测量暴露于含碳颗粒物的气道巨噬细胞中的碳含量

Summary

本文介绍了一种详细的实验方案，用于测量气道巨噬细胞的碳含量，目的是评估单个颗粒物暴露水平的内部暴露剂量。

Abstract

肺巨噬细胞在吞噬颗粒中表现出剂量依赖性模式。吞噬后，这些巨噬细胞随后随痰液排泄，使巨噬细胞和颗粒在光学显微镜下可见且可量化。值得注意的是，哺乳动物体内的元素碳完全来自外部污染物。因此，气道巨噬细胞 （CCAM） 中的碳含量可作为有效的暴露生物标志物，准确估计个体暴露于含碳颗粒物 （PM）。本文描述了一个涉及痰液收集、保存、处理、载玻片制备和染色以及巨噬细胞照片采集和分析的方案。去除巨噬细胞核后，计算碳颗粒占据的细胞质面积比例 （PCOC） 以量化每个巨噬细胞中的碳含量。结果表明，暴露于含碳 PM 后 CCAM 水平升高。总之，这种非侵入性、精确、可靠和标准化的方法能够直接测量靶细胞内的碳颗粒，并用于通过诱导痰液对单个 CCAM 进行大规模定量。

Introduction

环境空气污染与呼吸系统和心血管疾病导致的死亡有关，对人类健康构成严重威胁 ^1,2。流行病学数据表明，长期暴露于直径小于或等于 2.5 微米的环境颗粒物 （PM2.5） 是导致全球 4 至 900 万人过早死亡的原因。在 2015 年全球疾病、伤害和风险因素负担研究 （GBD） 中，PM2.5 被列为全球死亡的第五大最重要风险因素3,4,5,6。研究发现，遵守 WHO 空气污染指南每年可以防止 51,213 人因暴露 PM2.5 而死亡³。目前，大多数研究缺乏对个体内暴露的评估，仅基于对较大区域监测点的粗略评估，这些监测点与个体暴露水平相去甚远。可用的内部暴露生物标志物，如尿 PAH 和苯并 （a） 芘，并不反映颗粒物暴露与健康影响之间的关联 ^7,8,9。这导致无法与健康影响建立准确的关系。因此，寻找反映个体颗粒物暴露水平的标志物是准确评估个体暴露的关键之一。

吸入支气管的颗粒可通过支气管中的纤毛振荡随痰液排泄。肺泡中缺乏纤毛粘液流转运系统意味着颗粒进入肺泡的主要清除途径是通过巨噬细胞的吞噬作用和易位^10,11。根据肺的解剖结构，它清除不溶性颗粒异物的速度很慢。这使得颗粒物能够与肺细胞长时间相互作用并引发各种生物效应，从而对肺组织和其他器官造成损害^12,13。颗粒物的刺激导致巨噬细胞活化，触发肺部炎症因子的级联反应，从而引起全身炎症反应¹⁴。考虑到巨噬细胞噬细胞在引发肺部细胞因子风暴中的关键作用，理论上，来自肺巨噬细胞的碳颗粒可以反映空气中碳核颗粒暴露的生物有效剂量¹⁵。此外，由于哺乳动物细胞中没有元素碳的聚集，并且在光学显微镜下可以观察到含碳颗粒物为黑色颗粒物，因此肺泡和支气管巨噬细胞的收集以及其中碳含量的测量可以作为评估颗粒物暴露的标志物¹⁶。

这项研究确定了一种准确评估单个颗粒物暴露水平的方法，称为气道巨噬细胞的碳含量 （CCAM）。具体来说，在参与者吸入超声波雾化器产生的高渗盐水后收集群体痰液样本。然后使用固定液保存这些样品。分离气道巨噬细胞，染色，并在光学显微镜下拍照，以鉴定含有含碳颗粒的巨噬细胞，然后对其进行定量。该方法为准确评估单个颗粒物暴露水平提供了生物标志物。它为研究颗粒物暴露与健康影响之间的关系建立了方法基础，作为探索颗粒物暴露与肺部疾病等健康结果之间关联的研究基础。

Protocol

该研究获得了中国疾病预防控制中心 （NIOHP201604） 职业健康与毒物控制研究所医学伦理委员会的批准，并在研究和生物样本采集之前获得了所有受试者的书面知情同意书。在这项研究中，选择了在炭黑工厂工作超过 1 年并接触炭黑气溶胶的炭黑封隔工。从当地招募了一家自来水厂的自来水工人作为对照人群，他们没有明显的职业暴露于有害因素中，以建立这项研究。为研究人群选择了以下纳入和排除标准:炭黑封隔器的纳入标准包括在大多数班次中直接接触炭黑以及在炭黑暴露区域至少工作一年。如果自来水工人在工作环境中没有职业接触炭黑或其他污染物，则他们被包括在内。排除标准包括患有癌症等慢性病的工人，过去三个月内接受过 X 射线暴露的工人，有肺结核、肺部手术、病毒性心肌炎、先天性心脏病、近期发热或炎症病史的个体，以及最近服用抗生素的工人。研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 保存痰液

1. 按照以下步骤制备固定液:
   1. 在水浴中熔化 2% 聚乙二醇 （PEG1500）。在离心管中取 20 mL 融化的 PEG1500。向离心管中加入 20 mL 50% 乙醇，并彻底摇动混合物以产生母液。
   2. 逐渐将 40 mL 母液倒入 960 mL 50% 乙醇中。充分摇动溶液以形成 Saccomanno 固定溶液。将溶液存放在阴凉、避光的地方。
2. 将 20-30 mL 制备的固定液添加到含有约 2 mL 痰液的离心管中。彻底混合内容物。
   注:确保总体积不超过 40 mL。
3. 用密封膜密封离心管。将其存放在阴凉、避光的地方。准备好后，将试管运送到实验室进行进一步处理。
   注意:始终PEG1500水浴中融化，并按照规定的剂量使用。

2. 痰液中细胞悬液的制备

1. 按实际剂量将 0.1 g 二硫苏糖醇溶解在 100 mL 生理盐水中制备消化液。将制备的溶液在 4 °C 下储存长达 48 小时。
2. 将含有痰液的试管在 4 °C 下以 1,998 x g 离心 30 分钟。
3. 丢弃上清液。向沉淀物中加入等体积的痰液消化物。涡旋并彻底摇晃混合物。
   1. 将试管置于 37 °C 水浴中直至完全液化（10-15 分钟）。
      注意:在液化过程中不断摇动试管。
4. 用 70 μm 滤膜过滤液化混合物。
5. 将过滤后的溶液在 4 °C 下以 500 x g 离心 7 分钟。
6. 弃去上清液，保留细胞沉淀物。
7. 在 Duchenne 磷酸盐缓冲液中重悬细胞沉淀物。将重悬溶液在 4 °C 下以 500 x g 离心 7 分钟，以获得纯细胞沉淀。

3. 细胞涂片的制备

1. 向细胞沉淀物中加入 200-600 μL 磷酸盐缓冲液。将内容物充分混合;根据细胞计数结果调整缓冲液体积（目标是 >1.0 × 10⁵ 个细胞）。
2. 取 20 μL 细胞悬液，使用血细胞比容法¹⁷ 制作细胞涂片。
3. 让涂片自然风干（48 小时内）。用市售染色溶液固定涂片 10 秒。
4. 将涂片浸入 A 染色溶液中 8 秒。染色过程中，轻轻上下提起载玻片，然后用流水冲洗掉多余的污渍。
5. 在 B 染色溶液中对涂片染色 8 秒。染色过程中提起玻片，并在流水下冲洗掉多余的污渍。
   注:染色液 A 和 B 可在市售染色试剂盒中找到。
6. 将载玻片浸入无水乙醇中两次，每次 2-3 秒。
7. 干燥后，涂抹适量的中性胶。用盖玻片密封载玻片。

4. CCAM 的定量分析

1. 使用带有 100 倍油镜物镜的光学显微镜。捕获随机选择、染色良好且形态完整的巨噬细胞的图像。每个样品随机拍摄 50 张巨噬细胞图片。
2. 按照以下步骤在 Image J 软件中执行图像分析:
   1. 测量比例并确定实际长度和像素到像素的转换 （282 像素 = 10 μm）。在图像 J 中设置比例（分析>设置比例），输入 以像素为单位的距离 、 实际长度、长度单位 （μm） 和刻度 全局。
   2. 使用不规则形状勾勒出单元格的轮廓。删除背景（手绘选区、 编辑>清除外部）。测量细胞的总面积（分析>测量）。
   3. 切出细胞核 （Edit > Cut）。将灰度图像转换为黑白图像（图像>类型 > 8 位）。
   4. 调整特定于每个细胞染色的灰度值，以实现准确的碳颗粒计数（图像>调整阈值>>应用、分析>>测量）。
   5. 根据 Image J 软件中的测量面积和图像分析计算每个样品 50 个巨噬细胞的碳含量。

Results

在形态学检查期间，用固定液保存和处理的痰液在光学显微镜下显示完整的巨噬细胞形态。巨噬细胞表现出透明、圆形或肾形、易染色的细胞核。染色后，细胞核呈蓝紫色，而细胞质呈浅粉色或浅蓝色。显微镜区域显示杂质极少，便于细胞识别。在细胞内，黑碳颗粒在小聚集体中清晰可见，从而能够对碳颗粒进行定量分析。

痰巨噬细胞的代表性图像如图 1 所示，描绘了不同细胞中不同数量的碳颗粒。例如，图 1A 显示没有碳颗粒，而图 1D 显示浓度最高。巨噬细胞 （A-D） 的 CCAM 值分别为 0.00% 、 2.24% 、 6.64% 和 34.61%。在 CCAM 参数测定过程中，对每个巨噬细胞中的碳含量进行定量评估，以减轻因巨噬细胞大小变化和碳颗粒与细胞核重叠而引起的偏差。对每个研究对象的 50 个巨噬细胞进行 CCAM 计算和分析，如图 2 所示。

该研究选择了来自特定乙炔炭黑工厂的炭黑封隔工 （CBP） 作为暴露组，并从当地水厂招募了没有明显职业暴露于有害因素的水泵工人作为对照组 （Non-CBP）。 图 2 所示的结果表明，与对照组相比，炭黑包装工人的 CCAM 更高。

图 1:显示气道巨噬细胞内碳颗粒的光学显微图像。细胞质中的黑色代表碳颗粒。面板 （A-D） 描绘了气道巨噬细胞的代表性图像，每个图像都表现出不同水平的 CCAM。（A-D） 中巨噬细胞的 CCAM 值分别为 0.00% 、 2.24% 、 6.64% 和 34.61%。在 （D） 中观察到最高的 CCAM 水平。比例尺:10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:人群中 CCAM 的定量水平。 随机选择 50 个细胞质完整且染色良好的巨噬细胞，用于每个研究对象的分析和定量。使用 Student t 检验分析数据:*P < 0.05。CBP:炭黑封隔剂;非 CBP:对照组。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

本研究提出了一种详细的实验方案，用于使用诱导痰衍生的 CCAM 作为内部暴露于大气颗粒物的生物标志物。CCAM 可以通过光学显微镜进行检测和量化，作为反映与健康影响关系的精确内部暴露生物标志物。因此，需要建立和优化一种方便、可靠、高效的诱导痰保存方法和 CCAM 定量方法，以标准化方法学程序。

肺巨噬细胞碳含量的测定涉及几个步骤，包括肺巨噬细胞的收集、涂片、染色、拍照和图像分析。目前，收集肺巨噬细胞的方法有两种:诱导痰和肺灌洗，各有其优点和局限性^18,19。肺灌洗可以产生许多均匀的肺巨噬细胞，但这是一种需要麻醉和其他医疗条件的创伤性取样方法。因此，它不适合大规模的一般总体采样。相比之下，诱导痰易于实施、无创，适用于一般人群的大规模采样。它还允许获得重复样本。肺灌洗从肺泡或远端细支气管获得巨噬细胞，而诱导痰获得可能源自气道的巨噬细胞。在这项研究中，我们按照欧洲呼吸学会²⁰ 发布的标准方案进行了诱导痰。

诱导痰的成功率受多种因素影响，包括雾化吸入盐水的浓度和患者是否存在呼吸系统疾病 21,22,23。痰液样本也可能含有唾液，唾液会干扰巨噬细胞碳含量的测量，从而可能减少样本中气道巨噬细胞的数量²⁴。本研究的作程序标准化，方法简单明了，重现性高。据观察，雾化吸入流速的大小、诱导时间的充足性以及诱导过程中间隔的存在等因素都会影响诱导痰的成功率。这些考虑因素对于确保准确可靠地测量 CCAM 作为颗粒物暴露的生物标志物非常重要。

Saccomanno 固定液由 50% 乙醇和 2% 聚乙二醇组成，通常用作保存生物样品（如支气管肺泡灌洗液）的固定剂。在这项研究中，这种固定液首次用于保存从流行病学现场调查中获得的痰液。结果符合随后对巨噬细胞中碳的定量，类似于在早上保存痰细胞以获得清晰的癌细胞涂片²⁵。作程序标准化，方法简单明了，重现性高。本研究中诱导保存痰液的优点包括 （1） 固定剂配置简单，（2） 保存无需冷藏，便于大规模流行病学调查，以及 （3） 样本可以保存在避光阴凉处。染色后在显微镜下观察清晰，细胞核可识别，杂质极少，细胞形态完整。就形态学而言，这优于直接痰液处理和涂片应用²⁶。

关于实验方法，记录了以下细节:在 37 °C 水浴中消化过程中定期摇晃痰液，直至完全液化。液化后，在离心前在 70 μm 膜上进行过滤，以去除杂质以获得更清晰的染色背景。在涂抹在载玻片上之前，再次用 DPBS 洗涤细胞沉淀物。染色过程中用流水清洗玻片去除多余的液体。在染色剂 I 和染色剂 II 之间更换玻片架以防止残留。对于摄影，随机选择形态完整且染色良好的巨噬细胞，影响 CCAM 定量²⁷。

本研究的定量分析软件选项包括 Image SXM 和 Image J²⁸。Image SXM 需要在分析之前手动编辑图像以提高准确性，这大大延长了所需的时间。它还仅限于处理单一细胞类型。相比之下，本研究中使用的 Image J 软件在图像处理方面具有更好的特异性和更广泛的兼容性。在其他学科中，高内涵筛选显微镜方法已被用于荧光标记细胞的选择和后续分析，实现自动化高通量作。方法学研究的未来方向可能涉及开发痰液中巨噬细胞的自动标记和筛选程序²⁹。在图像 J 处理过程中，影响 CCAM 测量的因素包括测量者对样品信息的了解和灰度值阈值的确定。采用盲法方法可以减少观察者偏差，并且可能需要重复测量一些样品以评估可重复性。由两名具有高水平专业知识的个体进行独立图像采集和分析可以提高巨噬细胞鉴定的准确性。

该研究采用了美国国家职业安全与健康研究所 （NIOSH） 的标准方法来评估受试者对职业颗粒物的暴露情况。对炭黑包装区和对照组水厂工人工作区域的细颗粒物 （PM2.5） 水平和 PM2.5 相关元素碳 （EC） 含量进行了多次评估。高达 99.6% 的炭黑 （CB） 颗粒的空气动力学直径小于 2.5 μm，96.7% 的炭黑 （CB） 颗粒小于 1.0 μm。2012 年秋季，CB 包装设施的平均 PM2.5 水平为每立方米 800 微克，PM2.5 相关 EC 水平为每立方米 657.0 微克^30,31。2018 年秋季，CB 的几何平均值为 637.4 μg/m 3，PM2.5 相关 EC 水平为 364.6 μg/m³。在两次观察中，EC/TC 比率都超过 92.5%，这与 CB 几乎是纯 EC 的事实一致。因此，从这项研究可以推断出，巨噬细胞中的碳颗粒主要来自暴露于炭黑^30,31。结果，本研究中暴露于炭黑的人群工作环境中的 PM2.5 浓度为 637.4 μg/m³，显著高于对照人群工作环境中的 PM2.5 浓度（130.0 μg/m³），比对照人群高出约 5 倍。暴露于炭黑人群中的元素碳水平为 364.6 μg/m³，远高于对照人群的 2.0 μg/m³。

综上所述，本研究利用高渗盐水诱导的痰液采集样本，获取肺巨噬细胞，制作细胞涂片，量化 50 个巨噬细胞内的碳含量，用中位数表示每个个体的巨噬细胞碳含量水平。这种研究方法可以适用于大规模人群样本，并用于准确评估个体内部暴露于颗粒物的水平。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL 无菌吸管	上海亿讯生物科技有限公司	84202ES03
50 mL 离心管	Thermo Fisher Scientific， USA	339652
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司	64-17-5
雪松油	上海麦克莱恩生化科技有限公司	C805296
Diff-快速染色解决方案	上海亿讯生物科技有限公司	40748ES76
二硫苏糖醇	Solebo Bio Co.， LTD	D8220
杜氏磷酸盐缓冲液 （DPBS）	Thermo Fisher Scientific， USA	14190144
显微镜相机	日本奥林巴斯公司	DP72
中性树胶	Solebo Bio Co.， LTD	G8590
尼龙滤膜 70um	BD 美国猎鹰生物科学	211755
光学显微镜	日本奥林巴斯公司	BX60
聚乙二醇	国药集团化学试剂有限公司	25322-68-3
超速离心机	美国赛默飞世尔科技	SL40R
粘性载玻片	江苏实泰实验设备有限公司