华通氏胶间充质干细胞及其衍生外泌体/小型细胞外囊泡的分离

摘要

脐带组织是一种丰富、易获取且无创的间充质干细胞（MSCs）来源。本方案详细介绍了人华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）的分离与鉴定步骤，随后提供了一种简便快速的分离其来源外泌体或小型细胞外囊泡的方法。

摘要

在再生医学领域，间充质干细胞（MSCs）引起了特别关注。来源于脐带（UC）组织（即华通胶）的MSCs已在多种应用中得到充分确立。与其他MSC来源相比，华通胶来源的间充质干细胞（WJ-MSCs）具有多项优势，且脐带通常作为医疗废物丢弃，因此WJ-MSCs的获取来源丰富。因此，WJ-MSCs不会引发类似于胚胎干细胞所涉及的伦理问题。本研究采用一种简单且可重复的组织块贴壁法从脐带组织中分离WJ-MSCs。分离后5至10天内，WJ-MSCs以贴壁细胞形式出现，呈成纤维细胞样形态。分离后细胞在14至18天内达到约80%的融合度。随后，在第3代时，通过诱导细胞向脂肪源性、成骨源性和软骨源性间充质谱系分化，对分离获得的WJ-MSCs进行全面表征。此外，还检测了阴性分化簇（CD）表面标志物（包括CD34、CD14和HLA-DR）以及典型的MSC表面标志物（如CD105、CD90、CD73和CD44）的免疫表型。进一步地，采用一种简单的沉淀试剂法从这些WJ-MSCs的条件培养基中分离外泌体/小细胞外囊泡（sEVs）。分离后的外泌体/sEVs通过透射电子显微镜进行观察，并利用颗粒粒径分析测定其平均大小。综上所述，WJ-MSCs提供了一种易于获取、无创且可再生的干细胞来源，可作为“工厂”用于生产外泌体/sEVs。这些WJ-MSCs及其衍生的外泌体/sEVs可在广泛的治疗及后续研究应用中发挥作用。

引言

几年前，干细胞曾被认为将在医学领域占据主导地位^1,2。然而，胚胎干细胞（ESCs）引发的伦理问题严重阻碍了该领域的快速发展³。这促使人们高度关注探索干细胞的其他可再生来源，尤其是那些可在出生后从脐带（UC）中分离获得的干细胞⁴。脐带在孕妇体内自然连接胎盘与胎儿。脐带的天然功能是通过血管为发育中的胎儿持续提供充足的血液供应，并在胎儿活动过程中防止血管发生扭转、受压或弯曲，从而保护这些血管⁵。从解剖学上看，人类脐带包含两条动脉和一条静脉，它们嵌入于黏液样结缔组织中，并被外层的羊膜上皮包裹⁶。包裹这三条脐带血管的基质，即黏液样结缔组织，被称为"华通胶"（Wharton's jelly，WJ），主要由蛋白聚糖和胶原蛋白构成⁷。

近年来，间充质干细胞（MSCs）因其在多种再生医学应用中展现出的有效性而受到广泛关注^7,8,9,....

方案

所有实验和操作均按照批准的指南进行，并获得了埃及开罗艾因夏姆斯大学药学院伦理委员会（ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220）和埃及开罗英国大学药学院伦理委员会（CL-2309）的批准。在获得父母（或监护人）签署的知情同意书后，获取了脐带组织。

1. 从人脐带中分离华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）

1. 在容器（密封收集袋）中放入约30–40 mL磷酸盐缓冲液（PBS），用于分娩后立即收集脐带（UC）（约15 cm长）。收集后的脐带应置于冰上保存，并在采集后最多4–5小时内进行处理。
   注意：样本在4-5小时后不可再处理，否则将显著降低间充质干细胞（MSCs）的得率。确保磷酸盐缓冲液（PBS）和容器无菌。
2. 制备WJ-MSCs的完全培养基，包含低糖Dulbecco改良Eagle培养基（LG-DMEM），并添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和0.25 µg/mL两性霉素B。
3. 在6孔板中每孔加入3 mL完全培养基，然后将含有培养基的6孔板置于CO₂培养箱中₂ 37 °C、5% CO₂ 培养箱₂ 预热并做好准备。
4. 在生物安全柜中，准备八个10 cm细胞培养皿，每个培养皿中加入10 mL无菌PBS。
5. 使用无菌镊子小心地将脐带（U....

结果

华通氏胶间充质干细胞的分离与表征

如所示 图3，成纤维细胞样小细胞最初在接种后5-10天内出现在华通胶组织块下方及周围图3A。这些释放出的WJ-MSCs会持续增殖，通常在分离后14–18天内达到约80%的融合度。值得注意的是，组织块在培养过程中会持续缩小，通常在分离当天接种于6孔板后约12–14天将其移除。在移除WJ组织块时，通常可在其下方观察到高密度生长的WJ-MSCs，此阶段记为P0，如图所示 图3B此外，必须指出的是，WJ-MSCs从其第1代开始即表现出均一的培养特性^st 传代图3C）。这些细胞持续生长为均质的、成纤维细胞样、贴壁生长的细胞，至少传代至第4.......

讨论

在本实验方案中，我们详细展示了从人脐带组织中分离华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）及其衍生外泌体/小细胞外囊泡（sEVs）的具体步骤。脐带是一种易于获取、尚未被充分开发且无创的MSC来源，其采集和处理无需特殊设备^{11,15,30,32,48}。目前已有多种方法用于从脐带组织中分离WJ-MSCs。通常情况下，主要采用组织块贴壁法^32,48和化学酶解消化法⁴⁹ 进行分离⁵⁰，这与本方案有所不同。有时也会结合机械法与酶消化法，使用胰蛋白酶、透明质酸酶或胶原酶处理后，将消化后的华通氏胶组织通过18G针.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿尔新蓝 8GX	Sigma-Aldrich, 美国	A3157
茜素红 S	Sigma-Aldrich, 美国	A5533
氢氧化铵	Fisher Scientific, 德国	1336-21-6
人 CD-105 抗体，FITC 标记	R&D systems Inc., MN, 美国	FAB10971F
人 CD-14 抗体，PE 标记	Beckman Coulter, 美国	IM0650U
人 CD-34 抗体，PE 标记	Beckman Coulter, 美国	IM1420
人 CD-44 抗体，PE 标记	Beckman Coulter, 美国	A32537
人 CD-73 抗体，PE 标记	R&D systems Inc., MN, 美国	FAB5795P
人 CD-90 抗体，PE 标记	R&D systems Inc., MN, 美国	FAB2067P
人 HLA-DR 抗体，FITC 标记	Beckman Coulter, 美国	IM1638U
双辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒	Thermofisher	23227
生物安全柜，层流，MSC Advantage	Thermo Scientific, 美国
CO2 培养箱，Direct Forma	Thermo Scientific, 美国
冷冻离心机	Sigma, 德国
冷冻离心机	Eppendorf, 德国
CytoFLEX 流式细胞仪	Beckman Coulter, FL, 美国
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher Scientific, 德国	BP231-100
DMEM - 低糖 1 g/L	Lonza, 瑞士	12-707F
DMEM/F12	Lonza, 瑞士	12-719F
无 DNA 酶/RNA 酶水	Gibco Thermo Fisher, 美国	10977-035
分子生物学级无水乙醇	Sigma-Aldrich, 德国	24103
ExoQuick-TC	System Biosciences (SBI), 美国	EXOTC50A-1	沉淀剂
胎牛血清（FBS）	Gibco Thermo Fisher, 巴西	10270-106
37% 甲醛	Fisher Scientific	BP531-500
冰醋酸	Sigma Aldrich, 德国	A38S-500
戊二醛溶液	Sigma	G7776
盐酸（HCl）	Fisher Scientific, 德国	A144-212
倒置显微镜	Olympus, 日本
L-谷氨酰胺	Gibco Thermo Fisher, 美国	25030-024
间充质干细胞功能鉴定试剂盒	R&D systems Inc., MN, 美国	SC006
酶标仪	Chromate, Awareness Technologies, 美国
油红 O 染色液	Sigma-Aldrich, 美国	O0625
青霉素-链霉素-两性霉素	Gibco Thermo Fisher, 美国	15240062
磷酸盐缓冲液（1×），不含 Ca/Mg	Lonza, 瑞士	BE17-516F
摇床水浴箱	Daihan Wisebath, 韩国
注射器滤器，0.2 微米	Corning, 美国	431224
透射电子显微镜	JEM-1200EX II, Jeol, 德国
台盼蓝	Gibco Thermo Fisher, 美国	15250061
胰蛋白酶-Versene-EDTA（1×）	Lonza, 瑞士	CC-5012
醋酸铀酰溶液（2%）	Electron Microscopy Sciences, 美国	22400-2
紫外-可见分光光度计	Shimadzu, 日本
涡旋振荡器	SciLogex
Zeta-sizer Nano ZN	Malvern Panalytical Ltd, 英国		粒径分析仪