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方法文章

从健康猪新鲜粪便中分离、纯化及鉴定产杆菌肽的Bacillus licheniformis

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DOI：

10.3791/66777

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2024年5月31日

 , 
1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University

本文内容

摘要

本方案详细描述了从健康猪粪便中分离、纯化和鉴定产杆菌肽的Bacillus licheniformis的完整且系统的过程。

摘要

Bacillus licheniformis 及杆菌肽在医药、化工、水产养殖、农业及农副产品等领域具有巨大的应用市场和价值。因此，选育高产杆菌肽的 B. licheniformis 具有重要意义。本实验方案从健康猪的新鲜粪便中分离、纯化并鉴定了高产杆菌肽的 Bacillus 菌株，同时检测了其次级代谢产物杆菌肽对 Micrococcus luteus 的抑制作用。采用薄层色谱法和高效液相色谱法对杆菌肽进行定性和定量检测。通过相关试剂盒测定 B. licheniformis 的生理生化特性。利用基因序列检测分析并构建 B. licheniformis 的系统发育关系。本方案从多个角度系统描述和介绍了从动物新鲜粪便中分离、纯化和鉴定 B. licheniformis 的标准化流程，为工厂化大规模利用 B. licheniformis 及杆菌肽提供了方法支持。

引言

Bacillus licheniformis 是厚壁菌门（Firmicutes）芽孢杆菌属（Bacillus）的一个物种，广泛分布于水体、土壤及动物肠道等多种环境中1。B. licheniformis 呈短粗杆状，独立运动2。菌落近圆形，表面 dull，中央隆起，边缘整齐，呈灰白色3。其生长与繁殖能力强，可吸收并利用多种碳源中的营养物质，如单糖、多糖、酮糖和有机酸4。在生长发育后期，B. licheniformis 可以休眠孢子形式存在，并产生杆菌肽、地衣素和表面活性素等抗菌物质，同时能够耐受营养缺乏和极端外界环境5。该菌无明显密码子偏好性，其高效的分泌系统决定了其异源蛋白分泌能力可达Bacillus subtilis的两倍6。常用于生产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等酶制剂7。由于不含内源性毒素，已被欧洲食品安全局（EFSA）认证为食品安全菌株，并列入合格推定安全（QPS）名单8。因此，B. licheniformis 在水产养殖、农业、食品、生物医学和制药工业中具有广泛的应用前景，尤其在生物活性化合物生产方面潜力巨大。此外，B. licheniformis 是动物肠道菌群的重要组成部分，可促进动物提高生产性能、改善肠道菌群平衡并预防疾病。B. licheniformis ATCC14580 的全基因组于2004年完成分析，其转录翻译、蛋白质折叠及分泌机制的背景信息已逐步明确9。这些遗传信息有利于在分子水平上进行遗传改造，从而推动B. licheniformis的大规模生产应用。

杆菌肽是一种由B. subtilis和B. licheniformis在次级代谢过程中通过非核糖体肽合成酶产生的十二环肽类抗生素。杆菌肽是由多种组分（如杆菌肽A、B和C）组成的混合物，各组分之间有一个或两个氨基酸的差异；其中，杆菌肽A的生物活性最强10。杆菌肽可通过抑制细胞壁的形成以及与膜结合蛋白相互作用，抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）和藤黄微球菌（Micrococcus luteus）等革兰氏阳性菌以及部分革兰氏阴性菌11。同时，杆菌肽具有安全性高、稳定性好、不易产生耐药性，并可与其他抗菌药物配伍使用等优点12。因此，杆菌肽被广泛应用于医学和兽医临床。此外，由于其消除速度快、吸收率低，还可作为动物饲料添加剂使用13。

B. licheniformis 能够定植于肠道并改善胃肠道微环境。不同来源的芽孢杆菌在不同动物胃肠道中的黏附与繁殖能力及相关生理功能存在差异。猪源性B. licheniformis更有利于在猪及其他家畜肠道内定植。肠道益生菌的相对丰度与宿主健康状况密切相关14。在断奶仔猪日粮中补充B. licheniformis混合制剂可通过改变菌群组成和代谢活性来改善肠道生态系统，同时也影响肠道黏膜15。动物粪便可反映其肠道菌群的种类和数量。本方案描述了从健康猪粪便中分离和纯化产杆菌肽的芽孢杆菌（Bacillus spp.）的方法。粪便样本来源于未饲喂配合饲料、且在猪场中表现出优良生产性能的太湖母猪。通过形态学特征、理化性质及生化鉴定，将分离菌株鉴定为B. licheniformis。

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方案

所有实验程序均经南京工业大学伦理委员会记录并批准。粪便样品来源于约2年龄的太湖母猪（见材料表），这些母猪饲养于专业且标准化的养猪场。

1. 培养基的制备

  1. LB 液体培养基：取 10 g NaCl、5 g 酵母提取物粉末和 10 g 胰蛋白胨加入锥形瓶中，加入蒸馏水至 1 L，用玻璃棒搅拌并溶解。将 100 mL 培养基转移至 500 mL 锥形瓶中，并用透气封口膜 tightly 封口。在高压灭菌锅中于 121 °C 灭菌 20 min（参见 材料表）。
  2. LB 固体培养基：取 10 g NaCl、5 g 酵母提取物粉末、10 g 胰蛋白胨和 20 g 琼脂粉加入锥形瓶中，加蒸馏水至 1 L，用玻璃棒搅拌溶解后，用透气封口膜 tightly 封口。在高压灭菌锅中于 121 °C 灭菌 20 min。当培养基冷却至 50 °C 时，向每个培养皿中倒入 20 mL 培养基，待其冷却凝固后倒置存放。
  3. 杆菌肽发酵培养基：取 8 g 豆粕、4 g 可溶性淀粉、0.1 g (NH4)2SO4、0.6 g CaCO3 和 100 mL 蒸馏水加入 500 mL 锥形瓶中，用玻璃棒搅拌至充分溶解，并用透气封口膜 tightly 封口。在高压灭菌锅中于 121 °C 灭菌 20 min（参见 材料表）。
  4. M. luteus 菌悬液：挑取一环 M. luteus 接种于步骤 1.2 制备的 LB 培养平板上（参见 材料表）。在 37 °C 恒温培养箱中培养 16 h（参见 材料表）。向平板中加入 5 mL 生理盐水，轻轻振荡以洗脱菌落。测定 OD600，并在试管中稀释，获得 OD600 为 0.3–0.7 的菌悬液。将 M. luteus 菌悬液于 4 °C 保存备用。
  5. 抑菌活性检测培养基：取步骤 1.4 制备的 M. luteus 菌悬液 1 mL，加入步骤 1.2 制备的 100 mL 液体 LB 固体培养基中，轻微振荡混匀。立即取 5 mL 含 M. luteus 的混合液，均匀涂布于 LB 培养平板上。

2. 从健康猪的新鲜粪便中分离和纯化 Bacillus

  1. 取9 mL生理盐水和1.0 g新鲜猪粪便，加入150 mL锥形瓶中。在室温下用磁力搅拌器（见材料表）以60 rpm/min的速度搅拌15分钟。
  2. 将粪便提取物置于80 °C恒温水浴箱（见材料表）中加热20分钟，以杀死非产孢细菌。
  3. 将上述悬液加入装有100 mL LB液体培养基的250 mL锥形瓶中，在37 °C、180 rpm/min条件下于摇床（见材料表）中培养8小时。
  4. 用生理盐水对培养后的菌液进行梯度稀释，稀释度从10-1至10-8。分别取0.1 mL的10-6、10-7和10-8稀释液涂布于LB固体培养平板，待其干燥。10分钟后，将平板倒置放入37 °C恒温培养箱中培养48小时。
  5. 用接种环挑取形态类似B. licheniformis的菌落（乳白色、质地柔软、黏液状、隆起且扁平、边缘不规则）16，并在步骤1.5中制备的抗菌活性检测培养基上以锯齿形划线法进行划线分离（见图1）。
  6. 将平板置于37 °C培养箱中培养48小时，观察菌落周围是否出现抑菌圈。

3. 筛选对 M. luteus 活性的抑制作用

  1. 挑选产生抑菌圈的单个菌落，接种于100 mL LB液体培养基中，37 °C、180 rpm/min摇床培养12 h。
  2. 取5 mL上述培养物接种于步骤1.3中制备的杆菌肽发酵培养基中，37 °C培养48 h。
  3. 将发酵液收集至离心管中，于4 °C、13,400 x g 离心15 min，随后使用0.22 µm微孔滤膜过滤（参见材料表）。
  4. 在新鲜的抗菌活性检测培养基平板上放置牛津杯，向其中加入50 µL滤液（发酵上清液）（参见材料表）。37 °C培养箱中培养12 h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径（参见材料表）。
  5. 选取抑菌圈直径大于15 mm的菌株及其对应的发酵上清液，用于后续实验。

4. 通过薄层色谱法鉴定杆菌肽

  1. 取60 mg杆菌肽标准品，加入1% EDTA-2Na（见材料表）溶解于10 mL容量瓶中，配制成6.0 mg/mL的杆菌肽溶液。
  2. 取1 mL发酵上清液，用1% EDTA-2Na稀释至10 mL。在活化的硅胶薄层板（见材料表）上分别点样5 µL样品和5 µL杆菌肽标准溶液。
  3. 向层析缸中加入100 mL正丁醇-乙酸-水-吡啶-乙醇（60:15:10:6:5）展开剂（见材料表），将硅胶薄层板放入层析缸中，盖上盖子，在室温下展开30分钟。
  4. 取出硅胶薄层板，喷洒含1%茚三酮的正丁醇-吡啶溶液（99:1）（见材料表），于105 °C加热5分钟，直至出现棕红色斑点。按以下公式计算标准品与样品的Rf 值（比移值）：
    Rf = 斑点迁移距离 / 溶剂迁移距离。

5. 采用高效液相色谱法检测杆菌肽

  1. 取0.3 mL发酵上清液和1.2 mL 50%乙醇加入2 mL微量离心管中，手动振荡5分钟，于4 °C静置12小时。
  2. 在13,400 x g条件下离心15分钟，用0.22 µm微孔滤膜过滤至标记为S1的样品瓶中（见材料表）。
  3. 制备杆菌肽母液：称取0.4 g杆菌肽标准品（60 U/mg；见材料表），加入100 mL 40 g/L EDTA-2Na溶液（见材料表），定容至100 mL容量瓶中，配制成240 U/mL的杆菌肽母液。
  4. 分别向标记为A1、B1、C1、D1和E1的试管中加入3 mL杆菌肽母液以及21、9、3、1和0 mL超纯水。使用0.22 µm微孔滤膜过滤后，将滤液转移至标记为A2、B2、C2、D2和E2的样品瓶中。
    注：杆菌肽标准溶液的浓度分别为30、60、120、180和240 U/mL。
  5. 将A2、B2、C2、D2、E2和S1样品放入高效液相色谱仪的样品盘中。在流动相托盘中分别放置1000 mL 50 mM/L甲酸铵溶液和1000 mL乙腈，并分别设为流动相A和B。
    注：应用甲酸将甲酸铵溶液的pH值调节至4.0。
  6. 按照色谱柱上标注的方向安装C18（5 µm，4.6 mm x 250 mm）高效液相色谱柱（见材料表）。
  7. 设置流动相梯度程序：0分钟时为77% A和23% B；30分钟时为70% A和30% B；40分钟时为60% A和40% B；50分钟时为60% A和40% B；51分钟时为77% A和23% B；58分钟时为77% A和23% B。进样量设为100 µL；流速为1.0 mL/min；柱温为30 °C。
  8. 点击运行按钮执行程序。

6. 形态学鉴定

  1. 将产杆菌肽效价最高的菌株稀释后涂布于LB培养平板上，于37 °C培养箱中培养48 h。按以下方法染色并观察菌落形态。
  2. 在载玻片上滴加一滴无菌纯化水，挑取少量菌落，加入水滴中，均匀涂布，自然晾干后通过火焰固定。
  3. 加入结晶紫染色1 min，然后用自来水冲洗；再加入碘液染色1 min，随后用蒸馏水冲洗。
  4. 加入95%乙醇，轻轻晃动载玻片脱色1 min，然后用蒸馏水冲洗。
  5. 加入沙黄染色1 min，然后用蒸馏水冲洗。自然晾干后，使用油镜（见材料表）在显微镜下观察菌落形态。

7. 生理学与生物化学鉴定

  1. 向试管中加入 2 mL 无菌生理盐水，使用接种环从平板上挑取单个菌落接种到无菌生理盐水中，制备细菌悬液。
  2. 取 100 µL 细菌悬液，分别加入 Bacillus 生化鉴定条的 V-P、柠檬酸盐、明胶、7% 氯化钠、pH 5.7、硝酸盐还原和淀粉水解各孔中（参见材料表）。
  3. 使用接种环挑取另一个单菌落，在 Bacillus 生化鉴定条的厌氧生长生化管上以“之”字形划线接种。
  4. 使用接种环挑取其他菌落，垂直穿刺接种至 Bacillus 生化鉴定条上用于丙酸盐、D-木糖、L-阿拉伯糖和 D-甘露醇鉴定的各孔中。

8. 菌株基因序列的测定

  1. 使用细菌DNA提取试剂盒（参见材料表）提取菌株DNA：将2 mL种子液加入5 mL微量离心管中，在11,500 × g 条件下离心1分钟。弃去上清液，在沉淀中加入110 µL缓冲液（含20 mM Tris，pH 8.0；2 mM Na2-EDTA和1.2% Triton）以及70 µL 50 mg/mL溶菌酶溶液，37 °C孵育30分钟。
  2. 加入4 µL 100 mg/mL RNase A，振荡15秒，室温静置5分钟。加入20 µL蛋白酶K溶液，充分混匀。
  3. 加入220 µL GB缓冲液，振荡15秒直至沉淀悬浮，70 °C放置10分钟使溶液变澄清，短暂离心以去除管壁上的液滴。
  4. 加入220 µL无水乙醇，充分震荡15秒，短暂离心分离。将溶液及絮状沉淀转移至收集管中的CB3吸附柱中，在13,400 × g 条件下离心30秒，弃去上清液。
  5. 向吸附柱中加入500 µL GD缓冲液，在13,400 × g 条件下离心30秒，弃去上清液。向柱中加入600 µL PW缓冲液，在13,400 × g 条件下离心30秒，弃去上清液。
  6. 将吸附柱重新放入收集管中，在13,400 × g 条件下离心2分钟，弃去上清液。
  7. 将吸附柱于室温放置10分钟以干燥。将柱转移至离心管中，向吸附膜中央加入100 µL洗脱缓冲液TE。
  8. 室温静置5分钟，使洗脱液流穿至离心管中，然后在13,400 × g 条件下离心2分钟。
  9. 在0.1 mL PCR管中加入25 µL 2×主混合液（参见材料表）、8.8步骤获得的2.5 µL DNA样品、2 µL 27F正向引物、2 µL 1492R反向引物以及18.5 µL双蒸H2O。
    注：引物的基因序列为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
  10. 将PCR管放入PCR仪（参见材料表）中，按以下条件运行：95 °C预变性10分钟，95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸90秒，72 °C最终延伸7分钟。变性、退火和延伸三步循环重复32次。
  11. 取5 µL PCR产物，在120 V电压下进行1%琼脂糖凝胶电泳30分钟。
    1. 将500 mg琼脂糖溶于50 mL 1×TAE缓冲液中，微波炉加热1–2分钟至琼脂糖完全溶解。加入5 µL DNA染色染料，倒入胶板并插入梳子。室温静置30分钟至凝固；将凝胶放入电泳槽中，并加入1×TAE缓冲液至浸没凝胶。在第一孔中加入2 µL 2 kb DNA Marker（10 mg/µL），其余孔中加入5 µL PCR产物与1 µL上样染料的混合液。
  12. 将凝胶放入凝胶成像系统中拍照。在紫外光下迅速切下DNA条带并称重。
  13. 将切下的凝胶条带放入微量离心管中，加入等体积PN溶液。将管置于50 °C水浴中，直至凝胶完全溶解。
  14. 向吸附柱CA2中加入500 µL平衡液BL，在13,400 × g 条件下离心1分钟，弃去上清液。
  15. 将溶解后的凝胶溶液加入吸附柱CA2中，室温放置2分钟，在13,400 × g 条件下离心30秒，弃去上清液。
  16. 向吸附柱CA2中加入600 µL PW缓冲液，在13,400 × g 条件下离心1分钟，弃去上清液，重复一次。
  17. 将吸附柱CA2放入收集管中，在13,400 × g 条件下离心2分钟，弃去上清液。
  18. 将吸附柱CA2于室温放置10分钟以彻底干燥，然后转移至洁净的离心管中。
  19. 向吸附膜中加入50 µL洗脱缓冲液EB，室温静置2分钟，然后在13,400 × g 条件下离心2分钟以收集DNA溶液。
    注：上述溶液或试剂均包含在纯化试剂盒中（参见材料表）。
    1. 将收集的DNA溶液送至专业测序公司（参见材料表）进行测序。通过NCBI GenBank数据库中的Blast工具比对测序结果。根据序列同源性，选取不同菌株，并利用MEGA-X软件中的最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统发育树，以确定菌株间的物种关系。

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结果

本实验从健康猪的新鲜粪便中分离出48株Bacillus，编号为1001至1048。其中，15株对M. luteus具有抗菌活性。对这15株菌株采用高效液相色谱法测定其杆菌肽效价，结果如表1所示。B. licheniformis No. 1026的杆菌肽效价最高，为456.35 ± 21.75 U/mL，因此选择No. 1026用于后续实验。

薄层色谱（TLC）的鉴定结果如图2A所示。菌株1026发酵液与杆菌肽标准品的主要斑点位置相同，Rf值为0.61。高效液相色谱（HPLC）分析中，杆菌肽的标准曲线方程为 y = 50.287x - 250.55，相关系数 R2 = 0.9968（图2B）。发酵上清液的出峰时间与杆菌肽标准品一致（图2C），因此确定该抑菌物质...

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讨论

B. licheniformis 在简单的培养条件下生长迅速且糖消耗快，成熟的发酵技术有助于降低工业生产成本13. 该技术的广泛应用 B. licheniformis 及其分泌物杆菌肽已显示出巨大的市场价值。在农业中， B. licheniformis 用作生物肥料，通过提高土壤肥力、促进根系发育以及协助有机物降解，从而改善植物生长和养分吸收15用于工业酶的生产， B. licheniformis 可产生多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶，这决定了其在食品加工、洗涤剂制造、皮革处理和纺织工业中不可替代的市场价值16鉴于其优异的抗菌药理活性 B. licheniformis 以及杆菌肽，已在医学领域用于治疗由细菌和真菌引起的各种感染性疾病1同时，考虑到药用植物的生长以及植物中药理活性成分的积累， B. licheniformis 是一种...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家重点研发计划（编号：2022YFC2104800）和江苏省“六大人才高峰”项目（编号：2019-NY-058）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 × Phanta Flash Master Mix中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国P252-01
2kb DNA Marker中国北京博奥生物技术有限公司，中国北京BM121-01
乙腈中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海A104443
琼脂粉中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海A800730
琼脂糖中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国上海A104062
硫酸铵 ((NH₄)₂SO₄)4)2SO4)中国上海，国药集团化学试剂有限公司10002917
高压灭菌器中国厦门，泽瓦仪器有限公司GI36DWS
芽孢杆菌生化鉴定条中国青岛海博生物技术有限公司，中国青岛HBIG14
杆菌肽中国上海，上海源叶生物科技有限公司B65740
细菌DNA提取试剂盒中国北京，天根生化科技有限公司DP209
透气封膜北京雷博润生物科技有限公司BS-QM-01A
丁醇中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海B433378
C18 (5 μ米，4.6 × 250 mm）HPLC 柱中国日照科普诺新材料有限公司，日照，中国C1805-462510
碳酸钙（CaCO₃）3)中国上海，国药集团化学试剂有限公司10005717
离心New Brunswick Scientific Co., Inc.，英国5452
色谱缸 中国南京腾辉实验技术有限公司，中国南京P-1
锥形瓶四川树博  有限公司，中国成都18012
恒温培养箱中国天津，Taist Instrument Co., Ltd.GH4500
磷酸氢二钾（K₂HPO₄）2HPO4)中国广东，西龙化工有限公司XL0015
EDTA-2Na中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海E397526
电子天平Mettler Toledo International Co., Ltd.FA2104
乙醇中国上海阿拉丁生化科技有限公司，上海，中国E130059
Gel Midi 纯化试剂盒中国北京，天根生化科技有限公司DP302
玻璃棒成都一邦科析仪器有限公司1294
葡萄糖中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海D823520
革兰染色液试剂盒中国青岛海博生物技术有限公司，中国青岛HB8278
高效液相色谱仪美国加利福尼亚州，安捷伦科技有限公司1260
水平电泳装置中国北京，北京六一生物科技有限公司DYCP-31DN BIOMATE
接种环中国上海，上海慕晨生物科技有限公司3171026
磁力搅拌器Wiggens GmbH Co., Ltd.，德国WH220 PLUS
甲醇中国上海阿拉丁生化科技有限公司，上海，中国M116115
微量离心管中国上海，上海慕晨生物科技有限公司1351171
Micrococcus luteus中国苏州贝那生物样本库BNCC102589
微孔滤膜南通苏尔实验设备有限公司PES0.22
茚三酮中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海N105629
光学显微镜中国上海光学仪器厂DYS-108
猪粪便中国南京全福养猪场
聚合酶链式反应（PCR）扩增仪中国苏州，苏州东升兴业科学仪器有限公司ETC811
专业测序公司中国安徽安徽通用生物有限公司，中国安徽
吡啶中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海P111516
摇床中国太仓启朗实验设备有限公司，中国太仓HYL-C
硅胶GF254薄层板中国烟台华阳新材料有限公司，中国烟台HPT-HSGF5025023
氯化钠（NaCl）中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海S805275
柠檬酸钠中国上海，国药集团化学试剂有限公司C39197100001
可溶性淀粉中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海S817547
恒温水浴锅中国上海，上海和恒仪器设备有限公司DK-8D
胰蛋白胨中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海T139519
Ultra GelRed中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国GR501-01
超纯水仪德国默克集团有限公司Milli Direct-Q8
超声波清洗机中国江苏华冠电器集团有限公司，中国江苏SB-100DT
游标卡尺 日本三丰公司N20P
酵母提取物粉末中国北京，维科生物技术有限公司LP0021

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