.3, 14 mM MgSO4, 0.2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP | ||
| 染色液 | 0.25% 考马斯亮蓝 R-250 溶于 40% 甲醇和 10% 乙酸 | ||
| 脱色/固定液 | 40% 甲醇, 10% 乙酸 | ||
| 转膜缓冲液 | 48 mM Tris, 39 mM 甘氨酸, 20% 甲醇 | ||
表1：缓冲液与培养基成分。
| 细胞类型/组织 | 起始用量 | 预期产量（µg 线粒体蛋白） | 泳道数量（50–60 µg/泳道） |
| 培养细胞 | |||
| MDA-MB-468 | 100 µL vpc | 300–400 µg | 6–9 |
| 143B 来源细胞 | 100 µL vpc | 200–350 µg | 4–7 |
| 小鼠成纤维细胞 | 100 µL vpc | 150–200 µg | 3–5 |
| 心脏 | 100 mg | 400–500 µg | 10–12* |
| 骨骼肌 | 100 mg | 300–400 µg | 8–10* |
| 肝脏 | 100 mg | 400–500 µg | 8–10 |
| 脾脏 | 50 mg | 150–250 µg | 3–5 |
| BAT | 100 mg | 200–300 µg | 4–6 |
| 脑组织 | 100 mg | 250–300 µg | 5–8 |
表2：不同细胞类型和小鼠组织中线粒体的预期得率。 从心脏或骨骼肌获得的线粒体组分比从其他组织获得的更纯，因此可上样较少的量至凝胶中（*）。
讨论
所描述方案中引入的方法学改进 此处旨在避免损失并提高产量，同时维持线粒体复合物的活性（当样本数量不足时，这一点尤为关键），并重现组织或细胞系预期的呼吸链复合物（SCs）模式（参见 图2C）。为了实现这一目的，且由于检测SCs时无需高纯度的线粒体，因此在可能的情况下已尽量减少步骤数、操作时间和试剂体积。
因此，在匀浆后通过低速离心去除细胞核和未破碎的细胞，将含有线粒体的上清液转移至1.5 mL聚丙烯管中，随后在微量离心机中通过提高离心速度、缩短离心时间并减少样品体积的方式进行后续离心，以获得粗线粒体组分，相较于传统方案更为高效。该方法可在相对较短的时间内处理多个样品：粗略估计，从匀浆开始（方案步骤1.6或组织对应的等效步骤）到获得可直接上样至凝胶的SCs组分（方案步骤3.7） ，可在约2–2.5小时内完成10个样品的处理，同时最大限度减少样品损失并保持其活性。与原始的Schägger团队方案相比，另一项改进是在膜溶解以获得SCs组分后，用简单的微量离心替代超速离心步骤（方案步骤3.4）。
该实验流程中存在一些关键步骤。首先，细胞破碎的效率至关重要，尤其是对于培养细胞（参见步骤1.8后的说明），特别是体积较小的细胞。不同组织和细胞系在细胞破碎难度上存在差异：例如，心脏和肌肉组织通常比肝脏或脾脏更难破碎，但因其线粒体含量较高，最终得率仍可得到补偿。若需提高从肌肉或心脏组织中分离线粒体的得率，一种可行的替代方法是在匀浆前用胰蛋白酶处理样品。脑组织是另一类细胞破碎效率较低的组织，这可能是由于手动匀浆操作较为温和且效率较低，也可能与该组织中细胞类型的异质性较高有关，此前已有相关报道42。这一问题可通过本方案中建议的第二次匀浆步骤（步骤2.7.4）部分弥补。另一方面，若细胞破碎过度，则最终含有亚细胞组分（SCs）的样品可能被核DNA片段污染，从而干扰电泳过程。当加入洋地黄皂苷（digitonin）以溶解线粒体膜时，若样品黏度升高，则提示存在该问题，可通过DNA酶I处理予以解决。
其次，如果去垢剂与蛋白质的比例过低，会导致膜溶解效率降低，并可能形成聚集体。这在凝胶电泳中可能表现为高分子量超复合物（SCs）分辨率差（见图4），或复合物IV（CIV）出现对应于寡聚体的多条条带43。如果该比例过高，则可能导致超复合物（特别是复合物I超复合物，CI-SCs）解聚。第三，在整个操作过程中应避免加热样品（见图4），并避免反复冻融循环，因为这些因素可能影响超复合物的组装状态。
在表2中，列出了多种细胞类型和组织样本的预期得率汇总。这些数值为近似值，具体得率取决于细胞破碎效率及样本来源的性质。对于组织样本而言，若起始材料为冷冻保存的样本，通常比新鲜样本获得的得率更高。文中还给出了可上样泳道数量的估算（每条泳道上样量按50至60 µg线粒体蛋白计算）。
本文所述方案适用于多种组织和细胞类型，仅需少量调整即可用于新鲜或冷冻样品，所需设备简单且成本相对较低，无需使用昂贵的纯化试剂盒或梯度介质。然而，当研究特定线粒体群体（例如脑突触线粒体或肌膜下线粒体）时，可能需要根据具体细胞类型或样品进行一些优化和调整。
由于精原细胞（SCs）在生理过程中的确切作用及其在病理情况下的潜在参与尚未明确，因此有必要分析其动态变化以及影响其组装、稳定性和功能的各种因素。我们的实验方案可作为有价值的工具，能够 以在SCs上获得可重复的结果 样本量较小且涉及多种细胞类型和组织的模式，特别是在需要比较多种实验条件时29.
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由西班牙科学与创新部（https://ciencia.sede.gob.es/）资助，项目编号为"PGC2018-095795-B-I00"，以及由阿拉贡自治区政府（DGA）（https://www.aragon.es/）资助的“参考研究组：E35_17R”项目和项目编号“LMP220_21”资助，资助对象为PF-S和RM-L。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | PanReac | 131008 | |
| 氨基己酸 | Fluka Analytical | 7260 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Bis Tris | Acrons Organics | 327721000 | |
| Bradford 法蛋白定量试剂 | Biorad | 5000002 | |
| 考马斯亮蓝 G-250 | Serva | 17524 | |
| 考马斯亮蓝 R-250 | Merck | 1125530025 | |
| 细胞色素 c | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 二氨基 联苯胺（DAB） | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| EDTA | PanReac | 131669 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA） | Roche | 10775835001 | |
| 甘氨酸 | PanReac | A1067 | |
| 聚四氟乙烯（Teflon）匀浆器研杵 | Deltalab | 196102 | |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| K2HPO4 | PanReac | 121512 | |
| KH2PO4 | PanReac | 121509 | |
| 甘露醇 | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| 甲醇 | Labkem | MTOL-P0P | |
| MgSO4 | PanReac | 131404 | |
| Mini Trans-Blot 转膜装置 | BioRad | 1703930 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MTCO1 单克隆抗体 | Invitrogen | 459600 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| NativePAGE 3 至 12% Mini 蛋白凝胶 | Invitrogen | BN1001BOX | |
| NativePAGE 阴极缓冲液添加剂（20×） | Invitrogen | BN2002 | |
| NativePAGE 电泳缓冲液（20×） | Invitrogen | BN2001 | |
| NDUFA9 单克隆抗体 | Invitrogen | 459100 | |
| 硝基蓝四氮唑盐（NBT） | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Pb(NO3)2 | Sigma-Aldrich | 228621 | |
| PVDF 膜 | Amersham | 10600023 | |
| 吩嗪甲基硫酸盐（PMS） | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Pierce ECL 底物 | Thermo Scientific | 32106 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| SDHA 单克隆抗体 | Invitrogen | 459200 | |
| 琥珀酸钠 | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| 链霉素/青霉素 | PAN biotech | P06-07100 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| Tris | PanReac | A2264 | |
| UQCRC1 单克隆抗体 | Invitrogen | 459140 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
参考文献
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