本文介绍了一种用于测量气道巨噬细胞碳含量的详细实验方案，旨在评估个体暴露于颗粒物水平下的内部暴露剂量。
本文内容
摘要
摘要
肺泡巨噬细胞对颗粒物的吞噬作用呈现剂量依赖性。吞噬颗粒物后，这些巨噬细胞随痰液排出体外，使得在光学显微镜下可观察并定量巨噬细胞及其内含颗粒。值得注意的是，哺乳动物体内的元素碳仅来源于外界污染物。因此，气道巨噬细胞中的碳含量（CCAM）可作为有效的暴露生物标志物，准确评估个体对含碳颗粒物（PM）的暴露水平。本文阐述了一种包括痰液采集、保存、处理、制片、染色以及巨噬细胞图像获取与分析的实验方案。在去除巨噬细胞细胞核后，通过计算碳颗粒所占细胞质面积的比例（PCOC），以量化每个巨噬细胞内的碳含量。结果表明，在暴露于含碳颗粒物后，CCAM水平显著升高。综上所述，该方法具有无创性、精确性、可靠性和标准化特点，可直接测量靶细胞内的碳颗粒，适用于通过诱导痰液进行大规模个体CCAM的定量分析。
引言
环境空气污染与呼吸系统和心血管疾病导致的死亡有关，对人类健康构成严重威胁1,2。流行病学数据显示，长期暴露于直径小于或等于2.5 µm的环境颗粒物（PM2.5）可导致全球每年有400万至900万人过早死亡。在2015年全球疾病负担、伤害及危险因素研究（GBD）中，PM2.5被列为全球死亡的第五大重要风险因素3,4,5,6。研究发现，遵循世界卫生组织（WHO）的空气污染指南每年可避免51,213例因PM2.5暴露导致的死亡3。目前大多数研究缺乏对个体内部暴露的评估，仅基于较大区域监测站点的粗略评估，而这些数据远不能反映个体的实际暴露水平。现有的内暴露生物标志物，如尿液中的多环芳烃（PAHs）和苯并[a]芘，并不能反映颗粒物暴露与健康效应之间的关联7,8,9，从而导致无法建立与健康效应之间的准确关系。因此，寻找能够反映个体颗粒物暴露水平的标志物，是实现个体精准暴露评估的关键之一。
吸入支气管的颗粒物可通过支气管中的纤毛振荡随痰液排出体外。肺泡内缺乏纤毛黏液运输系统，因此进入肺泡的颗粒物主要通过巨噬细胞的吞噬作用和移位来清除10,11。根据肺的解剖结构，其对不溶性颗粒异物的清除速度较慢，这使得颗粒物能够与肺细胞长期相互作用，引发多种生物学效应，导致肺组织及其他器官的损伤12,13。颗粒物的刺激可导致巨噬细胞活化，触发肺部一系列炎症因子的释放，进而引起全身性炎症反应14。鉴于巨噬细胞吞噬作用在诱发肺部细胞因子风暴中的关键作用，理论上认为肺巨噬细胞中的碳颗粒可反映空气中以碳为核心颗粒物暴露的生物有效剂量15。此外，由于哺乳动物细胞内不会天然聚集元素碳，且含碳颗粒在光学显微镜下可被观察为黑色颗粒物，因此收集肺泡和支气管巨噬细胞并测定其碳含量，可作为评估颗粒物暴露的生物标志物16。
本研究确定了一种用于准确评估个体颗粒物暴露水平的方法，即气道巨噬细胞碳含量（Carbon Content of Airway Macrophages, CCAM）。具体而言，在受试者吸入由超声雾化器产生的高渗盐水后，收集其群体痰液样本，并使用固定液进行保存。随后分离气道巨噬细胞，经染色后在光学显微镜下拍照，以识别含有碳颗粒的巨噬细胞并进行定量分析。该方法为准确评估个体颗粒物暴露水平提供了一种生物学标志物，为研究颗粒物暴露与健康效应之间的关系建立了方法学基础，也为探索颗粒物暴露与肺部疾病等健康结局之间的关联提供了研究依据。
方案
本研究获得了中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制研究所医学伦理委员会的批准（编号：NIOHP201604），并在研究开始及生物样本采集前，从所有受试者处获得了书面知情同意。本研究选取了在炭黑工厂工作超过一年且暴露于炭黑气溶胶的炭黑包装工人。同时，从当地一家水厂招募了无明显职业性有害因素暴露的水厂工人作为对照人群，以建立本研究队列。研究人群的纳入与排除标准如下：炭黑包装工人的纳入标准包括在多数班次中直接接触炭黑，且在炭黑暴露区域工作至少一年；水厂工人的纳入标准为其工作环境中无职业性炭黑或其他污染物暴露。排除标准包括患有慢性疾病（如癌症）者、过去三个月内接受过X射线照射者、有肺结核病史、肺部手术史、病毒性心肌炎、先天性心脏病、近期发热或炎症者，以及近期使用过抗生素的工人。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 痰液保存
- 按照以下步骤配制固定液：
- 在水浴中熔化2%聚乙二醇（PEG1500）。取20 mL熔化的PEG1500置于离心管中，加入20 mL 50%乙醇，充分振荡混合，制成母液。
- 将40 mL母液缓慢倒入960 mL 50%乙醇中，充分振荡，形成Saccomanno固定液。将该溶液储存于阴凉避光处。
- 向含有约2 mL痰液的离心管中加入20–30 mL配制好的固定液，充分混匀。
注意：确保总体积不超过40 mL。 - 用封口膜密封离心管，储存于阴凉避光处。待准备就绪后，将离心管运送至实验室进行后续处理。
注意：PEG1500必须在水浴中熔化，并严格按照规定剂量使用。
2. 痰液中细胞悬液的制备
- 根据实际剂量，将 0.1 g 二硫苏糖醇溶解于 100 mL 生理盐水中，配制消化液。将配制好的溶液于 4 °C 保存，最多可保存 48 小时。
- 将含有痰液的离心管在 4 °C 条件下以 1,998 × g 离心 30 分钟。
- 弃去上清液。向沉淀中加入与痰液体积相等的消化液。充分涡旋并振荡混合物。
- 将离心管置于 37 °C 水浴中，直至完全液化（10–15 分钟）。
注意：液化过程中需持续振荡离心管。
- 将离心管置于 37 °C 水浴中，直至完全液化（10–15 分钟）。
- 使用 70 µm 滤膜过滤液化后的混合物。
- 将过滤后的溶液在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 7 分钟。
- 弃去上清液，保留细胞沉淀。
- 将细胞沉淀重悬于杜氏磷酸盐缓冲液中。将重悬后的溶液在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 7 分钟，以获得纯净的细胞沉淀。
3. 细胞涂片的制备
- 向细胞沉淀中加入 200–600 µL 磷酸盐缓冲液，充分混匀；根据细胞计数结果调整缓冲液体积（目标细胞密度为 >1.0 × 105 个细胞）。
- 取 20 µL 细胞悬液，采用血细胞比容法制作细胞涂片17。
- 将涂片自然晾干（48 小时内完成）。使用市售染色液固定涂片，固定时间为 10 秒。
- 将涂片浸入 A 染色液中染色 8 秒。染色过程中轻轻上下移动载玻片，并用流水冲洗掉多余染液。
- 将涂片浸入 B 染色液中染色 8 秒。染色时同样轻轻移动载玻片，并用流水冲洗去除多余染液。
注意：A 和 B 染色液均来自市售染色试剂盒。 - 将载玻片浸入无水乙醇中两次，每次 2–3 秒。
- 待载玻片干燥后，滴加适量中性树胶，加盖盖玻片封片。
4. CCAM 的定量分析
- 使用配备100倍油镜物镜的光学显微镜。随机选取染色良好且形态完整的巨噬细胞，拍摄其图像。每份样本随机拍摄50个巨噬细胞的图像。
- 在Image J软件中按以下步骤进行图像分析：
- 测量标尺并确定实际长度与像素之间的换算关系（282像素 = 10 µm）。在Image J中设置标尺（分析 > 设置标尺），输入像素距离、实际长度、长度单位（µm），并勾选全局选项。
- 使用不规则形状勾勒细胞轮廓。去除背景（自由选择工具，编辑 > 清除外部）。测量细胞的总面积（分析 > 测量）。
- 剪切出细胞核（编辑 > 剪切）。将灰度图像转换为黑白图像（图像 > 类型 > 8位）。
- 根据每种细胞染色的特定灰度值进行调整，以准确计数碳颗粒（图像 > 调整 > 阈值 > 应用，分析 >> 测量）。
- 基于Image J软件中的面积测量与图像分析，计算每份样本中50个巨噬细胞的碳含量。
结果
痰液经固定液保存和处理后，在光学显微镜下进行形态学检查时显示出完整的巨噬细胞形态。巨噬细胞具有清晰、圆形或肾形、易染色的细胞核。染色后，细胞核呈蓝紫色，而细胞质呈淡粉色或淡蓝色。显微视野中杂质极少，有利于细胞的识别。细胞内可见黑色碳颗粒以小团块形式明显存在，便于对碳颗粒进行定量分析。
痰液巨噬细胞的代表性图像见图1，显示不同细胞中碳颗粒数量的差异。图1A显示无碳颗粒，而图1D显示碳颗粒浓度最高。各巨噬细胞的碳负荷巨噬细胞百分比（CCAM）值分别为0.00%、2.24%、6.64%和34.61%（对应图中A-D）。在测定CCAM参数过程中，对每个巨噬细胞内的碳含量进行了定量评估，以减少因巨噬细胞大小差异以及碳颗粒与细胞核重叠所导致的偏差。每名研究对象共分析50个巨噬细胞的CCAM计算与结果，如图2所示。
本研究选取某乙炔炭黑厂的炭黑包装工人（CBP）作为暴露组，同时招募当地水厂无明显职业性有害因素暴露的水泵工人作为对照组（Non-CBP）。图2所示结果表明，炭黑包装工人的CCAM高于对照组。
图1：光学显微图像显示气道巨噬细胞内的碳颗粒。 胞质中的黑色部分代表碳颗粒。图中（A-D）展示了气道巨噬细胞的代表性图像，每个图像显示不同程度的碳颗粒负荷（CCAM）。图（A-D）中巨噬细胞的CCAM值分别为0.00%、2.24%、6.64%和34.61%。最高CCAM水平出现在图（D）中。比例尺：10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：人群中CCAM的定量水平。 每位研究对象随机选取50个胞质完整且染色良好的巨噬细胞进行分析和定量。数据采用Student t检验进行分析：*P < 0.05。CBP：碳黑包装工人；Non-CBP：对照组。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本研究提出了一种利用诱导痰来源的碳质颗粒物（CCAM）作为大气颗粒物内暴露生物标志物的详细实验方案。CCAM可通过光学显微镜进行检测和定量，是一种能够精确反映内暴露与健康效应关系的生物标志物。因此，有必要建立并优化一种简便、可靠且高效的诱导痰保存方法以及CCAM定量方法，以实现技术流程的标准化。
肺泡巨噬细胞碳含量的测定涉及多个步骤，包括肺泡巨噬细胞的采集、涂片、染色、拍照及图像分析。目前，采集肺泡巨噬细胞主要有两种方法：诱导痰法和肺灌洗法，每种方法各有其优缺点18,19。肺灌洗法可获得大量均一的肺泡巨噬细胞，但该方法属于有创取样，需麻醉及其他医疗条件支持，因此不适用于大规模人群采样。相比之下，诱导痰法操作简便、无创，适用于大规模普通人群采样，且可重复获取样本。肺灌洗法获得的巨噬细胞主要来源于肺泡或远端细支气管，而诱导痰法获得的巨噬细胞可能来源于气道。本研究中，我们按照欧洲呼吸学会发布的标准方案进行诱导痰采集20。
诱导痰的成功率受多种因素影响，包括雾化吸入盐水的浓度以及患者是否存在呼吸系统疾病21,22,23。痰样本中可能混入唾液，这会干扰巨噬细胞碳含量的测定，可能导致样本中气道巨噬细胞计数减少24。本研究中的操作流程已实现标准化，方法简便，且具有较高的可重复性。观察发现，雾化吸入气流大小、诱导时间是否充分以及诱导过程中是否存在间歇等因素均会影响诱导痰的成功率。这些因素对于确保将CCAM作为颗粒物暴露生物标志物进行准确可靠的测量至关重要。
Saccomanno 固定液由 50% 乙醇和 2% 聚乙二醇组成，通常用于固定保存支气管肺泡灌洗液等生物样本。在本研究中，首次利用该固定液保存来自流行病学现场调查所获取的痰液样本。结果表明，该方法可满足后续巨噬细胞内碳含量的定量分析需求，其效果类似于清晨留取痰液细胞以制备清晰的癌细胞涂片25。该操作流程已实现标准化，方法简便，且具有良好的可重复性。本研究中诱导痰液保存的优点包括：（1）固定液配制简便；（2）保存过程无需冷藏，便于开展大规模流行病学调查；（3）样本可置于阴凉避光处保存。染色后显微镜下视野清晰，细胞核清晰可辨，杂质极少，细胞形态完整。在细胞形态学保存方面，该方法优于直接痰液处理与涂片制备26。
关于实验方法，记录了以下细节：痰液在37 °C水浴中消化期间需定期振荡，直至完全液化。液化后，先用70 µm滤膜过滤，再进行离心，以去除杂质，获得更清晰的染色背景。细胞沉淀在涂片前需再次用DPBS洗涤。染色过程中通过流水冲洗载玻片以去除多余液体。在染液I和染液II之间更换载玻片架，防止残留。进行显微摄影时，随机选取形态完整且染色良好的巨噬细胞，这会影响CCAM定量结果27。
本研究可选用的定量分析软件包括 Image SXM 和 Image J28。Image SXM 在分析前需手动编辑图像以提高准确性，这显著延长了所需时间，且仅限于处理单一细胞类型。相比之下，本研究使用的 Image J 软件在图像处理方面具有更高的特异性及更广泛的兼容性。在其他学科中，高内涵筛选显微技术已被用于荧光标记细胞的筛选及后续分析，实现了自动化高通量操作。方法学研究的未来方向可能涉及开发针对痰液中巨噬细胞的自动标记及筛选流程29。在 Image J 处理过程中，影响 CCAM 测量结果的因素包括操作者对样本信息的了解程度以及灰度值阈值的设定。采用盲法可减少观察者偏倚，部分样本可能需要重复测量以评估可重复性。由两名具备高级专业水平的研究人员独立进行图像采集与分析，有助于提高巨噬细胞识别的准确性。
本研究采用美国国家职业安全与健康研究所（NIOSH）的标准方法，评估受试者对职业性颗粒物的暴露情况。对炭黑包装区域以及对照组水厂工作人员工作区域的细颗粒物（PM2.5）浓度和与PM2.5相关的元素碳（EC）含量进行了多次评估。高达99.6%的炭黑（CB）颗粒空气动力学直径小于2.5 µm，其中96.7%小于1.0 µm。2012年秋季，炭黑包装车间的PM2.5平均浓度为每立方米800微克，与PM2.5相关的元素碳浓度为每立方米657.0微克30,31。2018年秋季，炭黑的几何平均浓度为637.4 µg/m3，与PM2.5相关的元素碳浓度为364.6 µg/m3。在两次观测中，元素碳/总碳（EC/TC）比值均超过92.5%，这与炭黑几乎为纯元素碳的事实一致。因此，本研究可推断，巨噬细胞中的碳颗粒主要来源于炭黑暴露30,31。综上所述，本研究中暴露于炭黑人群的工作环境PM2.5浓度为637.4 µg/m3，显著高于对照人群工作环境的PM2.5浓度（130.0 µg/m3），约为对照组的五倍。暴露于炭黑人群的元素碳水平为364.6 µg/m3，远高于对照人群的2.0 µg/m3。
综上所述，本研究采用高渗盐水诱导痰液收集样本，获取肺泡巨噬细胞，制备细胞涂片，并对50个巨噬细胞内的碳含量进行定量，以中位数表示每个个体巨噬细胞碳含量水平。该研究方法可适用于大规模人群样本，用于准确评估个体对颗粒物的内暴露水平。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作受到国家自然科学基金（82273669、82241086、42207488）、山东省泰山学者计划（编号：tsqn202211121）以及山东省高等教育优秀青年学者创新与科技项目（2022KJ295）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3 mL 无菌吸管 | 上海翊圣生物科技有限公司 | 84202ES03 | |
| 50 mL 离心管 | Thermo Fisher Scientific, USA | 339652 | |
| 无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 64-17-5 | |
| 雪松油 | 上海麦克林生化科技有限公司 | C805296 | |
| Diff-quick 染色液 | 上海翊圣生物科技有限公司 | 40748ES76 | |
| 二硫苏糖醇 | 索莱宝生物技术有限公司 | D8220 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Thermo Fisher Scientific, USA | 14190144 | |
| 显微镜相机 | 日本奥林巴斯公司 | DP72 | |
| 中性树胶 | 索莱宝生物技术有限公司 | G8590 | |
| 尼龙滤膜 70 μm | BD Falcon Bioscience, USA | 211755 | |
| 光学显微镜 | 日本奥林巴斯公司 | BX60 | |
| 聚乙二醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 25322-68-3 | |
| 超速离心机 | Thermo Fisher Scientific, USA | SL40R | |
| 防脱载玻片 | 江苏世泰实验器材有限公司 | 188105 |
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