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方法文章

华通氏胶间充质干细胞及其衍生外泌体/小型细胞外囊泡的分离

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DOI：

10.3791/66778

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2025年11月11日

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1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

本文内容

摘要

脐带组织是一种丰富、易获取且无创的间充质干细胞（MSCs）来源。本方案详细介绍了人华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）的分离与鉴定步骤，随后提供了一种简便快速的分离其来源外泌体或小型细胞外囊泡的方法。

摘要

在再生医学领域，间充质干细胞（MSCs）引起了特别关注。来源于脐带（UC）组织（即华通胶）的MSCs已在多种应用中得到充分确立。与其他MSC来源相比，华通胶来源的间充质干细胞（WJ-MSCs）具有多项优势，且脐带通常作为医疗废物丢弃，因此WJ-MSCs的获取来源丰富。因此，WJ-MSCs不会引发类似于胚胎干细胞所涉及的伦理问题。本研究采用一种简单且可重复的组织块贴壁法从脐带组织中分离WJ-MSCs。分离后5至10天内，WJ-MSCs以贴壁细胞形式出现，呈成纤维细胞样形态。分离后细胞在14至18天内达到约80%的融合度。随后，在第3代时，通过诱导细胞向脂肪源性、成骨源性和软骨源性间充质谱系分化，对分离获得的WJ-MSCs进行全面表征。此外，还检测了阴性分化簇（CD）表面标志物（包括CD34、CD14和HLA-DR）以及典型的MSC表面标志物（如CD105、CD90、CD73和CD44）的免疫表型。进一步地，采用一种简单的沉淀试剂法从这些WJ-MSCs的条件培养基中分离外泌体/小细胞外囊泡（sEVs）。分离后的外泌体/sEVs通过透射电子显微镜进行观察，并利用颗粒粒径分析测定其平均大小。综上所述，WJ-MSCs提供了一种易于获取、无创且可再生的干细胞来源，可作为“工厂”用于生产外泌体/sEVs。这些WJ-MSCs及其衍生的外泌体/sEVs可在广泛的治疗及后续研究应用中发挥作用。

引言

几年前，干细胞曾被认为将在医学领域占据主导地位1,2。然而，胚胎干细胞（ESCs）引发的伦理问题严重阻碍了该领域的快速发展3。这促使人们高度关注探索干细胞的其他可再生来源，尤其是那些可在出生后从脐带（UC）中分离获得的干细胞4。脐带在孕妇体内自然连接胎盘与胎儿。脐带的天然功能是通过血管为发育中的胎儿持续提供充足的血液供应，并在胎儿活动过程中防止血管发生扭转、受压或弯曲，从而保护这些血管5。从解剖学上看，人类脐带包含两条动脉和一条静脉，它们嵌入于黏液样结缔组织中，并被外层的羊膜上皮包裹6。包裹这三条脐带血管的基质，即黏液样结缔组织，被称为"华通胶"（Wharton's jelly，WJ），主要由蛋白聚糖和胶原蛋白构成7。

近年来，间充质干细胞（MSCs）因其在多种再生医学应用中展现出的有效性而受到广泛关注7,8,9,10,11,12。MSCs最引人注目的特点在于其易于分离，并具有已证实的免疫调节活性和多向分化潜能13,14,15。MSCs普遍具有的其他优势，尤其是来源于华通氏胶（WJ）的MSCs，包括移植后不会形成畸胎瘤（与胚胎干细胞ESC不同），以及即使经过多次细胞传代后仍能保持其干性特征16,17。因此，目前普遍认为MSCs有望为多种疾病提供革命性的治疗干预手段8,18,19。需要指出的是，2006年国际细胞与基因治疗学会（ISCT）提出了MSCs正确鉴定的特定最低标准20。第一，在标准培养条件下培养时，MSCs应具有贴壁生长的特性。第二，MSCs必须表达某些特征性的分化簇（CD）表面标志物，如CD90、CD105和CD73，且不应表达其他标志物如CD14、CD34和CD45。第三，MSCs必须在体外（in vitro）能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞谱系20。迄今为止，MSCs已从多种来源中分离获得，包括成体组织如骨髓（BM）、脂肪组织21，以及胎儿/围产期组织如胎盘、脐带血（UCB）和脐带基质22,23。值得注意的是，在比较MSCs获取成功率时，据报道从WJ组织中分离的成功率几乎可达100%，而从UCB中仅为约6%24,25。因此，尽管UCB确实是造血干细胞的丰富来源，也被认为是MSCs的良好来源，但其效率显著低于WJ26,27,28。

与其他类型的间充质干细胞（MSCs）相比，华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）具有独特优势：尽管它们是真正的（典型的）MSCs，具有与成体来源MSCs相似的特性，但同时还表达多种多能性/胚胎干细胞（ESCs）标志物17,29。因此，WJ-MSCs被认为处于成体干细胞与胚胎干细胞之间的某种中间状态17。有趣的是，研究发现WJ-MSCs同时表达人类MSCs和ESCs的标志物，并能够在多次传代过程中维持其干性16。幸运的是，在移植后，它们不会形成畸胎瘤17。这一特性可通过其与ESCs以及其他MSCs相比所具有的独特转录组谱来解释29,30。WJ-MSCs相较于成体MSCs，甚至相较于其他类型的干细胞总体而言，具有多种优势。其分离来源可通过出生时常规丢弃的脐带（UC）获得，来源便捷且属于医疗废弃物。因此，与胚胎干细胞（ESCs）不同，WJ-MSCs不存在伦理问题；与通过侵入性手段获取的骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）相比也更具优势31。此外，与其他MSC类型相似，WJ-MSCs不表达人类白细胞抗原-D相关分子（HLA-DR），并且特别被发现表达人类白细胞抗原-G（HLA-G），从而赋予其额外的免疫豁免特性32。这表明WJ-MSCs在体内模拟了胎儿-母体界面通常发生的免疫抑制作用in vivo33,34,35。最后，与从脐带血（UCB）中分离的类似细胞一样，WJ-MSCs具有极大的储存应用潜力36。鉴于上述诸多优势，WJ-MSCs被提倡作为基于MSC治疗的新一代金标准30。

有趣的是，大量研究表明，间充质干细胞（MSCs）主要通过旁分泌信号发挥其治疗作用。在许多情况下，这些作用已被证实是由MSCs分泌的外泌体/小型细胞外囊泡（sEVs）所介导的37。外泌体/sEVs是一类来源于细胞内膜系统的生物活性纳米级囊泡，可作为“瓶中信”，在细胞间传递特定的蛋白质、mRNA以及非编码RNA（如microRNA和长链非编码RNA，LncRNAs）等分子货物38。因此，它们能够重编程受体细胞，并被称为调控关键细胞功能的“信号体”"signalosomes"39。相比于MSCs细胞治疗，MSCs来源的外泌体/sEVs展现出作为无细胞治疗策略的潜在优势。与母体MSCs类似，外泌体/sEVs在多种疾病中均被发现具有治疗效应和促进细胞再生的能力。然而，与母体细胞不同的是，它们更易穿越生物屏障。此外，其安全性更佳，不会引发免疫排斥或长期肿瘤形成的风险40。同时，外泌体/sEVs还可作为天然的基因递送系统，用于基因治疗领域的药物递送，因其本身具备传递遗传信息的能力41。因此，外泌体/sEVs确实为多种疾病的新型治疗干预开辟了令人振奋的新途径42,43,44。

本方案中，提供了一种系统的、基于组织块法的逐步操作流程，用于从脐带组织中分离和鉴定华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）。随后，还将介绍一种从这些WJ-MSCs的条件培养基中分离外泌体/小细胞外囊泡（exosomes/sEVs）的简明方案。

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方案

所有实验和操作均按照批准的指南进行，并获得了埃及开罗艾因夏姆斯大学药学院伦理委员会（ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220）和埃及开罗英国大学药学院伦理委员会（CL-2309）的批准。在获得父母（或监护人）签署的知情同意书后，获取了脐带组织。

1. 从人脐带中分离华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）

  1. 在容器（密封收集袋）中放入约30–40 mL磷酸盐缓冲液（PBS），用于分娩后立即收集脐带（UC）（约15 cm长）。收集后的脐带应置于冰上保存，并在采集后最多4–5小时内进行处理。
    注意：样本在4-5小时后不可再处理，否则将显著降低间充质干细胞（MSCs）的得率。确保磷酸盐缓冲液（PBS）和容器无菌。
  2. 制备WJ-MSCs的完全培养基，包含低糖Dulbecco改良Eagle培养基（LG-DMEM），并添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和0.25 µg/mL两性霉素B。
  3. 在6孔板中每孔加入3 mL完全培养基，然后将含有培养基的6孔板置于CO₂培养箱中2 37 °C、5% CO₂ 培养箱2 预热并做好准备。
  4. 在生物安全柜中，准备八个10 cm细胞培养皿，每个培养皿中加入10 mL无菌PBS。
  5. 使用无菌镊子小心地将脐带（UC）从密封的塑料袋中转移至第一个含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，以冲洗血液（重复此步骤直至样本中的血液完全洗净）。
  6. 用无菌棉签蘸取70%乙醇，擦拭脐带残端30秒。
  7. 将UC转移至盛有无菌PBS的新培养皿中，以去除残留的乙醇。
  8. 将脐带转移至另一个预先装有无菌PBS的培养皿中，用无菌剪刀将脐带剪成较小的片段（每段约3 cm）。随后，将这些3 cm长的片段转移至另一含有新鲜无菌PBS的培养皿中，以避免剪切过程中释放的血液污染。
    注意：从此时起，脐带组织块及后续所有处理步骤均须保持在冰上进行。这一点至关重要，可避免胶状物质的释放，从而确保从脐带组织中成功分离华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）。采集后的脐带组织须在4至5小时内完成处理，这是分离过程成功的关键。既往曾尝试在采集后较长时间内处理脐带组织，但遗憾的是，该操作未能获得成功结果（数据未显示）。
  9. 将脐带组织块逐个置于盛有无菌PBS并预冷的培养皿中（置于冰上）进行处理。使用无菌剪刀和镊子去除血管，分离华通胶（Wharton's jelly, WJ）组织。随后将透明的WJ组织块转移至另一盛有无菌PBS并预冷的培养皿中，保持在冰上。
    注意：在从脐带组织中分离华通胶（WJ）时，首先应在脐带片段无血管的一侧进行切口，以避免切断血管。随后，夹闭血管，环绕切割并将其拉除。
  10. 对所有脐带组织块重复上一步骤，以获得无血管的清晰华通胶组织。
    注意：在处理脐带组织片段及去除血管过程中，若PBS溶液在华通胶组织分离期间变得浑浊或带血，应根据需要更换PBS培养皿。
  11. 用无菌 PBS 冲洗收集的 WJ 组织块，将其转移至盛有无菌 PBS 的新 10 cm 细胞培养皿中。
  12. 使用无菌的锋利解剖刀和镊子将收集到的华通氏胶组织切成约10毫米长的小块。
  13. 将WJ组织块转移至第1.3步中预先准备好的6孔板中。每孔放置5-6个WJ组织块，随后将含有WJ组织外植体的6孔板置于含5% CO₂的湿润环境中孵育2 在 CO₂ 中，37 °C2 培养箱中静置培养3天。
  14. 第4天th 从放置华通氏胶组织外植体的当天起，小心地向每孔加入1 mL培养基，注意不要扰动外植体。
    注意：避免触碰或刮擦装载华通胶组织块的培养板底部。
  15. 重复上一步骤于6th 放置华通氏胶组织外植块后的第2天。
  16. 第8天th 放置华通氏胶组织外植块后一天（即外植块放置后近1周时），开始每隔一天更换每孔一半的培养基，直至第12天th-14th 植块放置后第二天，从每个孔中移除约2.5 mL培养基，加入2.5 mL新鲜的完全预温培养基（37 °C），更换每孔一半的培养液。
    注意：吸出孔表面的培养基时，避免触碰或刮伤放置华通氏胶组织块的培养板底部。华通氏胶来源的间充质干细胞通常在组织块接种后5-10天内于组织块下方及周围出现。
  17. 在倒置显微镜下（10倍放大）常规观察6孔板，若发现释放的细胞正在增殖且融合度逐渐增加并达到50–60%，则进行下一步；否则，重复步骤1.16。随着时间推移，华通胶（WJ）组织块会明显缩小。
  18. 轻轻移除附着在孔底部的华通氏胶（WJ）外植块，并吸除所有培养基。移除外植块的操作通常在第12天进行th-14th 从最初放置之日起的每一天。
    注意：移除培养基时，将培养板略微倾斜约45°角，以确保完全去除所有培养基。
  19. 每孔加入 2 mL PBS 洗涤，轻轻摇晃培养板，然后弃去 PBS。重复此洗涤步骤两次。
    注意：将 PBS 轻柔地沿孔壁加入，避免接触孔底，以确保细胞完全不受扰动。
  20. 每孔轻轻加入 2 mL 预热的完全培养基（培养基成分与步骤 1.2 中所述完全相同），将 6 孔板置于含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育2 在 37 °C.
  21. 每隔一天完全更换一次培养基（每孔加入2 mL完全培养基），直至细胞融合度达到约80%。
  22. 当细胞融合度达到约80%时，使用胰蛋白酶-EDTA将细胞传代至T25细胞培养瓶中（一个6孔板获得的总细胞可传代至一个T25培养瓶，每个T25培养瓶使用8–9 mL完全培养基）。这些WJ-MSCs记为P1代细胞。
    注意：使用胰蛋白酶-EDTA处理细胞时，不要孵育过长时间，以免产生毒性作用；通常3分钟足以使细胞脱落。不同供应商提供的胰蛋白酶-EDTA活性可能存在差异，因此在确定孵育时间时需考虑这一因素。
  23. 每隔一天更换培养基。当细胞生长至约80%融合度时，使用胰蛋白酶-EDTA将细胞传代至T75细胞培养瓶中（一个T25培养瓶获得的总细胞可传代至一个T75培养瓶；每个T75培养瓶加入15–18 mL完全培养基）；此代脐带华通氏胶间充质干细胞记为P2代细胞。
  24. 每隔一天更换一次培养基。当细胞融合度达到约80%时，使用胰蛋白酶-EDTA消化细胞，然后以约0.75 × 10⁶ cells/cm²的密度接种WJ-MSCs。6-1 × 106 每T75培养瓶的细胞数。这些WJ-MSCs记为P3代细胞。
    注意：使用处于以下代次之间的细胞 P3-P5 代细胞用于本方案中描述的后续实验。
  25. 使用由80% FBS、10%完全培养基（如步骤1.2所述）和10%二甲基亚砜（DMSO）组成的冷冻保存液，将分离获得的WJ-MSCs在液氮中进行冷冻保存。
    注意：本文提供了脐带华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）分离全过程的示意图 图1.

2. 通过流式细胞术分析多种CD表面标志物对分离的华通氏胶间充质干细胞进行免疫表型表征

  1. 在第4代时使用胰蛋白酶-EDTA消化细胞。用PBS洗涤细胞两次，并使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
    注意：胰蛋白酶消化过程中孵育时间应尽可能短（3分钟），这对于成功解离细胞且不造成损伤至关重要。长时间孵育可能导致细胞表面标志物受损，从而对免疫表型分析结果产生不利影响。
  2. 将约100,000个细胞在避光条件下于4 °C与以下标记有藻红蛋白（PE）或异硫氰酸荧光素（FITC）的抗人单克隆抗体共同孵育20分钟：Anti-CD90 PE、Anti-CD73 PE、Anti-CD105 FITC、Anti-CD44 PE、Anti-CD34 PE、Anti-CD14 PE 和 Anti-HLA-DR FITC，并以未染色细胞作为对照。
  3. 用PBS冲洗细胞，随后将细胞重悬于500 µL的FACS缓冲液中，通过流式细胞术进行分析45。

3. 分离的华通氏胶间充质干细胞向多种间充质谱系分化潜能的评估

  1. 脂肪细胞分化
    1. 用完全增殖培养基（如步骤1.2所述）重悬细胞。随后，以3.7 x 10⁵ cells/cm²的密度接种培养细胞。4 细胞/孔（每孔0.5 mL培养基）接种于24孔组织培养板中。随后，在5% CO₂湿润条件下培养2 在 37 °C. 下一步,接下来，每隔一天更换一次培养基，直至细胞融合度接近100%；通常需要3-4天。
    2. 移除增殖培养基，替换为成脂分化培养基以诱导成脂分化。在低糖DMEM培养基中添加100 µg/mL链霉素、100 U/mL青霉素、0.25 µg/mL两性霉素B，以及间充质干细胞功能鉴定试剂盒中提供的成脂补充剂。随后每3天轻柔更换培养基（0.5 mL/孔），避免破坏脂滴空泡。
    3. 约21天后，通过显微镜观察，使用油红O染色脂滴以评估成脂分化。
    4. 配制新鲜的油红O储备液：将30 mg油红O染料溶解于10 mL异丙醇中，室温静置至少30分钟。随后，通过将2份双蒸水（ddH₂O）与3份储备液混合，配制工作液。2将3份储备液与O混合，充分混匀，并在室温下静置10分钟。随后，使用0.22或0.45 µm滤膜过滤。
      注意：为了获得最佳染色效果，建议新鲜配制油红染液。
    5. 为成功记录成脂分化结果，用 PBS 洗涤细胞两次，随后加入中性缓冲的 10% 甲醛（0.75 mL/孔）固定 15 分钟。之后，用 PBS 洗涤细胞两次，每次加入 1 mL/孔（每次洗涤弃去 PBS 前，将细胞孵育约 5 分钟）。
      注意：以增殖培养基（见步骤1.2）培养的细胞作为对照组未诱导细胞。向培养孔中加入中性缓冲甲醛时，应沿孔壁缓慢加入，避免直接接触细胞，以防细胞损伤。最后一次PBS洗涤后，在加入油红O工作液之前，必须彻底吸净PBS，以防止染色效率降低。
    6. 最后一次洗涤后，每孔加入1 mL Oil Red工作液对细胞进行染色，并在37 °C孵育60分钟。随后吸去并弃除染色液，用PBS轻轻冲洗细胞两次。接着在显微镜下观察染色的脂滴。
  2. 成骨分化
    1. 用完全增殖培养基（如步骤1.2所述）重悬细胞。随后，在24孔组织培养板中接种7.4 × 10⁴个细胞/孔。3 细胞/孔（每孔加入0.5 mL培养基），在5% CO₂、湿润条件下培养3天2 在37 °C下培养至接近70%汇合度。
    2. 当细胞融合度达到约70%时，将增殖培养基更换为成骨诱导分化培养基，即在含10% FBS的低糖DMEM培养基中加入间充质干细胞功能鉴定试剂盒提供的成骨诱导添加剂，以及100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和0.25 µg/mL两性霉素B。
    3. 每3天更换一次成骨分化培养基，持续诱导成骨约21天。
    4. 配制茜素红S染色工作液；取9 mL去离子水2O，并溶解200 mg茜素红S染料，然后用氨水和HCl将pH调节至4.1–4.3。接着用ddH₂O定容至10 mL2O. 随后，使用滤膜（0.22 或 0.45 µm）过滤溶液，以去除任何沉淀物。
    5. 诱导期结束后，用 PBS 清洗细胞两次，然后使用中性缓冲 10% 甲醛（0.75 mL/孔）固定细胞，静置 15 分钟。随后，用 PBS（1 mL/孔）再次清洗细胞两次，每次清洗时确保孵育 5 分钟。
      注意：以增殖培养基（见步骤1.2）培养的细胞作为对照，即未诱导细胞。
    6. 将步骤3.2.4中配制的2%茜素红S工作液加入上一步固定的细胞中，室温避光孵育约45-60分钟。
    7. 随后，弃去染色液，并用ddH₂O冲洗细胞。2用 PBS 洗涤两次，再用 PBS 洗涤一次，然后在显微镜下观察染色的富钙细胞外基质，以评估成骨分化是否成功。
  3. 软骨形成分化
    1. 将细胞重悬于完全增殖培养基中（如步骤1.2所述）。随后，在24孔组织培养板中，每孔接种7.4 × 10⁴个细胞。3 细胞/孔（每孔加入0.5 mL培养基），并在5% CO₂湿润条件下孵育2 37 °C 培养 3 天，使其融合度接近 90%。
    2. 当细胞融合度达到约90%时，开始诱导软骨向分化。使用无血清的DMEM/F12培养基进行诱导，该培养基需添加胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、软骨分化补充剂（随间充质干细胞功能鉴定试剂盒提供）、0.25 µg/mL 两性霉素B、100 U/mL 青霉素、2 mM L-谷氨酰胺和100 µg/mL 链霉素。46.
      注意：完全软骨诱导分化培养基需避光保存于 2-8 °C。
    3. 继续软骨形成分化诱导约21天，期间每3天更换一次培养基。
    4. 制备阿利新蓝染色工作液，步骤如下：首先，用ddH₂O配制3%冰醋酸溶液2O（加入3 mL冰醋酸，并用ddH₂O定容至100 mL）2然后，通过将20 mg Alcian Blue加入20 mL 3%冰醋酸溶液中配制工作液，静置约30分钟，随后使用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤，以去除任何沉淀物。
    5. 诱导期结束后，用 PBS 洗涤细胞两次，然后加入 10% 中性缓冲甲醛溶液（0.75 mL/孔）固定细胞，静置 15 分钟。随后用 PBS（1 mL/孔）洗涤细胞两次，每次孵育 5 分钟。
      ​注意：以增殖培养基（如步骤1.2所述）培养的细胞用作对照，即未诱导细胞。
    6. 将固定后的细胞在37 °C下用0.1% 阿尔新蓝工作液孵育约60分钟。用ddH₂O冲洗细胞2用PBS洗涤两次，再用PBS冲洗一次，以去除残留染料。然后通过显微镜观察染色的硫酸化蛋白聚糖。

4. 从WJ-MSCs条件培养基中分离外泌体/sEVs

  1. 将WJ-MSCs重悬于完全增殖培养基中（如步骤1.2所述），以每孔150,000个细胞的密度接种至6孔组织培养板中（每孔2 mL培养基），并在37 °C、5% CO2的湿润条件下培养。
  2. 制备无血清（SF）外泌体收集培养基，配方如下：低糖Dulbecco改良Eagle培养基（LG-DMEM），添加2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B。
    注：外泌体收集培养基的成分与完全增殖培养基（见步骤1.2）相同，但不含FBS。
  3. 观察步骤4.1中准备的6孔板，每隔一天更换一次增殖培养基（如步骤1.2所述），并在显微镜下观察细胞，直至细胞融合度达到约75–80%。
  4. 当细胞融合度达到70%时，用PBS洗涤细胞两次（每孔1 mL），然后加入无血清（SF）外泌体收集培养基（每孔1.5 mL）（见步骤4.2），在37 °C、5% CO2的湿润条件下孵育48小时。
  5. 孵育48小时后，从上一步骤中的6孔组织培养板中收集WJ-MSCs条件培养基，转移至15 mL离心收集管中。随后，进行以下连续离心和过滤步骤以清除收集的条件培养基47。
    ​注：使用台盼蓝排斥染料法，结合血细胞计数板计数，评估用于获取条件培养基的初始细胞活力百分比；理想情况下，活细胞比例应高于90%。之后，将收集的细胞沉淀储存在-80 °C，以备将来可能的研究使用。
    1. 在4 °C条件下，以300 x g离心10分钟，去除悬浮细胞。收集上清液，并对所得上清液（即条件培养基）进行下一步离心。
    2. 在4 °C条件下，以3000 x g离心15分钟，以去除坏死细胞及细胞碎片。
      注：离心步骤最好在4 °C进行，但也可在室温下操作，结果相似。
    3. 将上一步获得的上清液通过0.22 µm滤膜过滤至新的50 mL聚丙烯收集管中，以去除残留的细胞碎片和较大的细胞外囊泡（EVs）。
      ​注：过滤后的条件培养基可立即用于后续外泌体/sEVs的分离，也可在4 °C冰箱中保存不超过3天，或在-80 °C长期保存，待需要分离外泌体/sEVs时再使用。储存在-80 °C的澄清条件培养基建议在1–3个月内处理完毕；越早处理越好。
  6. 取7.5 mL澄清后的条件培养基（来自步骤4.5）置于15 mL离心管中，加入1.5 mL沉淀试剂。试剂与培养基按1:5比例添加（即每5 mL培养基加入1 mL Exoquick-TC沉淀试剂）。随后，上下颠倒混匀管子，并轻轻弹击数次，确保沉淀试剂与培养基充分混合。
    注：沉淀试剂为高密度、黏稠液体，应缓慢而小心地吸取所需体积，以确保完全转移目标体积。
  7. 将含有培养基和沉淀试剂的离心管置于4 °C 环境中，直立静置过夜，约16小时（至少12小时）。
  8. 次日，在4 °C条件下，以1500 x g 离心30分钟。离心后，外泌体/sEVs沉淀呈现为管底极小的白色或米白色沉淀。
    注：此离心步骤也可在室温下进行，结果相似。若离心结束后未见外泌体/sEVs沉淀，可额外在4 °C条件下以3000 x g再离心20–30分钟。有时即使延长离心时间仍不可见沉淀，表明外泌体/sEVs含量较少。此时，继续实验流程，保留管底5–10 µL液体即可。
  9. 吸除上清液，再在4 °C条件下以1500 x g离心5分钟，以沉淀残留的培养基/沉淀试剂混合物。随后，小心吸除残留液体，避免扰动已沉淀的外泌体/sEVs沉淀。
  10. 根据沉淀的大小和可见程度，用100–300 µL无菌PBS重悬外泌体/sEVs沉淀。之后，这些外泌体/sEVs可立即使用，或在-80 °C超低温冰箱中储存，用于后续实验。
    注：若同一批培养基使用了多个离心管（见步骤4.9），且步骤4.10中获得的外泌体/sEVs沉淀不可见，可使用约100–300 μL无菌PBS将所有沉淀合并重悬。
  11. 按照制造商说明，使用市售的二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒，以外泌体/sEVs的蛋白含量为基准进行定量。
    ​注：图2提供了WJ-MSCs来源外泌体/sEVs分离全过程的示意图。

5. 使用透射电子显微镜（TEM）对分离的外泌体/sEVs 进行成像

  1. 根据沉淀物的大小和可见程度，将新分离的外泌体/sEVs重悬于100–300 µL无菌PBS中（如步骤4.11中先前所述）。
    ​注意：进行透射电子显微镜（TEM）成像时，强烈建议使用新分离的外泌体/sEVs，而非冻存样品
  2. 取20 µL外泌体/sEVs悬液滴加至覆碳网格上，室温干燥10分钟。
  3. 用2%戊二醛溶液（溶于蒸馏水中）固定网格上的外泌体/sEVs，作用约15分钟。
  4. 随后用2%醋酸铀染色固定后的外泌体/sEVs，在避光条件下放置约3分钟，然后使用透射电子显微镜（TEM）在20000倍放大倍数下，按照默认的TEM设置进行观察。

6. 使用颗粒大小分析仪测定分离的外泌体/sEVs 的平均尺寸

  1. 用无菌 PBS（pH 7.4）以 1:250 的比例稀释 freshly isolated exosomes/sEVs。
  2. 使用粒径分析仪在 25 °C 下测定分离得到的 exosomes/sEVs 的平均粒径分布。

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结果

华通氏胶间充质干细胞的分离与表征

如所示 图3，成纤维细胞样小细胞最初在接种后5-10天内出现在华通胶组织块下方及周围图3A。这些释放出的WJ-MSCs会持续增殖，通常在分离后14–18天内达到约80%的融合度。值得注意的是，组织块在培养过程中会持续缩小，通常在分离当天接种于6孔板后约12–14天将其移除。在移除WJ组织块时，通常可在其下方观察到高密度生长的WJ-MSCs，此阶段记为P0，如图所示 图3B此外，必须指出的是，WJ-MSCs从其第1代开始即表现出均一的培养特性st 传代图3C）。这些细胞持续生长为均质的、成纤维细胞样、贴壁生长的细胞，至少传代至第4...

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讨论

在本实验方案中，我们详细展示了从人脐带组织中分离华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）及其衍生外泌体/小细胞外囊泡（sEVs）的具体步骤。脐带是一种易于获取、尚未被充分开发且无创的MSC来源，其采集和处理无需特殊设备11,15,30,32,48。目前已有多种方法用于从脐带组织中分离WJ-MSCs。通常情况下，主要采用组织块贴壁法32,48和化学酶解消化法49 进行分离50，这与本方案有所不同。有时也会结合机械法与酶消化法，使用胰蛋白酶、透明质酸酶或胶原酶处理后，将消化后的华通氏胶组织通过18G针...

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披露

所有共同作者均声明本工作不存在利益冲突。

致谢

本工作部分由埃及艾因夏姆斯大学战略计划研究支持基金（2024/2025）以及埃及英国大学（BUE）纳米技术研究中心（NTRC）准入奖（2019/2020）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿尔新蓝 8GXSigma-Aldrich, 美国A3157
茜素红 SSigma-Aldrich, 美国A5533
氢氧化铵Fisher Scientific, 德国1336-21-6
人 CD-105 抗体，FITC 标记R&D systems Inc., MN, 美国FAB10971F
人 CD-14 抗体，PE 标记Beckman Coulter, 美国IM0650U
人 CD-34 抗体，PE 标记Beckman Coulter, 美国IM1420
人 CD-44 抗体，PE 标记Beckman Coulter, 美国A32537
人 CD-73 抗体，PE 标记R&D systems Inc., MN, 美国FAB5795P
人 CD-90 抗体，PE 标记R&D systems Inc., MN, 美国FAB2067P
人 HLA-DR 抗体，FITC 标记Beckman Coulter, 美国IM1638U
双辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒Thermofisher23227
生物安全柜，层流，MSC AdvantageThermo Scientific, 美国
CO2 培养箱，Direct FormaThermo Scientific, 美国
冷冻离心机Sigma, 德国
冷冻离心机Eppendorf, 德国
CytoFLEX 流式细胞仪 Beckman Coulter, FL, 美国
二甲基亚砜（DMSO）Fisher Scientific, 德国BP231-100
DMEM - 低糖 1 g/LLonza, 瑞士12-707F
DMEM/F12 Lonza, 瑞士12-719F
无 DNA 酶/RNA 酶水Gibco Thermo Fisher, 美国10977-035
分子生物学级无水乙醇Sigma-Aldrich, 德国24103
ExoQuick-TCSystem Biosciences (SBI), 美国EXOTC50A-1沉淀剂
胎牛血清（FBS）Gibco Thermo Fisher, 巴西10270-106
37% 甲醛Fisher ScientificBP531-500
冰醋酸Sigma Aldrich, 德国A38S-500
戊二醛溶液 SigmaG7776
盐酸（HCl）Fisher Scientific, 德国A144-212
倒置显微镜Olympus, 日本
L-谷氨酰胺Gibco Thermo Fisher, 美国25030-024
间充质干细胞功能鉴定试剂盒 R&D systems Inc., MN, 美国SC006
酶标仪Chromate, Awareness Technologies, 美国
油红 O 染色液Sigma-Aldrich, 美国O0625
青霉素-链霉素-两性霉素Gibco Thermo Fisher, 美国15240062
磷酸盐缓冲液（1×），不含 Ca/MgLonza, 瑞士BE17-516F
摇床水浴箱Daihan Wisebath, 韩国
注射器滤器，0.2 微米Corning, 美国431224
透射电子显微镜JEM-1200EX II, Jeol, 德国
台盼蓝 Gibco Thermo Fisher, 美国15250061
胰蛋白酶-Versene-EDTA（1×）Lonza, 瑞士CC-5012
醋酸铀酰溶液（2%）Electron Microscopy Sciences, 美国22400-2
紫外-可见分光光度计Shimadzu, 日本
涡旋振荡器SciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, 英国 粒径分析仪

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