利用电容式生物传感器进行动态多参数血小板功能评估

摘要

本文介绍了一种利用电容式生物传感器进行新型动态多参数血小板功能检测的实验方案。该方法在半刚性微环境中设计，以增强生理相关性，可提供三个对血小板计数、刺激强度和活化通路敏感的输出参数。

摘要

血小板通过一系列受调控的反应在血液凝固中发挥基础性作用，包括黏附、铺展、颗粒分泌、聚集以及细胞骨架收缩。然而，目前的检测方法仅能在非生理条件下对血小板功能进行部分分析。因此，亟需一种能够更真实反映生理环境下血小板功能动态性和多面性的改进检测方法。在此背景下，本文介绍了一种新方法，相较于传统检测手段，该方法可在更接近生理条件的体外半刚性微环境中测量多个与血小板功能相关的关键参数。该方法采用一种先进的电学生物传感器——膜电容传感器（MCS），通过三种不同的读数方式，为凝血过程提供独特的洞察。这些读数对血小板计数、刺激强度以及特定激活通路的变化具有高度敏感性。作为一种纯电学传感平台，MCS在检测初级止血功能障碍、评估治疗干预效果以及深入理解血小板在止血和血栓形成中的作用方面展现出重要的诊断潜力。

引言

血小板是一类特化的血细胞，在血管损伤后启动止血反应以阻止出血，并促进血管修复过程中发挥关键作用¹。此外，血小板还在血栓形成中充当重要介质，而血栓形成是全球范围内导致血栓栓塞性疾病死亡的主要原因^2,3,4,5,6。当发生血管损伤时，血小板会经历一系列复杂、受调控且多阶段的功能过程，包括黏附于内膜基质、胞内钙离子 influx 引发血小板构象改变、活化、颗粒分泌、聚集以及细胞骨架收缩，最终形成并稳定止血栓子，封闭受损部位以防止出血^7,8。尽管抗血小板药物和治疗策略已取得显著进展^9,10,11，血栓形成的风险仍然存在。抗血小板治疗的管理面临诸多挑战，包括医源性出血风险、在维持止血功能的同时实现抗血栓疗效的困难，以及患者对药物反应的个体差异，包括药物抵抗现象

方案

本研究方案已获得华盛顿大学机构审查委员会（UW-IRB；研究编号：STUDY00005211）人类受试者分部（HSD）的批准。所有参与本研究的志愿者均签署了书面知情同意书。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 膜电容传感器（MCS）的制备步骤

注意：MCS 传感器采用传统的微加工技术制备而成。该生物传感器由顶部（T-）和底部（B-）膜电容芯片（MCC）组成。简而言之，制备步骤如图1所示。

1. T-MCC 微加工步骤（图1A)
   1. 使用标准的CAD布局软件为4英寸硅片衬底设计T-MCC的布局。
   2. 使用标准掩模制备工艺将设计转移至铬玻璃光掩模上^29,30.
   3. 在一块洁净的双面抛光硅基底（400 µm 厚）上沉积 500 nm 厚的 Si₃N₄ 采用标准的低压化学气相沉积（LPCVD）技术³¹使用手动匀胶机以2000 rpm转速旋涂AZ ....

结果

本研究旨在对血小板功能进行动态评估。按照上述方案制备c-PRP溶液后，将血小板接种至T-MCC中纤维连接蛋白（Fn）包被的电极上。通过洗涤步骤去除未贴壁的游离血小板，随后加入激动剂以激活已贴壁的血小板。详细结果与讨论可参见我们此前的报告²⁸。

图 4A 代表预定血小板计数（250 x 10）的富血小板血浆（c-PRP）溶液的实验结果³ 血小板 µL^-1）。在测量的黏附阶段（图 4B)，电容随时间线性下降。在用凝血酶激活附着的血小板后（终浓度：3.5 U/mL^-1），电容读数呈指数下降并趋于稳定状态（图4C）。按照上述数据处理方案所述步骤，三种不同的信号标记名称 ΔC_adh，ΔC_活动, 和 ΔS_{活动.......}

讨论

本研究开创了一种基于电容的新型血小板功能评估方法，可在单一装置内同时评估血小板的黏附性及激活后的动态行为，这是首次报道此类方法。该新型实验方案引入了一种相对简便的技术，通过洗涤步骤消除纤维蛋白形成和血浆凝血因子的影响，从而获得能够区分多种影响血小板功能因素的测量结果。与传统的基于光学的检测方法相比，这种电容传感器有望通过整合黏附和聚集特性，实现对血小板功能更动态的评估。尤为重要的是，它具备以独特模式检测多种血小板功能障碍的能力，使其区别于现有的评估方法。

通过采用微加工技术、标准化测试方案以及全面的数据分析，所提出的传感器系统能够实现对血小板功能的动态多参数评估，确保高准确性、可靠性和稳定性。该系统实现了简化的校准与表征流程，任意随机选取的传感器所得校准值可普遍适用于整批大规模生产的设备。此外，芯片设计保护了底部硅芯片免受生物样本污染，使其可重复用于多次测量，从而减少系统一次性耗材的使用。血小板检测中的关键步骤是洗脱程序（步骤5.4），即移除30 µL的富血小板血浆（c-PRP）并补充血小板无Tyrode缓冲液。此步骤至关重要，可确保在血小板激活后无额外血小板附着于电极或微血栓上，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-十二硫醇	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	471364-100ML	1 mM
200度乙醇	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	EX0276-1
3D打印机	深圳市创想三维科技有限公司	Ender-3 V3
3D打印材料	HATCHBOX 3D, CA, U.S.A	3D PLA-1KG-1.75
腺苷5′-二磷酸	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F	ADP
阿司匹林	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	A2093-100G
深反应离子刻蚀	Omega Engineering, Inc.	SPTS Rapier DRIE
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	D8418-50ML	DMSO
高真空沉积系统	CHA	SEC-600
人纤维连接蛋白	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P1767-250G
LCR表	Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.A	Keithley EL 4980AL
LCR表探针夹具	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCA-50-4
掩模对准系统	ABM, U.S.A, Inc.	ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
微位移调节器	Signatone, CA, U.S.A	S-725
针式探针	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCAT5T-4	12.5 μm 半径
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P4474-1L	PBS, pH 7.4
反应离子刻蚀	Plasma-Therm,U.S.A	RIE Vision 320
硅基片	Wafer World Inc	SKU# 1766
标准3.2%枸橼酸钠试管	Tiger Medical, NJ, U.S.A.	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
凝血酶	Enzyme Research Laboratories, U.S.A	HT 1002a
替格瑞洛	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	PHR2788-400MG
Tyrode’s缓冲液	Boston Bioproducts, U.S.A	BSS-375
紫外光刻胶	AZ电子材料公司, NC, U.S.A.	AZ 9260	15μm