建立一种使用自体血栓的微创大鼠肺栓塞模型

摘要

本文详细描述了一种使用自体血凝块建立微创大鼠肺栓塞模型的方法学。同时还提供了用于量化梗死面积和可视化肺动脉树的其他方法。

摘要

肺栓塞（PE）是导致心血管死亡的主要原因之一，给社会经济带来重大负担。尽管目前的治疗主要集中在抗凝和溶栓，但仍迫切需要更深入地理解其病理生理机制，并开发新的治疗策略。动物模型在理解肺栓塞和研发新疗法方面发挥着关键作用，其中啮齿类动物因伦理和成本因素被广泛使用。然而，现有的啮齿类肺栓塞模型受限于缺乏标准化操作流程，影响了实验的可重复性和不同研究之间的比较。本研究旨在建立一种使用自体血栓的微创大鼠肺栓塞模型。该模型包括微创采血技术、标准化血栓制备流程以及微创静脉通路。此外，还提供了用于量化梗死区域和可视化肺动脉树的技术方案。这些方法旨在提高啮齿类动物模型在研究肺栓塞进展中的可靠性，并促进新型治疗方法的开发。

引言

肺栓塞（PE）是院内死亡的主要原因，也是心血管死亡的第三大常见原因。尽管其发病率较高，预防和及时诊断仍然具有挑战性^1,2。抗凝和溶栓治疗在肺栓塞的治疗中至关重要，但要改善疾病管理，仍需进一步深入理解疾病进展机制，并开发新的治疗策略³。

在现代生物医学研究中，动物模型在阐明人类疾病机制和开发新疗法方面发挥着关键作用^4,5。由于伦理考量和成本效益较高，小鼠、大鼠、仓鼠和兔子常被用于肺栓塞（PE）建模^6,7,8,9,10。PE建模方法通常分为三类：体内血栓形成、体外血块注射以及非血栓性颗粒的给予。动物种类和建模技术的选择取决于具体的研究目标，因为尚无单一模型适用于所有研究目的。例如，专注于探索新型溶栓疗法的研究通常采用自体血块模型，而非非血栓性颗粒模型。

目前用于建立啮齿类动物肺栓塞模型的方法由于缺乏详细且标准化的操作流程而面临挑战。这影响了血液采样、血凝块形成以及随后的栓塞等关键步骤，而这些步骤对于确保不同研究之间结果的可重复性至关重要。此外，在量化栓塞区域以及准确绘制栓塞后栓子分布方面，目前仍存在显著的技术空白。解决这些不足对于提升啮齿类动物模型在肺栓塞研究中的可靠性与应用价值至关重要。

本研究详细描述了使用自体血凝块建立肺栓塞大鼠模型的实验方案。该模型具有微创采血技术、标准化血栓制备流程以及微创静脉通路等特点。此外，还提供了肺组织梗死区域的定量分析方法及肺动脉树的可视化技术，这些方法可能有助于推动后续的科研发现。

方案

所有动物实验均经中国医学科学院动物护理和使用委员会批准 & 中国医学科学院北京协和医学院（批准编号：IRM/2-1ACUC-2311-015）。本研究采用6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，体重约250 g。动物饲养于特定病原体阴性环境中，自由摄取均衡饲料和饮水。饲养条件为12小时光照/12小时黑暗循环，室温维持在22 °C ± 2 °C。所有动物在进行任何手术操作前均适应环境1周。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 仪器和材料

1. 麻醉设备：使用小型动物用气体麻醉机和异氟烷。
2. 手术材料：准备棉签、聚维酮碘消毒液、体视显微镜、剃毛器、医用胶带、1 mL 注射器配 27 G 针头、5 mL 注射器、10 mL 注射器、无菌生理盐水、纱布、8-0 无菌尼龙缝线、带缝合针的 6-0 无菌尼龙缝线、微型止血钳、微型镊子和精细剪刀。
3. 其他材料：准备与医用注射器兼容的 19 G 和 18 G 分液针、内径为 1.2 mm、长度为 10 cm 的硅胶管、内径为 3.0 mm、长度为 20 cm 的输液管、1.5 mL 离心管、移液器及移液器吸头。
4. 自制血栓发生器和血凝块注射装置（图 1）：将硅胶管连接至固定在 1 mL 注射器上的 19 G 分液针，制成血栓发生器。将输液管一端连接至 18 G 分液针，另一端连接至 5 mL 注射器，制成血凝块注射装置。

2. 自体血凝块制备

1. 麻醉
   1. 将动物放入麻醉诱导室，以2 L/min的流速给予4%异氟烷与空气的混合气体，持续2-3分钟（遵循机构批准的方案）。
   2. 将动物仰卧位固定于手术平台上，通过以0.4 L/min流速给予2.5%异氟烷维持麻醉状态。检测足底反射以确认麻醉深度足够。
   3. 将双侧前肢水平向两侧伸展，后肢向后伸展，充分暴露腹股沟区域，并使用医用胶带固定动物于该体位（图2A）。
2. 经颅腔静脉（CVC）采血
   1. 使用剃毛器和脱毛膏去除胸骨柄周围毛发，再用聚维酮碘溶液消毒皮肤3次。
   2. 将连接1 mL注射器的27 G针头垂直刺入左侧或右侧CVC，深度为8 mm，如图2A所示。
      注：CVC在体表的投影位于胸骨柄外侧5 mm处。两侧均可使用，选择不影响后续操作。
   3. 手持注射器，轻柔回抽活塞，在针筒内形成负压。缓慢退出针头，直至血液流入，随后保持该位置，直至采集到0.3 mL血液（图2B）。
3. 血栓制备
   1. 将采集的血液推入1.5 mL离心管中，注意避免产生气泡。
   2. 将血液吸入自制血栓发生器的硅胶管中，使血柱长度达到10 cm。
      注：上述两步操作应迅速完成，因为血液在离心管中会开始凝固并持续进展，影响最终获取血栓的质量。
   3. 静置30分钟，使血液完全形成血栓。在此期间，可同步为其他动物制备血柱。
   4. 将已凝固的血柱冲洗至含有无菌生理盐水的无菌培养皿中，并用生理盐水冲洗血栓柱3次（图2C）。
   5. 使用精细剪刀将血栓柱切成长度均为4 mm的均一血栓块（图2D）。将15–25个血栓块吸入已预先装有2 mL生理盐水的自制注射器中。
      注：血栓块长度不应超过1 cm，否则可能滞留在右心室。

3. 静脉通路准备

1. 暴露浅表腹壁血管
   1. 按照步骤2.1所述方法麻醉并固定同一动物。
   2. 剃除左侧腹股沟区域周围的毛发。在该区域涂抹脱毛膏，等待1分钟，然后用纱布擦去脱毛膏。用聚维酮碘对皮肤消毒3次。
   3. 在腹股沟区浅表腹壁血管起始处上方做一5 mm的皮肤切口。通常可通过观察腹股沟区域微小的搏动来定位浅表腹壁血管的起始位置。
   4. 在10倍放大体视显微镜下分离一层薄的皮下脂肪组织，以暴露浅表腹壁血管（图3A）。缝合切口，停止异氟烷供气，并将动物放入保温箱中恢复。
2. 分离浅表腹壁静脉
   1. 仔细将浅表腹壁静脉与伴行动脉、神经及脂肪组织分离。分离范围应包括近端至其汇入股静脉处，以及远端至第一静脉分支处。
   2. 用8-0无菌缝线结扎远端，并用微型夹子夹住缝线固定；近端则用连接另一微型夹子的8-0无菌缝线环进行控制（图3B）。
   3. 在分离段静脉的远端做一微小的横向切口。控制近端以防止出血。用生理盐水冲洗静脉管腔内残留血液。待静脉冲洗干净后，使用显微镊扩大静脉切口。

4. 栓塞术

1. 静脉插管
   1. 将自制注射器的针头经静脉切口轻柔插入静脉。用第三把止血钳固定针头，防止其滑出静脉。
2. 栓塞操作
   1. 缓慢推动推杆，注入少量生理盐水。若静脉充盈且无阻力，提示静脉通路通畅（图3D）。
   2. 继续推动推杆，通过浅表腹壁静脉通路将血栓注入股静脉。控制栓塞速度为每分钟5个栓子。观察动物呼吸情况；出现并逐渐加重的呼吸困难提示栓塞成功。
   3. 注入预定数量的血栓后，拔出针头，并结扎浅表腹壁静脉的近端。
   4. 缝合切口，将动物置于保温箱中。待动物苏醒后转移至笼中，并持续监测其呼吸及行为状态。

5. 梗死面积的定量分析

1. 安乐死与心脏灌注
   1. 将 25,000 U 肝素钠加入 250 mL 生理盐水中，充分混匀。将瓶连接至输液装置，并倒挂在 80 cm 高处。关闭输液装置的阀门。
   2. 使用过量异氟烷对动物实施安乐死（遵循机构批准的方案）。
   3. 用大剪刀剪开肋骨，打开胸腔，避免损伤肺脏和大血管。
   4. 将输液装置的针头插入左心室。打开输液装置的阀门，使含肝素的生理盐水开始灌注。用剪刀剪开下腔静脉和左心耳以利于液体流出。控制灌注速度为 50 mL/min。
      注：在此过程中，正常肺组织会变为白色，而栓塞区域仍呈锈色。
   5. 完成肝素化生理盐水灌注后，使用装有 4% 多聚甲醛溶液的 10 mL 注射器，经右心室穿刺肺动脉主干。通过肺部灌注 4% 多聚甲醛溶液，总灌注量为 30 mL，以固定肺组织。
2. 引入“梗死比”指标
   1. 固定后，将肺、心脏、气管、食管、胸腺及大血管作为一个整体，从脊柱和膈肌上完整切除¹¹。
   2. 仔细去除初始组织块中的食管、胸腺和脂肪组织，仅保留心脏、肺和大血管。
   3. 将剩余组织浸入足量的 4% 多聚甲醛溶液中，固定至少 48 小时。
   4. 使用分析天平称量整个肺脏的重量。用精细剪刀分离肺的梗死部分，并用同一台天平称量梗死组织的重量。使用以下公式计算梗死比：
      
      i 为梗死组织的重量，w 为整个肺脏的重量，I 代表梗死比。
   5. 在定量测定梗死区域后，修整经多聚甲醛固定的肺组织，用于石蜡包埋¹¹。

6. 肺动脉树的可视化

1. 肺动脉灌注造影
   1. 处死动物，并按照步骤5.1所述进行心脏灌注。
   2. 按等量（重量比）将稀释剂加入硅胶造影剂中，混匀后，再加入5%（重量或体积比）的固化剂，再次充分混合。
   3. 用1 mL注射器吸取1 mL混合液，排出空气，将针头经右心室插入肺动脉主干，固定针头以防止滑脱和反流。
   4. 轻压注射器推杆，使硅胶混合物灌注至肺动脉树。正常肺组织会被造影混合物染色，而梗死区域则保持锈红色。
      注意：肺动脉造影仅适用于完整的肺组织。通常0.6–0.8 mL的造影混合物足以填充肺动脉树。过量注射可能导致肺静脉也被灌注，从而影响肺动脉树的观察效果。加入固化剂后，混合物应在20分钟内使用完毕，否则将发生结晶。
   5. 灌注完成后拔出注射器，结扎肺动脉主干，并按照步骤5.2所述取下肺、心脏及大血管。将整块组织放入培养皿中，置于4 °C冰箱中过夜，以使造影混合物充分固化。
2. 透明化与观察
   1. 用剪刀将心脏和大血管从肺组织上分离，清除肺表面残留的固化物碎片。
   2. 将肺组织依次浸入25%、50%、75%、95%和100%的乙醇溶液中，每种浓度处理24小时，以彻底脱水。
   3. 将脱水后的肺组织浸入水杨酸甲酯中24小时。经此透明化处理后，肺动脉树清晰可见，栓子亦可被观察到，因为水杨酸甲酯不会清除血红蛋白（图4B，D）。

结果

PE模型的症状与病理学
栓塞过程中，大鼠出现呼吸急促，胸廓波动范围增大。当注入血栓长度少于10 cm时，几乎所有动物均成功度过肺栓塞发作期（建模动物中15只中有14只存活）。回笼饲养后，动物蜷缩于笼角，对食物和水的兴趣降低。然而，这些症状迅速缓解，数小时内动物行为恢复正常。栓塞前与栓塞后24小时的体重无显著差异（341.8 ± 10.4 与. 343.3 ± 8.5, p = 0.25).

大体病理学显示，栓塞（梗死）区域呈楔形，主要位于肺的下部，边界清晰。在梗死区域的顶端可见栓子，阻塞了肺动脉的一级和二级分支。采用苏木精-伊红染色的显微病理学检查证实了肺动脉分支的栓塞（图4F）。

血栓负荷与梗死面积
在初步研究血栓负荷对肺梗死影响的实验中，我们测试了低血栓负荷（6 cm 血栓柱，15 块血块）和高血栓负荷（10 cm 血栓柱，25 块血块）两种情况。结果如预期所示，较高的栓子负荷导致更大范围的肺梗死（图 5A-C）。

24 小时内的内在纤溶作用
与栓塞后立即采集的肺组织样本相比，栓塞后 24 小时采集的肺组织样本显示梗死区域明显减少，表明大鼠具有较强的内在纤溶潜力（图 5D）。

图 1：血栓发生器和血凝块注射装置的构建。（A）通过将硅胶管连接至18 G分配针头（外径12 mm）和预先装有0.5 mL生理盐水的1 mL注射器，组装成血栓发生器。（B）通过将19 G分配针头（内径0.84 mm，外径1.08 mm）连接至输液管（血凝块容器）和预先装有2 mL生理盐水的5 mL注射器，构建血凝块注射装置。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：血液采集与凝块制备。（A）大鼠被麻醉后固定于仰卧位。带虚线的白色圆圈指示胸骨柄，作为体表标志。白色圆圈旁的红点表示穿刺部位，用于进入双侧前腔静脉（CVC）。图的下半部分展示了尸检示意图，显示胸骨柄、CVC及穿刺部位的相对位置。（B）通过右侧CVC成功采集血液。（C）血栓化的血柱从自制血栓发生器中被冲洗出。（D）从血栓化血柱中获得的血凝块。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：静脉通路建立与栓塞。（A）通过5 mm皮肤切口暴露浅表腹壁上血管，蓝色箭头指示浅表腹壁上静脉，红色箭头指示浅表腹壁上动脉。（B）将浅表腹壁上静脉从周围组织中游离，并用尼龙缝线控制静脉。（C）自制注射器，内含血凝块。（D）使用自制注射器的给药针头穿刺静脉，经静脉通路注入血凝块。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：肺栓塞的病理学表现。（A）经心脏生理盐水灌注及4%多聚甲醛固定后的正常肺组织。（B）通过硅胶铸型混合物与水杨酸甲酯透明化技术显示的正常肺组织，可见通畅的肺动脉树及微血管结构。（C）自体血凝块栓塞后立即获取的肺组织，标记区域显示因栓塞导致的肺梗死。（D）通过硅胶混合物铸型及水杨酸甲酯透明化技术显示的病变肺组织，黑色箭头指示阻塞肺动脉分支的栓子，白色虚线圆圈指示其受累区域，该区域已发生梗死。（E）左肺叶解剖图，显示肺动脉分支中的栓子（红色箭头）。（F）肺动脉分支内血凝块栓塞的显微图像，采用苏木精-伊红染色。比例尺：200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：肺梗死比率的定量分析。（A）栓塞后立即取自大鼠的肺组织，栓子为10 cm长的血凝块（总长度）。（B）栓塞后立即取自大鼠的肺组织，栓子为6 cm长的血栓。（C）栓塞后立即取自大鼠的肺组织，栓子为8 cm长的血凝块。（D）栓塞后24小时取自大鼠的肺组织，栓子为8 cm长的血凝块。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究成功建立了一种采用自体血凝块的微创大鼠肺栓塞模型。熟练掌握后，该建模过程可在30分钟内完成。病理学检查证实，该模型能有效模拟临床肺栓塞的关键特征。因此，该模型为阐明肺栓塞后血流动力学变化及并发症的发病机制、开发新的诊断生物标志物和治疗靶点，以及测试新型抗血栓疗法提供了有价值的工具。

几十年来，人们在建立肺栓塞（PE）动物模型方面做出了大量努力，但至今尚未有一种方法被公认为模拟PE的最佳方案¹²。本文介绍的改良PE模型具有以下几个显著特点：（1）通过中心静脉导管（CVC）采血：在啮齿类动物中，CVC连接锁骨下静脉与颈内静脉的汇合处，并向尾侧延伸进入胸腔¹³。左侧和右侧CVC几乎呈对称分布。CVC管腔较颈静脉更大，位置靠近胸骨柄，位于胸大肌下方。这些解剖学特征使得静脉穿刺更为精确，可采集较大体积的血液样本，且止血迅速，从而获得较高的成功率。此外，通过CVC采血相比其他采血途径更不易受到污染，血肿、血栓形成和气胸等并发症的发生率也较低。止血通常可自动完成或通过按压快速实现。（2）通过浅表腹壁静脉注射：通常采用颈外静脉注射血凝块以诱导PE^6,8,9，暴露该静脉所需的皮肤切口可做到最小化。然而，颈外静脉插管常导致静脉闭塞，可能对后续实验产生不利影响，因为颈外静脉是大鼠出生后主要的颅部静脉回流通道¹⁴，而另一侧颈外静脉常需用于右心室压力测定^6,8,10。在本改良模型中，牺牲浅表腹壁静脉对机体影响极小。此外，该注射途径更接近临床PE情况，因为大多数栓子来源于下肢静脉。准确识别浅表腹壁动脉的位置对于实施小切口至关重要。浅表腹壁动脉的搏动通常可在腹股沟区皮肤表面触及，有助于血管定位。（3）可定制的栓子负荷：栓子负荷由血柱的直径和总长度决定。本研究所用的血栓生成装置可实现标准化及个性化栓子负荷的制备。研究人员可根据具体研究需求调整这些参数。在此模型中，所设定的栓子负荷可引发明显的症状和体征，但致死可能性较低。一般而言，若注入的血凝块长度少于10 cm，则操作相对安全。若出现呼吸暂停，应立即停止注射，实验人员应将手指置于动物胸壁的侧面和前侧，用手掌进行节律性胸部按压，动物呼吸功能可能因此恢复。（4）肺灌注及梗死区域的定量分析：本研究引入了详细的肺灌注技术，以更清晰地显示PE诱导后的肺梗死情况。在此基础上，建立了用于量化梗死面积的指标——梗死比（infarction ratio）。当前结果表明，该指标可能对栓子负荷及内在纤溶活性具有响应性，提示其在评估新型抗血栓疗法的研究中，可用于不同组别间的比较分析。

与肺栓塞（PE）建模相比，对肺栓塞的一种严重长期并发症——慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）进行建模更具挑战性，这主要是由于啮齿类动物体内具有较高的纤溶活性。潜在的解决方案包括重复栓塞以及给予氨甲环酸（TXA）——一种纤溶抑制剂^7,10,12,15。然而，静脉通路损伤以及TXA在血浆中的快速清除，仍使得CTEPH建模困难重重。本文所介绍的模型及配套的可视化方案，可能为建立一种可靠的CTEPH模型提供参考。

本研究的局限性也应予以说明。首先，该模型缺乏血流动力学测量数据，例如右心室压力和超声心动图检测。然而，这并不影响模型的有效性，因为该模型已通过病理学方法验证。研究人员可参考其他文献以获取有关血流动力学测量的详细方法¹⁶。其次，本肺栓塞模型未设置治疗组以评估药物反应，例如给予华法林或尿激酶，而这些实验可进一步证明该模型的应用价值。

综上所述，一种以微创方法为特征的改良型啮齿类动物肺栓塞模型已成功建立。本文还提供了用于量化梗死区域和可视化肺动脉树的方法。该模型有望用于解决有关肺栓塞并发症预防与治疗的关键科学问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分析天平	METTLER TOLEDO	MA55/A	无
分配针头	Jinrong electronics	无	19 G 和 18 G
精细剪刀	Stronger	XGJ1300	无
肝素钠盐	Solarbio	01-08-9041	140U/mg
异氟烷	RWD	R510-22-10	无
水杨酸甲酯	Macklin	M813577	分析纯，99%
微型夹钳	JZ	W40160	无
微型镊子	Stronger	XGN1310	无
硅胶浇铸化合物	Flow Tech	MV-130	无
Sprague-Dawley 大鼠	Vital River	SD-IGS	无
体视显微镜	Murzider	MSD204	无