使用电容式生物传感器进行动态多参数血小板功能评估

Summary

这里介绍了一种使用电容式生物传感器的新型动态多参数血小板功能测定的方案。这种方法在半刚性微环境中设计以增强生理相关性，提供对血小板计数、刺激强度和激活途径敏感的三个输出参数。

Abstract

血小板通过一系列调节反应在血液凝固中发挥重要作用，包括粘附、扩散、颗粒分泌、聚集和细胞骨架收缩。然而，目前的检测仅限于非生理条件下血小板功能的部分分析。因此，需要一种改进的检测方法，以反映生理环境中血小板功能的动态和多方面性质。在这种情况下，引入了一种新方法来测量与传统测定相比，在生理相关性更强的离体半刚性微环境中测量与血小板功能相关的几个关键参数。该方法利用先进的电生物传感器，即膜电容传感器 （MCS），通过三个不同的读数提供对凝血过程的独特见解。这些读数对血小板计数、刺激强度和特异性激活途径的变化高度敏感。作为一个纯电传感平台，MCS 作为检测原发性止血功能障碍、评估治疗效果以及促进对血小板在止血和血栓形成中的作用的更广泛理解，显示出巨大的潜力。

Introduction

血小板是专门的血细胞，在协调止血反应以阻止受伤后出血和促进血管愈合方面发挥着关键作用¹。此外，它们还是血栓形成的关键介质，血栓形成是全球血栓栓塞性疾病相关死亡的主要原因 ^2,3,4,5,6。当发生血管损伤时，血小板会经历一系列复杂、受调节和多阶段的功能过程。这些包括粘附在内膜基质上、细胞内钙的流入触发血小板构象变化、激活、颗粒分泌、聚集和细胞骨架收缩，最终形成和稳定止血栓以密封受损部位并防止出血 ^7,8。尽管抗血小板药物和治疗策略取得了重大进展 ^9,10,11，^但血栓形成风险仍然存在。抗血小板治疗管理带来了挑战，包括医源性出血的风险、难以在维持止血的同时实现抗血栓疗效以及患者反应的可变性，包括耐....

Protocol

该研究提案得到了华盛顿大学内部审查委员会 （UW-IRB;研究编号:STUDY00005211）。所有参与研究的志愿者受试者都提供了书面知情同意书。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 膜电容式传感器 （MCS） 的制造步骤

注意:MCS 传感器是利用传统的微纳加工技术制造的。该生物传感器由顶部 （T-） 和底部 （B-） 膜电容芯片 （MCC） 组成。简而言之，制造步骤如图 1 所示。

1. T-MCC 的微细加工步骤（图 1A）
   1. 使用标准 CAD 布局软件为 4 英寸硅晶片衬底设计 T-MCC 的布局。
   2. 使用标准掩模制造工艺^29,30 将设计转移到铬玻璃光掩模上。
   3. 在干净的双面抛光硅衬底（400μm 厚）上，使用标准低压化学气相沉积 （LPCVD） 技术沉积 500 nm 厚的 Si₃N₄

Results

本研究旨在对血小板功能进行动态评估。按照上述方案，制备 c-PRP 溶液，并将血小板接种到 T-MCC 中的 Fn 包被电极上。通过洗涤步骤洗掉自由漂浮的血小板，并加入激动剂以激活附着的血小板。详细的结果和讨论可以在我们之前的报告²⁸ 中找到。

图 4A 表示具有预定血小板计数（250 x 10³ 个血小板 ^μL-1）的 c-PRP 溶液的结果。在测量的粘附阶段（图 4B），电容随时间线性减小。用凝血酶（终浓度:3.5 U ^mL-1）激活附着的血小板后，电容读数呈指数下降至稳态（图 4C）。按照上述数据分析方案，获得了三种不同的信号标记名称 ΔC_adh 、 ΔC_act 和 ΔS_act .......

Discussion

这项研究开创了一种基于电容的新型血小板功能评估方法，该方法在单个设备中评估粘附和激活后血小板动力学，标志着这种方法的第一个报道实例。新颖的实验方案引入了一种相对简单的技术，通过冲洗程序抵消纤维蛋白形成和血浆凝血因子的影响。这导致测量能够识别影响血小板功能的各种因素。与传统的基于光学的评估分析相比，这种电容传感器有望通过整合粘附和聚集的各个方面来提供更动态的血小板功能评估。重要的是，它展示了以独特模式检测各种血小板功能障碍的能力，使其有别于现有的评估方法。

通过采用微纳加工技术、标准化测试方案和全面的数据分析，所提出的传感器系统能够对血小板功能进行动态多参数评估，确保高精度、可靠性和稳定性。由于来自任何随机选择的传感器的校准值都可以普遍应用于整批批量生产的设备，因此可以简化校准和表征过程。此外，芯片设计可保护底部硅芯片免受生物样品污染，使其可重复用于多次测量，并最大限度地减少系统一次性用品。血小板测定的一个关键步骤是洗脱程序（步骤 5.4），其中去除 30 μL c-PRP 并补充不含血小板的 Tyrode 缓冲液。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-十二硫醇	Sigma-Aldrich， MO， U.S.A	471364-100ML	1 mM
200 度乙醇	Sigma-Aldrich， MO， U.S.A	EX0276-1
3D 打印机	Shenzhen Creality 3D Technology Co.， Ltd.	Ender-3 V3
3D打印材料	HATCHBOX 3D，加利福尼亚州，美国 3D	PLA-1KG-1.75
腺苷 5′-二磷酸	Sigma Aldrich，美国	01905-250MG-F
ADP 阿司匹林	Sigma-Aldrich， MO， U.S.A	A2093-100G
深反应离子蚀刻	Omega Engineering， Inc.	SPTS 剑杆 DRIE
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich，密苏里州，美国	D8418-50ML	DMSO
高真空沉积系统	CHA	SEC-600
人纤连蛋白	Sigma-Aldrich， MO， U.S.A	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich， MO， U.S.A	P1767-250G
LCR meter	Keithley Instruments， Inc.， OH， U.S.A	Keithley EL 4980AL
LCR 仪表支架	Signatone Corporation， CA， U.S.A	SCA-50-4
掩模对准系统	ABM， U.S.A， Inc.	ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
微型定位器	Signatone， CA， U.S.A	S-725
针形探针	Signatone Corporation， CA， U.S.A	SCAT5T-4	12.5 μm 半径
磷酸盐缓冲盐水	Sigma-Aldrich，密苏里州，美国	P4474-1L	PBS，pH 7.4
反应离子蚀刻	等离子体热，美国	RIE Vision 320
硅衬底	Wafer World Inc	SKU# 1766
标准 3.2% 柠檬酸盐管	Tiger Medical，新泽西州，美国	Covidien / Cardinal Health 8881340478 美国单射
凝血酶	研究实验室	HT 1002a
替格瑞洛	Sigma-Aldrich，美国密苏	PHR2788-400MG
Tyrode's 缓冲液	美国波士顿生物制品	BSS-375
紫外光刻胶	AZ 电子材料公司	AZ 9260	15 微米