本文介绍了一种用于测量气道巨噬细胞碳含量的详细实验方案，旨在评估个体暴露于颗粒物水平下的内部暴露剂量。
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本文内容
摘要
摘要
肺泡巨噬细胞对颗粒物的吞噬作用呈现剂量依赖性。吞噬颗粒物后，这些巨噬细胞随痰液排出体外，使得在光学显微镜下可观察并定量巨噬细胞及其内含颗粒。值得注意的是，哺乳动物体内的元素碳仅来源于外界污染物。因此，气道巨噬细胞中的碳含量（CCAM）可作为有效的暴露生物标志物，准确评估个体对含碳颗粒物（PM）的暴露水平。本文阐述了一种包括痰液采集、保存、处理、制片、染色以及巨噬细胞图像获取与分析的实验方案。在去除巨噬细胞细胞核后，通过计算碳颗粒所占细胞质面积的比例（PCOC），以量化每个巨噬细胞内的碳含量。结果表明，在暴露于含碳颗粒物后，CCAM水平显著升高。综上所述，该方法具有无创性、精确性、可靠性和标准化特点，可直接测量靶细胞内的碳颗粒，适用于通过诱导痰液进行大规模个体CCAM的定量分析。
引言
环境空气污染与呼吸系统和心血管疾病导致的死亡有关，对人类健康构成严重威胁1,2。流行病学数据显示，长期暴露于直径小于或等于2.5 µm的环境颗粒物（PM2.5）可导致全球每年有400万至900万人过早死亡。在2015年全球疾病负担、伤害及危险因素研究（GBD）中，PM2.5被列为全球死亡的第五大重要风险因素3,4,5,6。研究发现，遵循世界卫生组织（WHO）的空气污染指南每年可避免51,213例因PM2.5暴露导致的死亡3。目前大多数研究缺乏对个体内部暴露的评估，仅基于较大区域监测站点的粗略评估，而这些数据远不能反映个体的实际暴露水平。现有的内暴露生物标志物，如尿液中的多环芳烃（PAHs）和苯并[a]芘，并不能反映颗粒物暴露与健康效应之间的关联7,8,9，从而导致无法建立与健康效应之间的准确关系。因此，寻找能够反映个体颗粒物暴露水....
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方案
本研究获得了中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制研究所医学伦理委员会的批准（编号：NIOHP201604），并在研究开始及生物样本采集前，从所有受试者处获得了书面知情同意。本研究选取了在炭黑工厂工作超过一年且暴露于炭黑气溶胶的炭黑包装工人。同时，从当地一家水厂招募了无明显职业性有害因素暴露的水厂工人作为对照人群，以建立本研究队列。研究人群的纳入与排除标准如下：炭黑包装工人的纳入标准包括在多数班次中直接接触炭黑，且在炭黑暴露区域工作至少一年；水厂工人的纳入标准为其工作环境中无职业性炭黑或其他污染物暴露。排除标准包括患有慢性疾病（如癌症）者、过去三个月内接受过X射线照射者、有肺结核病史、肺部手术史、病毒性心肌炎、先天性心脏病、近期发热或炎症者，以及近期使用过抗生素的工人。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 痰液保存
- 按照以下步骤配制固定液：
- 在水浴中熔化2%聚乙二醇（PEG1500）。取20 mL熔化的PEG1500置于离心管中，加入20 mL 50%乙醇，充分振荡混合，制成母液。
- 将40 mL母液缓慢倒入960 mL 50%乙醇中，充分振荡，形成Saccomanno固定液。将该溶液储存于阴凉避光处。
- 向含有约2 mL痰液的离心管中加入20–30 mL配制好的固定液，充分混匀。
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结果
痰液经固定液保存和处理后，在光学显微镜下进行形态学检查时显示出完整的巨噬细胞形态。巨噬细胞具有清晰、圆形或肾形、易染色的细胞核。染色后，细胞核呈蓝紫色，而细胞质呈淡粉色或淡蓝色。显微视野中杂质极少，有利于细胞的识别。细胞内可见黑色碳颗粒以小团块形式明显存在，便于对碳颗粒进行定量分析。
痰液巨噬细胞的代表性图像见图1，显示不同细胞中碳颗粒数量的差异。图1A显示无碳颗粒，而图1D显示碳颗粒浓度最高。各巨噬细胞的碳负荷巨噬细胞百分比（CCAM）值分别为0.00%、2.24%、6.64%和34.61%（对应图中A-D）。在测定CCAM参数过程中，对每个巨噬细胞内的碳含量进行了定量评估，以减少因巨噬细胞大小差异以及碳颗粒与细胞核重叠所导致的偏差。每名研究对象共分析50个巨噬细胞的CCAM计算与结果，如
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讨论
本研究提出了一种利用诱导痰来源的碳质颗粒物（CCAM）作为大气颗粒物内暴露生物标志物的详细实验方案。CCAM可通过光学显微镜进行检测和定量，是一种能够精确反映内暴露与健康效应关系的生物标志物。因此，有必要建立并优化一种简便、可靠且高效的诱导痰保存方法以及CCAM定量方法，以实现技术流程的标准化。
肺泡巨噬细胞碳含量的测定涉及多个步骤，包括肺泡巨噬细胞的采集、涂片、染色、拍照及图像分析。目前，采集肺泡巨噬细胞主要有两种方法：诱导痰法和肺灌洗法，每种方法各有其优缺点18,19。肺灌洗法可获得大量均一的肺泡巨噬细胞，但该方法属于有创取样，需麻醉及其他医疗条件支持，因此不适用于大规模人群采样。相比之下，诱导痰法操作简便、无创，适用于大规模普通人群采样，且可重复获取样本。肺灌洗法获得的巨噬细胞主要来源于肺泡或远端细支气管，而诱导痰法获得的巨噬细胞可能来源于气道。本研究中，我们按照欧洲呼吸学会发布的标准方案进行诱导痰采集20。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作受到国家自然科学基金（82273669、82241086、42207488）、山东省泰山学者计划（编号：tsqn202211121）以及山东省高等教育优秀青年学者创新与科技项目（2022KJ295）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3 mL 无菌吸管 | 上海翊圣生物科技有限公司 | 84202ES03 | |
| 50 mL 离心管 | Thermo Fisher Scientific, USA | 339652 | |
| 无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 64-17-5 | |
| 雪松油 | 上海麦克林生化科技有限公司 | C805296 | |
| Diff-quick 染色液 | 上海翊圣生物科技有限公司 | 40748ES76 | |
| 二硫苏糖醇 | 索莱宝生物技术有限公司 | D8220 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Thermo Fisher Scientific, USA | 14190144 | |
| 显微镜相机 | 日本奥林巴斯公司 | DP72 | |
| 中性树胶 | 索莱宝生物技术有限公司 | G8590 | |
| 尼龙滤膜 70 μm | BD Falcon Bioscience, USA | 211755 | |
| 光学显微镜 | 日本奥林巴斯公司 | BX60 | |
| 聚乙二醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 25322-68-3 | |
| 超速离心机 | Thermo Fisher Scientific, USA | SL40R | |
| 防脱载玻片 | 江苏世泰实验器材有限公司 | 188105 |
参考文献
- Münzel, T., et al. Environmental stressors and cardio-metabolic disease: part I-epidemiologic evidence supporting a role for noise and air pollution and effects of mitigation strategies. Eur Heart J. 38 (8), 550-556 (2017).
- Guarnieri, M., et al.
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重印与许可
