从健康猪新鲜粪便中分离、纯化及鉴定产杆菌肽的Bacillus licheniformis

摘要

本方案详细描述了从健康猪粪便中分离、纯化和鉴定产杆菌肽的Bacillus licheniformis的完整且系统的过程。

摘要

Bacillus licheniformis 及杆菌肽在医药、化工、水产养殖、农业及农副产品等领域具有巨大的应用市场和价值。因此，选育高产杆菌肽的 B. licheniformis 具有重要意义。本实验方案从健康猪的新鲜粪便中分离、纯化并鉴定了高产杆菌肽的 Bacillus 菌株，同时检测了其次级代谢产物杆菌肽对 Micrococcus luteus 的抑制作用。采用薄层色谱法和高效液相色谱法对杆菌肽进行定性和定量检测。通过相关试剂盒测定 B. licheniformis 的生理生化特性。利用基因序列检测分析并构建 B. licheniformis 的系统发育关系。本方案从多个角度系统描述和介绍了从动物新鲜粪便中分离、纯化和鉴定 B. licheniformis 的标准化流程，为工厂化大规模利用 B. licheniformis 及杆菌肽提供了方法支持。

引言

Bacillus licheniformis 是厚壁菌门（Firmicutes）芽孢杆菌属（Bacillus）的一个物种，广泛分布于水体、土壤及动物肠道等多种环境中¹。B. licheniformis 呈短粗杆状，独立运动²。菌落近圆形，表面 dull，中央隆起，边缘整齐，呈灰白色³。其生长与繁殖能力强，可吸收并利用多种碳源中的营养物质，如单糖、多糖、酮糖和有机酸⁴。在生长发育后期，B. licheniformis 可以休眠孢子形式存在，并产生杆菌肽、地衣素和表面活性素等抗菌物质，同时能够耐受营养缺乏和极端外界环境⁵。该菌无明显密码子偏好性，其高效的分泌系统决定了其异源蛋白分泌能力可达Bacillus subtilis的两倍⁶。常用于生产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等酶制剂⁷。由于不含内源性毒素，已被欧洲食品安全局（EFSA）认证为食品安全菌株，并列入合格推定安全（QPS）名单⁸。因此，B. licheniformis 在水产养殖、农业、食品、生物医学和制药工业中具有广泛的应用前景，尤其在生物活性化合物生产方面潜力巨大。此外，B. licheniformis 是动物肠道菌群的重要组成部分，可促进动物提高生产性能、改善肠道菌群平衡并预防疾病。B. licheniformis ATCC14580 的全基因组于2004年完成分析，其转录翻译、蛋白质折叠及分泌机制的背景信息已逐步明确⁹。这些遗传信息有利于在分子水平上进行遗传改造，从而推动B. licheniformis的大规模生产应用。

杆菌肽是一种由B. subtilis和B. licheniformis在次级代谢过程中通过非核糖体肽合成酶产生的十二环肽类抗生素。杆菌肽是由多种组分（如杆菌肽A、B和C）组成的混合物，各组分之间有一个或两个氨基酸的差异；其中，杆菌肽A的生物活性最强¹⁰。杆菌肽可通过抑制细胞壁的形成以及与膜结合蛋白相互作用，抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）和藤黄微球菌（Micrococcus luteus）等革兰氏阳性菌以及部分革兰氏阴性菌¹¹。同时，杆菌肽具有安全性高、稳定性好、不易产生耐药性，并可与其他抗菌药物配伍使用等优点¹²。因此，杆菌肽被广泛应用于医学和兽医临床。此外，由于其消除速度快、吸收率低，还可作为动物饲料添加剂使用¹³。

B. licheniformis 能够定植于肠道并改善胃肠道微环境。不同来源的芽孢杆菌在不同动物胃肠道中的黏附与繁殖能力及相关生理功能存在差异。猪源性B. licheniformis更有利于在猪及其他家畜肠道内定植。肠道益生菌的相对丰度与宿主健康状况密切相关¹⁴。在断奶仔猪日粮中补充B. licheniformis混合制剂可通过改变菌群组成和代谢活性来改善肠道生态系统，同时也影响肠道黏膜¹⁵。动物粪便可反映其肠道菌群的种类和数量。本方案描述了从健康猪粪便中分离和纯化产杆菌肽的芽孢杆菌（Bacillus spp.）的方法。粪便样本来源于未饲喂配合饲料、且在猪场中表现出优良生产性能的太湖母猪。通过形态学特征、理化性质及生化鉴定，将分离菌株鉴定为B. licheniformis。

方案

所有实验程序均经南京工业大学伦理委员会记录并批准。粪便样品来源于约2年龄的太湖母猪（见材料表），这些母猪饲养于专业且标准化的养猪场。

1. 培养基的制备

1. LB 液体培养基：取 10 g NaCl、5 g 酵母提取物粉末和 10 g 胰蛋白胨加入锥形瓶中，加入蒸馏水至 1 L，用玻璃棒搅拌并溶解。将 100 mL 培养基转移至 500 mL 锥形瓶中，并用透气封口膜 tightly 封口。在高压灭菌锅中于 121 °C 灭菌 20 min（参见 材料表）。
2. LB 固体培养基：取 10 g NaCl、5 g 酵母提取物粉末、10 g 胰蛋白胨和 20 g 琼脂粉加入锥形瓶中，加蒸馏水至 1 L，用玻璃棒搅拌溶解后，用透气封口膜 tightly 封口。在高压灭菌锅中于 121 °C 灭菌 20 min。当培养基冷却至 50 °C 时，向每个培养皿中倒入 20 mL 培养基，待其冷却凝固后倒置存放。
3. 杆菌肽发酵培养基：取 8 g 豆粕、4 g 可溶性淀粉、0.1 g (NH₄)₂SO₄、0.6 g CaCO₃ 和 100 mL 蒸馏水加入 500 mL 锥形瓶中，用玻璃棒搅拌至充分溶解，并用透气封口膜 tightly 封口。在高压灭菌锅中于 121 °C 灭菌 20 min（参见 材料表）。
4. M. luteus 菌悬液：挑取一环 M. luteus 接种于步骤 1.2 制备的 LB 培养平板上（参见 材料表）。在 37 °C 恒温培养箱中培养 16 h（参见 材料表）。向平板中加入 5 mL 生理盐水，轻轻振荡以洗脱菌落。测定 OD600，并在试管中稀释，获得 OD600 为 0.3–0.7 的菌悬液。将 M. luteus 菌悬液于 4 °C 保存备用。
5. 抑菌活性检测培养基：取步骤 1.4 制备的 M. luteus 菌悬液 1 mL，加入步骤 1.2 制备的 100 mL 液体 LB 固体培养基中，轻微振荡混匀。立即取 5 mL 含 M. luteus 的混合液，均匀涂布于 LB 培养平板上。

2. 从健康猪的新鲜粪便中分离和纯化 Bacillus

1. 取9 mL生理盐水和1.0 g新鲜猪粪便，加入150 mL锥形瓶中。在室温下用磁力搅拌器（见材料表）以60 rpm/min的速度搅拌15分钟。
2. 将粪便提取物置于80 °C恒温水浴箱（见材料表）中加热20分钟，以杀死非产孢细菌。
3. 将上述悬液加入装有100 mL LB液体培养基的250 mL锥形瓶中，在37 °C、180 rpm/min条件下于摇床（见材料表）中培养8小时。
4. 用生理盐水对培养后的菌液进行梯度稀释，稀释度从10^-1至10^-8。分别取0.1 mL的10^-6、10^-7和10^-8稀释液涂布于LB固体培养平板，待其干燥。10分钟后，将平板倒置放入37 °C恒温培养箱中培养48小时。
5. 用接种环挑取形态类似B. licheniformis的菌落（乳白色、质地柔软、黏液状、隆起且扁平、边缘不规则）¹⁶，并在步骤1.5中制备的抗菌活性检测培养基上以锯齿形划线法进行划线分离（见图1）。
6. 将平板置于37 °C培养箱中培养48小时，观察菌落周围是否出现抑菌圈。

3. 筛选对 M. luteus 活性的抑制作用

1. 挑选产生抑菌圈的单个菌落，接种于100 mL LB液体培养基中，37 °C、180 rpm/min摇床培养12 h。
2. 取5 mL上述培养物接种于步骤1.3中制备的杆菌肽发酵培养基中，37 °C培养48 h。
3. 将发酵液收集至离心管中，于4 °C、13,400 x g 离心15 min，随后使用0.22 µm微孔滤膜过滤（参见材料表）。
4. 在新鲜的抗菌活性检测培养基平板上放置牛津杯，向其中加入50 µL滤液（发酵上清液）（参见材料表）。37 °C培养箱中培养12 h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径（参见材料表）。
5. 选取抑菌圈直径大于15 mm的菌株及其对应的发酵上清液，用于后续实验。

4. 通过薄层色谱法鉴定杆菌肽

1. 取60 mg杆菌肽标准品，加入1% EDTA-2Na（见材料表）溶解于10 mL容量瓶中，配制成6.0 mg/mL的杆菌肽溶液。
2. 取1 mL发酵上清液，用1% EDTA-2Na稀释至10 mL。在活化的硅胶薄层板（见材料表）上分别点样5 µL样品和5 µL杆菌肽标准溶液。
3. 向层析缸中加入100 mL正丁醇-乙酸-水-吡啶-乙醇（60:15:10:6:5）展开剂（见材料表），将硅胶薄层板放入层析缸中，盖上盖子，在室温下展开30分钟。
4. 取出硅胶薄层板，喷洒含1%茚三酮的正丁醇-吡啶溶液（99:1）（见材料表），于105 °C加热5分钟，直至出现棕红色斑点。按以下公式计算标准品与样品的R_f 值（比移值）：
   R_f = 斑点迁移距离 / 溶剂迁移距离。

5. 采用高效液相色谱法检测杆菌肽

1. 取0.3 mL发酵上清液和1.2 mL 50%乙醇加入2 mL微量离心管中，手动振荡5分钟，于4 °C静置12小时。
2. 在13,400 x g条件下离心15分钟，用0.22 µm微孔滤膜过滤至标记为S1的样品瓶中（见材料表）。
3. 制备杆菌肽母液：称取0.4 g杆菌肽标准品（60 U/mg；见材料表），加入100 mL 40 g/L EDTA-2Na溶液（见材料表），定容至100 mL容量瓶中，配制成240 U/mL的杆菌肽母液。
4. 分别向标记为A1、B1、C1、D1和E1的试管中加入3 mL杆菌肽母液以及21、9、3、1和0 mL超纯水。使用0.22 µm微孔滤膜过滤后，将滤液转移至标记为A2、B2、C2、D2和E2的样品瓶中。
   注：杆菌肽标准溶液的浓度分别为30、60、120、180和240 U/mL。
5. 将A2、B2、C2、D2、E2和S1样品放入高效液相色谱仪的样品盘中。在流动相托盘中分别放置1000 mL 50 mM/L甲酸铵溶液和1000 mL乙腈，并分别设为流动相A和B。
   注：应用甲酸将甲酸铵溶液的pH值调节至4.0。
6. 按照色谱柱上标注的方向安装C18（5 µm，4.6 mm x 250 mm）高效液相色谱柱（见材料表）。
7. 设置流动相梯度程序：0分钟时为77% A和23% B；30分钟时为70% A和30% B；40分钟时为60% A和40% B；50分钟时为60% A和40% B；51分钟时为77% A和23% B；58分钟时为77% A和23% B。进样量设为100 µL；流速为1.0 mL/min；柱温为30 °C。
8. 点击运行按钮执行程序。

6. 形态学鉴定

1. 将产杆菌肽效价最高的菌株稀释后涂布于LB培养平板上，于37 °C培养箱中培养48 h。按以下方法染色并观察菌落形态。
2. 在载玻片上滴加一滴无菌纯化水，挑取少量菌落，加入水滴中，均匀涂布，自然晾干后通过火焰固定。
3. 加入结晶紫染色1 min，然后用自来水冲洗；再加入碘液染色1 min，随后用蒸馏水冲洗。
4. 加入95%乙醇，轻轻晃动载玻片脱色1 min，然后用蒸馏水冲洗。
5. 加入沙黄染色1 min，然后用蒸馏水冲洗。自然晾干后，使用油镜（见材料表）在显微镜下观察菌落形态。

7. 生理学与生物化学鉴定

1. 向试管中加入 2 mL 无菌生理盐水，使用接种环从平板上挑取单个菌落接种到无菌生理盐水中，制备细菌悬液。
2. 取 100 µL 细菌悬液，分别加入 Bacillus 生化鉴定条的 V-P、柠檬酸盐、明胶、7% 氯化钠、pH 5.7、硝酸盐还原和淀粉水解各孔中（参见材料表）。
3. 使用接种环挑取另一个单菌落，在 Bacillus 生化鉴定条的厌氧生长生化管上以“之”字形划线接种。
4. 使用接种环挑取其他菌落，垂直穿刺接种至 Bacillus 生化鉴定条上用于丙酸盐、D-木糖、L-阿拉伯糖和 D-甘露醇鉴定的各孔中。

8. 菌株基因序列的测定

1. 使用细菌DNA提取试剂盒（参见材料表）提取菌株DNA：将2 mL种子液加入5 mL微量离心管中，在11,500 × g 条件下离心1分钟。弃去上清液，在沉淀中加入110 µL缓冲液（含20 mM Tris，pH 8.0；2 mM Na₂-EDTA和1.2% Triton）以及70 µL 50 mg/mL溶菌酶溶液，37 °C孵育30分钟。
2. 加入4 µL 100 mg/mL RNase A，振荡15秒，室温静置5分钟。加入20 µL蛋白酶K溶液，充分混匀。
3. 加入220 µL GB缓冲液，振荡15秒直至沉淀悬浮，70 °C放置10分钟使溶液变澄清，短暂离心以去除管壁上的液滴。
4. 加入220 µL无水乙醇，充分震荡15秒，短暂离心分离。将溶液及絮状沉淀转移至收集管中的CB3吸附柱中，在13,400 × g 条件下离心30秒，弃去上清液。
5. 向吸附柱中加入500 µL GD缓冲液，在13,400 × g 条件下离心30秒，弃去上清液。向柱中加入600 µL PW缓冲液，在13,400 × g 条件下离心30秒，弃去上清液。
6. 将吸附柱重新放入收集管中，在13,400 × g 条件下离心2分钟，弃去上清液。
7. 将吸附柱于室温放置10分钟以干燥。将柱转移至离心管中，向吸附膜中央加入100 µL洗脱缓冲液TE。
8. 室温静置5分钟，使洗脱液流穿至离心管中，然后在13,400 × g 条件下离心2分钟。
9. 在0.1 mL PCR管中加入25 µL 2×主混合液（参见材料表）、8.8步骤获得的2.5 µL DNA样品、2 µL 27F正向引物、2 µL 1492R反向引物以及18.5 µL双蒸H₂O。
   注：引物的基因序列为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
10. 将PCR管放入PCR仪（参见材料表）中，按以下条件运行：95 °C预变性10分钟，95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸90秒，72 °C最终延伸7分钟。变性、退火和延伸三步循环重复32次。
11. 取5 µL PCR产物，在120 V电压下进行1%琼脂糖凝胶电泳30分钟。
    1. 将500 mg琼脂糖溶于50 mL 1×TAE缓冲液中，微波炉加热1–2分钟至琼脂糖完全溶解。加入5 µL DNA染色染料，倒入胶板并插入梳子。室温静置30分钟至凝固；将凝胶放入电泳槽中，并加入1×TAE缓冲液至浸没凝胶。在第一孔中加入2 µL 2 kb DNA Marker（10 mg/µL），其余孔中加入5 µL PCR产物与1 µL上样染料的混合液。
12. 将凝胶放入凝胶成像系统中拍照。在紫外光下迅速切下DNA条带并称重。
13. 将切下的凝胶条带放入微量离心管中，加入等体积PN溶液。将管置于50 °C水浴中，直至凝胶完全溶解。
14. 向吸附柱CA2中加入500 µL平衡液BL，在13,400 × g 条件下离心1分钟，弃去上清液。
15. 将溶解后的凝胶溶液加入吸附柱CA2中，室温放置2分钟，在13,400 × g 条件下离心30秒，弃去上清液。
16. 向吸附柱CA2中加入600 µL PW缓冲液，在13,400 × g 条件下离心1分钟，弃去上清液，重复一次。
17. 将吸附柱CA2放入收集管中，在13,400 × g 条件下离心2分钟，弃去上清液。
18. 将吸附柱CA2于室温放置10分钟以彻底干燥，然后转移至洁净的离心管中。
19. 向吸附膜中加入50 µL洗脱缓冲液EB，室温静置2分钟，然后在13,400 × g 条件下离心2分钟以收集DNA溶液。
    注：上述溶液或试剂均包含在纯化试剂盒中（参见材料表）。
    1. 将收集的DNA溶液送至专业测序公司（参见材料表）进行测序。通过NCBI GenBank数据库中的Blast工具比对测序结果。根据序列同源性，选取不同菌株，并利用MEGA-X软件中的最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统发育树，以确定菌株间的物种关系。

结果

本实验从健康猪的新鲜粪便中分离出48株Bacillus，编号为1001至1048。其中，15株对M. luteus具有抗菌活性。对这15株菌株采用高效液相色谱法测定其杆菌肽效价，结果如表1所示。B. licheniformis No. 1026的杆菌肽效价最高，为456.35 ± 21.75 U/mL，因此选择No. 1026用于后续实验。

薄层色谱（TLC）的鉴定结果如图2A所示。菌株1026发酵液与杆菌肽标准品的主要斑点位置相同，R_f值为0.61。高效液相色谱（HPLC）分析中，杆菌肽的标准曲线方程为 y = 50.287x - 250.55，相关系数 R² = 0.9968（图2B）。发酵上清液的出峰时间与杆菌肽标准品一致（图2C），因此确定该抑菌物质为杆菌肽，其效价为456.35 ± 21.75 U/mL。

菌株1026在LB培养基上培养12小时后的菌落形态如图3A所示。菌落呈圆形、透明，形似水滴，边缘整齐，隆起饱满。从12小时至24小时，细菌进入生长后期。如图3B所示，菌落向外扩散呈李子状，中心部位出现褶皱，颜色逐渐加深至乳白色，这与B. licheniformis¹⁶菌落形态的描述一致。菌落边缘有透明黏液。对菌株1026进行革兰氏染色后在显微镜下观察，结果如图3C所示，菌体呈紫色杆状，表明其为革兰氏阳性菌。

如表2所示，菌株1026能够在厌氧环境中生长。该菌株的V-P试验、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原和淀粉水解试验均为阳性。该菌株能够分解并利用大多数碳源，其生理生化特性与B. licheniformis相同。

菌株1026的16S rDNA片段大小约为1400 bp（图4A）。菌株1026的测序结果与GenBank中B. licheniformis DSM 13的序列相似性达99.58%。随后构建了系统发育树，如图4B所示。B. licheniformis DSM 13的进化分支长度为0.000，表明该菌株为B. licheniformis。

根据菌株1026的形态学、生理学和生化特征，以及16S rDNA基因序列的同源性分析，鉴定菌株1026为B. licheniformis。

图1：菌株接种示意图。 使用接种环挑取菌落，并在抗菌活性检测培养基上以锯齿状模式划线接种。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：抑菌物质的鉴定。（A）薄层色谱法。（B）杆菌肽的高效液相色谱标准曲线。（C）高效液相色谱图。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：菌株No. 1026的形态特征及革兰氏染色结果。 菌落在（A）12小时和（B）24小时的形态。（C）革兰氏染色结果。请点击此处查看该图的高清版本。

图4：菌株No. 1026的分子生物学鉴定。（A）菌株No. 1026的16S rDNA基因扩增结果。（B）菌株No. 1026的系统发育树。请点击此处查看该图的放大版本。

编号	杆菌肽效价 (U/mL)	编号	杆菌肽效价 (U/mL)
1003	423.57±18.62	1021	317.46±13.46
1004	325.82±13.23	1026	456.35±21.75
1009	326.26±14.52	1027	435.57±19.18
1011	376.65±16.11	1030	382.48±17.64
1015	325.27±12.37	1031	215.37±11.73
1016	256.56±15.37	1039	353.67±16.16
1017	352.47±16.47	1041	342.36±14.36
1018	328.73±16.12

表1：具有抗菌活性菌株的杆菌肽效价。

项目	结果	项目	结果
厌氧生长试验	+	D-甘露醇试验	+
V.P. 试验	+	明胶试验	+
柠檬酸盐利用试验	+	7% NaCl 试验	+
丙酸盐试验	+	pH 5.7 试验	+
D-木糖试验	+	硝酸盐还原试验	+
L-阿拉伯糖	+	淀粉水解试验	+

表2：菌株1026的生理生化鉴定。

讨论

B. licheniformis 在简单的培养条件下生长迅速且糖消耗快，成熟的发酵技术有助于降低工业生产成本¹³. 该技术的广泛应用 B. licheniformis 及其分泌物杆菌肽已显示出巨大的市场价值。在农业中， B. licheniformis 用作生物肥料，通过提高土壤肥力、促进根系发育以及协助有机物降解，从而改善植物生长和养分吸收¹⁵用于工业酶的生产， B. licheniformis 可产生多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶，这决定了其在食品加工、洗涤剂制造、皮革处理和纺织工业中不可替代的市场价值¹⁶鉴于其优异的抗菌药理活性 B. licheniformis 以及杆菌肽，已在医学领域用于治疗由细菌和真菌引起的各种感染性疾病¹同时，考虑到药用植物的生长以及植物中药理活性成分的积累， B. licheniformis 是一种潜在的植物生长促进剂，同时也可用于生产诸如 红景天-衍生的红景天苷^17,18上述优点 B. licheniformis 杆菌肽在工业、农业、水产养殖、生物技术和医药行业中具有广泛应用。因此，其分离与纯化 B. licheniformis 高产的杆菌肽是确保后续大规模生产和应用的关键因素。

尽管杆菌肽可通过化学合成方法制备，但其步骤繁琐，且副产物较多。在工业上，杆菌肽主要通过地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）发酵玉米粉和豆粕的次级代谢过程来生产。在现代杆菌肽工业生产中，高成本和低产率限制了其进一步应用¹⁰。因此，筛选高产杆菌肽菌株并提高原料利用率是提升杆菌肽产量的关键。

目前，高产杆菌肽菌株的选育主要通过从土壤及其他环境中进行自然选育、利用现有产杆菌肽菌株开展诱变育种，或基于基因工程的育种方式实现。自然选育操作简便，筛选获得的菌株产量稳定，但耗时较长，工作量大。诱变育种突变率高，可缩短育种周期，但突变性状在后续世代中可能无法稳定遗传¹⁶。基于基因工程的育种在获得高产菌株方面更具针对性¹⁰，但存在因引入外源基因而带来的安全性问题。健康成年动物的粪便中含有丰富的益生菌资源，能够维持菌群平衡。

本文基于B. licheniformis在极端环境中可形成休眠芽孢的特性¹⁹，将健康猪粪稀释液置于高温环境中，以杀死不产芽孢的耐热细菌和真菌。由于M. luteus对B. licheniformis在生长后期产生的抑菌肽敏感，且能产生易于观察的黄色色素，因此被用于通过抑菌圈评估来筛选抗菌活性。根据菌落形态与B. licheniformis形态相似、细胞形态为短杆状、革兰氏阳性、具有B. licheniformis的生理生化特征，以及16S rRNA与B. licheniformis高度同源，确定编号为1026的菌株为B. licheniformis。通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）鉴定其抑菌物质为杆菌肽。因此，获得了产杆菌肽的B. licheniformis。该方法也存在不足之处，例如筛选过程耗时较长，且操作需要一定经验。

综上所述，本实验方案全面且详细地介绍了产杆菌肽的B. licheniformis的获取及其常规实验室鉴定流程，该菌株具有广阔的应用前景和不可估量的市场价值²⁰。这些方法简便、可行且易于实施，无疑将为B. licheniformis的大规模生产提供有效的参考依据。本文还为其他抗菌肽生产菌株的筛选提供了思路。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 × Phanta Flash Master Mix	中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国	P252-01
2kb DNA Marker	中国北京博奥生物技术有限公司，中国北京	BM121-01
乙腈	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海	A104443
琼脂粉	中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海	A800730
琼脂糖	中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国上海	A104062
硫酸铵 ((NH₄)₂SO₄)4)2SO4)	中国上海，国药集团化学试剂有限公司	10002917
高压灭菌器	中国厦门，泽瓦仪器有限公司	GI36DWS
芽孢杆菌生化鉴定条	中国青岛海博生物技术有限公司，中国青岛	HBIG14
杆菌肽	中国上海，上海源叶生物科技有限公司	B65740
细菌DNA提取试剂盒	中国北京，天根生化科技有限公司	DP209
透气封膜	北京雷博润生物科技有限公司	BS-QM-01A
丁醇	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海	B433378
C18 (5 μ米，4.6 × 250 mm）HPLC 柱	中国日照科普诺新材料有限公司，日照，中国	C1805-462510
碳酸钙（CaCO₃）3)	中国上海，国药集团化学试剂有限公司	10005717
离心	New Brunswick Scientific Co., Inc.，英国	5452
色谱缸	中国南京腾辉实验技术有限公司，中国南京	P-1
锥形瓶	四川树博  有限公司，中国成都	18012
恒温培养箱	中国天津，Taist Instrument Co., Ltd.	GH4500
磷酸氢二钾（K₂HPO₄）2HPO4)	中国广东，西龙化工有限公司	XL0015
EDTA-2Na	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，中国上海	E397526
电子天平	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
乙醇	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，上海，中国	E130059
Gel Midi 纯化试剂盒	中国北京，天根生化科技有限公司	DP302
玻璃棒	成都一邦科析仪器有限公司	1294
葡萄糖	中国上海麦克林生化科技有限公司，中国上海	D823520
革兰染色液试剂盒	中国青岛海博生物技术有限公司，中国青岛	HB8278
高效液相色谱仪	美国加利福尼亚州，安捷伦科技有限公司	1260
水平电泳装置	中国北京，北京六一生物科技有限公司	DYCP-31DN BIOMATE
接种环	中国上海，上海慕晨生物科技有限公司	3171026
磁力搅拌器	Wiggens GmbH Co., Ltd.，德国	WH220 PLUS
甲醇	中国上海阿拉丁生化科技有限公司，上海，中国	M116115
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