从健康猪新鲜粪便中分离、纯化及鉴定产杆菌肽的Bacillus licheniformis

摘要

本方案详细描述了从健康猪粪便中分离、纯化和鉴定产杆菌肽的Bacillus licheniformis的完整且系统的过程。

摘要

Bacillus licheniformis 及杆菌肽在医药、化工、水产养殖、农业及农副产品等领域具有巨大的应用市场和价值。因此，选育高产杆菌肽的 B. licheniformis 具有重要意义。本实验方案从健康猪的新鲜粪便中分离、纯化并鉴定了高产杆菌肽的 Bacillus 菌株，同时检测了其次级代谢产物杆菌肽对 Micrococcus luteus 的抑制作用。采用薄层色谱法和高效液相色谱法对杆菌肽进行定性和定量检测。通过相关试剂盒测定 B. licheniformis 的生理生化特性。利用基因序列检测分析并构建 B. licheniformis 的系统发育关系。本方案从多个角度系统描述和介绍了从动物新鲜粪便中分离、纯化和鉴定 B. licheniformis 的标准化流程，为工厂化大规模利用 B. licheniformis 及杆菌肽提供了方法支持。

引言

Bacillus licheniformis 是厚壁菌门（Firmicutes）芽孢杆菌属（Bacillus）的一个物种，广泛分布于水体、土壤及动物肠道等多种环境中¹。B. licheniformis 呈短粗杆状，独立运动²。菌落近圆形，表面 dull，中央隆起，边缘整齐，呈灰白色³。其生长与繁殖能力强，可吸收并利用多种碳源中的营养物质，如单糖、多糖、酮糖和有机酸⁴。在生长发育后期，B. licheniformis 可以休眠孢子形式存在，并产生杆菌肽、地衣素和表面活性素等抗菌物质，同时能够耐受营养缺乏和极端外界环境⁵。该菌无明显密码子偏好性，其高效的分泌系统决定了其异源蛋白分泌能力可达Bacillus subtilis的两倍⁶。常用于生产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等酶制剂⁷。由于不含内源性毒素，已被欧洲食品安全局（EFSA）认证为食品安全菌株，并列入合格推定安全（QPS）名单⁸。因此，B. licheniformis 在水产养殖、农....

方案

所有实验程序均经南京工业大学伦理委员会记录并批准。粪便样品来源于约2年龄的太湖母猪（见材料表），这些母猪饲养于专业且标准化的养猪场。

1. 培养基的制备

1. LB 液体培养基：取 10 g NaCl、5 g 酵母提取物粉末和 10 g 胰蛋白胨加入锥形瓶中，加入蒸馏水至 1 L，用玻璃棒搅拌并溶解。将 100 mL 培养基转移至 500 mL 锥形瓶中，并用透气封口膜 tightly 封口。在高压灭菌锅中于 121 °C 灭菌 20 min（参见 材料表）。
2. LB 固体培养基：取 10 g NaCl、5 g 酵母提取物粉末、10 g 胰蛋白胨和 20 g 琼脂粉加入锥形瓶中，加蒸馏水至 1 L，用玻璃棒搅拌溶解后，用透气封口膜 tightly 封口。在高压灭菌锅中于 121 °C 灭菌 20 min。当培养基冷却至 50 °C 时，向每个培养皿中倒入 20 mL 培养基，待其冷却凝固后倒置存放。
3. 杆菌肽发酵培养基：取 8 g 豆粕、4 g 可溶性淀粉、0.1 g (NH₄)₂SO₄、0.6 g CaCO₃ 和 100 mL 蒸馏水加入 500 mL 锥形瓶中，用玻璃棒搅拌至充分溶解，并用透气封口膜 tightly 封口。在高压灭菌....

结果

本实验从健康猪的新鲜粪便中分离出48株Bacillus，编号为1001至1048。其中，15株对M. luteus具有抗菌活性。对这15株菌株采用高效液相色谱法测定其杆菌肽效价，结果如表1所示。B. licheniformis No. 1026的杆菌肽效价最高，为456.35 ± 21.75 U/mL，因此选择No. 1026用于后续实验。

薄层色谱（TLC）的鉴定结果如图2A所示。菌株1026发酵液与杆菌肽标准品的主要斑点位置相同，R_f值为0.61。高效液相色谱（HPLC）分析中，杆菌肽的标准曲线方程为 y = 50.287x - 250.55，相关系数 R² = 0.9968（图2B）。发酵上清液的出峰时间与杆菌肽标准品一致（图2C），因此确定该抑菌物质.......

讨论

B. licheniformis 在简单的培养条件下生长迅速且糖消耗快，成熟的发酵技术有助于降低工业生产成本¹³. 该技术的广泛应用 B. licheniformis 及其分泌物杆菌肽已显示出巨大的市场价值。在农业中， B. licheniformis 用作生物肥料，通过提高土壤肥力、促进根系发育以及协助有机物降解，从而改善植物生长和养分吸收¹⁵用于工业酶的生产， B. licheniformis 可产生多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶，这决定了其在食品加工、洗涤剂制造、皮革处理和纺织工业中不可替代的市场价值¹⁶鉴于其优异的抗菌药理活性 B. licheniformis 以及杆菌肽，已在医学领域用于治疗由细菌和真菌引起的各种感染性疾病¹同时，考虑到药用植物的生长以及植物中药理活性成分的积累， B. licheniformis 是一种.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 × Phanta Flash Master Mix	中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国	P252-01
2kb DNA Marker	中国北京博奥生物技术有限公司，中国北京	BM121-01
乙腈	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海	A104443
琼脂粉	中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海	A800730
琼脂糖	中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国上海	A104062
硫酸铵 ((NH₄)₂SO₄)4)2SO4)	中国上海，国药集团化学试剂有限公司	10002917
高压灭菌器	中国厦门，泽瓦仪器有限公司	GI36DWS
芽孢杆菌生化鉴定条	中国青岛海博生物技术有限公司，中国青岛	HBIG14
杆菌肽	中国上海，上海源叶生物科技有限公司	B65740
细菌DNA提取试剂盒	中国北京，天根生化科技有限公司	DP209
透气封膜	北京雷博润生物科技有限公司	BS-QM-01A
丁醇	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海	B433378
C18 (5 μ米，4.6 × 250 mm）HPLC 柱	中国日照科普诺新材料有限公司，日照，中国	C1805-462510
碳酸钙（CaCO₃）3)	中国上海，国药集团化学试剂有限公司	10005717
离心	New Brunswick Scientific Co., Inc.，英国	5452
色谱缸	中国南京腾辉实验技术有限公司，中国南京	P-1
锥形瓶	四川树博  有限公司，中国成都	18012
恒温培养箱	中国天津，Taist Instrument Co., Ltd.	GH4500
磷酸氢二钾（K₂HPO₄）2HPO4)	中国广东，西龙化工有限公司	XL0015
EDTA-2Na	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海	E397526
电子天平	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
乙醇	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，上海，中国	E130059
Gel Midi 纯化试剂盒	中国北京，天根生化科技有限公司	DP302
玻璃棒	成都一邦科析仪器有限公司	1294
葡萄糖	中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海	D823520
革兰染色液试剂盒	中国青岛海博生物技术有限公司，中国青岛	HB8278
高效液相色谱仪	美国加利福尼亚州，安捷伦科技有限公司	1260
水平电泳装置	中国北京，北京六一生物科技有限公司	DYCP-31DN BIOMATE
接种环	中国上海，上海慕晨生物科技有限公司	3171026
磁力搅拌器	Wiggens GmbH Co., Ltd.，德国	WH220 PLUS
甲醇	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，上海，中国	M116115
微量离心管	中国上海，上海慕晨生物科技有限公司	1351171
Micrococcus luteus	中国苏州贝那生物样本库	BNCC102589
微孔滤膜	南通苏尔实验设备有限公司	PES0.22
茚三酮	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海	N105629
光学显微镜	中国上海光学仪器厂	DYS-108
猪粪便	中国南京全福养猪场
聚合酶链式反应（PCR）扩增仪	中国苏州，苏州东升兴业科学仪器有限公司	ETC811
专业测序公司	中国安徽安徽通用生物有限公司，中国安徽
吡啶	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海	P111516
摇床	中国太仓启朗实验设备有限公司，中国太仓	HYL-C
硅胶GF254薄层板	中国烟台华阳新材料有限公司，中国烟台	HPT-HSGF5025023
氯化钠（NaCl）	中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海	S805275
柠檬酸钠	中国上海，国药集团化学试剂有限公司	C39197100001
可溶性淀粉	中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海	S817547
恒温水浴锅	中国上海，上海和恒仪器设备有限公司	DK-8D
胰蛋白胨	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海	T139519
Ultra GelRed	中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国	GR501-01
超纯水仪	德国默克集团有限公司	Milli Direct-Q8
超声波清洗机	中国江苏华冠电器集团有限公司，中国江苏	SB-100DT
游标卡尺	日本三丰公司	N20P
酵母提取物粉末	中国北京，维科生物技术有限公司	LP0021