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方法文章

培养与囊性纤维化相关的多微生物生物膜以研究群落表型

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DOI：

10.3791/66785

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2024年4月19日

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

本文内容

摘要

本方案描述了一种与囊性纤维化（CF）肺部相关的四物种多微生物生物膜模型，可用于探究细菌种间相互作用的影响。

摘要

大多数 体外 模型无法充分探究在真实生活环境的复杂相互作用中出现的细菌表型。这一点在囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者气道中检测到的难治性、慢性、多微生物生物膜感染背景下尤为突出，CF 是一种累及多器官的遗传性疾病。尽管多项微生物组研究已明确了囊性纤维化患者（pwCF）气道中的微生物组成，但尚无 体外 迄今为止，尚无模型能够完全整合与囊性纤维化相关的关键肺部特征。因此，在研究多种微生物共同感染的囊性纤维化肺部疾病发病机制方面，仍存在显著的知识空白。本文中，我们介绍一种近期开发的四物种微生物群落模型，该模型包含 铜绿假单胞菌, 金黄色葡萄球菌, Streptococcus sanguinis，以及 Prevotella melaninogenica 在类似囊性纤维化（CF）条件下培养。通过利用该系统，可观察到具有临床相关性的表型，例如抗菌药物敏感性 在分子水平上观察并探究了多种病原体的顽固性。该方法的实用性 体外 该模型的优势在于其标准化的工作流程，有助于在慢性囊性纤维化肺部感染的背景下研究物种间的相互作用。

引言

旨在根除囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）气道中检出的致病微生物的策略常常失败，而囊性纤维化是一种累及多器官的遗传性疾病1也就是说，在富含黏液的囊性纤维化（CF）肺部环境中，能够形成具有抗性的、类似生物膜的微生物群落，可导致持续数十年的慢性感染2此外，尽管一线抗菌药物（Abx）和调节剂的使用已使囊性纤维化患者（pwCF）的治疗效果得到改善，但 "一菌一病" 临床通常针对典型囊性纤维化病原体所采用的方法，例如 铜绿假单胞菌 和 金黄色葡萄球菌 在这些个体肺部检测到的难治性感染中，该方法一直未能奏效3,4,5,6,7.

在过去二十年中，多项研究改变了我们对囊性纤维化（CF）慢性肺部疾病的认识8。研究表明，囊性纤维化患者（pwCF）气道中检测到的感染并非仅由单一病原体引起，而是具有多微生物共存的特性8。此外，尽管混合菌种CF肺部感染的发病机制仍不明确，但临床证据显示，气道中同时感染金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的患者，其肺功能比仅被其中一种病原体定植的患者更差9。

人们推测，囊性纤维化致病菌之间的种间相互作用是导致多微生物生物膜感染难以通过囊性纤维化治疗手段根除的原因，最终影响患者的治疗效果3支持这一点， 体外 研究表明，微生物之间的相互作用，例如 P. aeruginosa, 金黄色葡萄球菌， 以及其他因素可能影响与临床相关的表型，例如对一线囊性纤维化药物（包括万古霉素和妥布霉素）的抗生素响应性6,10,11因此，针对混合菌种感染背景下根除囊性纤维化病原体的现有治疗策略，仍有待重新审视。

在管理基于微生物的囊性纤维化（CF）肺部感染方面，金标准高度依赖于使用抗菌药物敏感性试验（AST）来指导临床干预12。然而，AST 通常采用在营养丰富且充分混匀的培养条件下生长的细菌单一代培养物进行，这并不能反映在 CF 气道中检测到的微生物生长环境3,13。鉴于患者预后与治疗效果之间存在显著脱节，临床报告目前主张开发整合 CF 肺部关键特征的新型方法12,14。

很少有研究开发出与囊性纤维化相关的细菌多物种模型 体外 含有两种以上病原体的系统15,16然而，这些模型（1）未能完全反映囊性纤维化肺部的多微生物和生物膜样特性，以及（2）未采用接近囊性纤维化气道中实际检测到的营养和环境条件15,16通过挖掘大型囊性纤维化（CF）肺部来源的16S rRNA基因数据集并进行计算分析，Jean-Pierre 及其同事近期开发出一种 体外 整合上述特征的共培养模型10。该系统包括 P. aeruginosa, S. aureus, 链球菌 种（spp.）和 普雷沃氏菌属 在CF气道类似条件下培养的spp.可稳定生长长达14天。作者还报道了群落特异性的生长特征 普雷沃菌属 spp. 以及这些囊性纤维化病原体对抗生素反应性的多种变化，其机制仍有待阐明10。这一可操作的 体外 该系统还提供了深入探究与常见变异株抗生素耐受性相关的机制性问题的可能性 P. aeruginosa 在囊性纤维化患者气道中常被检出10因此，本实验方案的目的是为囊性纤维化研究领域提供一种标准化的实验流程，用于培养 体外 具有进一步拓展潜力的生物膜，可用于解决一系列与囊性纤维化（CF）相关的问题。

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方案

所有试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 准备人工痰液培养基

注意：在本实验方案中，人工痰液培养基（ASM）定义为根据 Turner 及其同事先前发表的 SCFM2 培养基改良而来的、适用于囊性纤维化（CF）研究的培养基17。以下是该培养基的制备步骤说明。有关储备液配制及储存条件，请参见材料表。本版本的 ASM 与 Turner 等人17所描述的原始配方有所不同，因为原始配方的缓冲能力不足以在长时间内维持稳定的 pH 值。具体而言，由链球菌属（Streptococcus spp.）和普雷沃菌属（Prevotella spp.）等厌氧菌进行的发酵活动会导致培养基酸化（未发表观察结果）。因此，已将 3-吗啉丙磺酸（MOPS）的浓度从 10 mM 调整至 100 mM。

注意：配制2倍浓度的ASM基础培养基（ASMb）储备液，有助于添加黏蛋白、琼脂、水等组分，而不会影响ASM中各分子的最终浓度10,18。2x ASMb可预先配制，置于避光处4 °C保存，最多可保存两周。若培养基变黄，则应弃用。

  1. 配制2倍ASM基础储备液时，在一个洁净的烧杯中加入400 mL去离子水，2O，边搅拌边加入以下成分：
    1. 加入6.50 mL的0.2 M NaH2PO4.2O储备液；6.25 mL的0.2 M Na2HPO4 储备液；348 µL 的 1 M KNO3 储备液；0.25 M K 的 1.084 mL2SO4 储备液
    2. 加入 4.0 g 缺乏色氨酸的酵母合成培养基（Yeast synthetic dropout without Tryptophan）；3.032 g NaCl；20.92 g MOPS；1.116 g KCl 和 0.124 g NH₄Cl4艰难梭菌（Clostridioides difficile）
    3. 加入9.30 mL的1 M L-乳酸储备液；2.70 mL的1.1 M葡萄糖储备液；1.75 mL的1 M CaCl₂2.2H2O储备液；1.20 mL的0.25 M溶液 N乙酰葡萄糖胺储备液和1.00 mL 3.6 mM FeSO₄4.7H2O型血库存。
    4. 加入660 µL的0.1 M色氨酸储备液；606 µL的1 M MgCl₂2.6H2O型血清；0.60 g鲱鱼精子脱氧核糖核酸；400 µL 250 mg/mL 1,2-二油酰基-sn二油酰基-甘油-3-磷胆碱（DOPC）储备液
    5. 所有组分加入后，用5 M NaOH储备液调节pH至6.80，用去离子水定容至500 mL。2O. 使用0.22 µm滤器除菌，4 °C保存。
  2. 为制备10 mg/mL（2倍浓度）的黏蛋白储备液，使用一个洁净的玻璃瓶，加入250 mL去离子水2O 并在搅拌的同时：
    1. 加入5.0 g猪胃黏蛋白II型，混悬液搅拌10分钟，用去离子水定容至500 mL2O.
    2. 121 °C 高压灭菌 15 分钟。使用前于 4 °C 保存。
  3. 重悬ASM。
    注意：此步骤需在实验当天进行。
    1. 将2倍浓缩的ASMb储存液与10 mg/mL黏蛋白储存液按1:1的体积比混合。
    2. 使用前充分涡旋振荡。

2. 准备多物种微生物群落选择性培养基

注意：以下是配制 1 L 培养基所需的各种成分用量。

  1. 制备甘露醇盐琼脂（Mannitol Salt Agar, MSA）和假单胞菌分离琼脂（Pseudomonas Isolation Agar, PIA）时，请遵循制造商的说明。
  2. 制备普雷沃氏菌选择性琼脂（Prevotella Selective Agar, PSA）时，在一个洁净的玻璃瓶中加入以下成分：
    1. 30.0 g 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、15.0 g 琼脂、5.00 g 酵母提取物、0.50 g 盐酸L-半胱氨酸。
    2. 10.0 mL 浓度为 0.5 mg/mL 的血红素储备液、100 µL 浓度为 10 mg/mL 的甲萘醌储备液。
    3. 加入 940 mL 去离子水（diH2O）并搅拌均匀。于 121 °C 高压灭菌 15 分钟。 
    4. 冷却至可徒手持瓶后，在搅拌条件下加入：50.0 mL 脱纤维羊血、2.00 mL 浓度为 50 mg/mL 的卡那霉素储备液、150 µL 浓度为 50 mg/mL 的万古霉素储备液、500 µL 浓度为 10 mg/mL 的多粘菌素B储备液。
  3. 制备链球菌选择性琼脂（Streptococcus Selective Agar, SSA）时，在一个洁净的玻璃瓶中加入以下成分：
    1. 30.0 g TSB、15.0 g 琼脂。
    2. 加入 950 mL 去离子水（diH2O）并搅拌均匀。于 121 °C 高压灭菌 15 分钟。 
    3. 冷却至可徒手持瓶后，在搅拌条件下加入：50.0 mL 脱纤维羊血、1.00 mL 浓度为 10 mg/mL 的多粘菌素B储备液、1.00 mL 浓度为 10 mg/mL 的奥索利酸储备液。
      注：将培养基倒入培养皿中，于 4 °C 保存，最长不超过 1 个月。使用前，应在接种前于室温下干燥最多 24 小时。PSA 已使用黑色普雷沃氏菌（P. melaninogenica）和中间普雷沃氏菌（Prevotella intermedia）进行过验证。SSA 已使用血链球菌（S. sanguinis）以及米勒链球菌群（Streptococcus milleri group, SMG），即星座链球菌（Streptococcus constellatus）、中间链球菌（Streptococcus intermedius）和咽峡炎链球菌（Streptococcus anginosus）进行过验证。若需测试新菌株，强烈建议对这些选择性培养基进行从头验证（de novo validation）。

3. 细菌液体培养基的制备与培养条件

  1. 常规培养 P. aeruginosa 和 S. aureus 时，使用无菌的富营养培养基（例如，LB 培养基或 TSB 培养基）。
    1. 挑取先前在 LB/TSB 琼脂平板上于 37 °C 培养 20–24 小时后形成的单菌落，接种液体培养基过夜培养。
    2. 将液体培养物于 37 °C、250 rpm 振荡条件下培养 16–18 小时过夜。
  2. 培养 Streptococcus spp. 时，使用添加了 0.5% 酵母提取物的无菌 Todd Hewitt 肉汤（THB-YE）。
    1. 挑取先前在添加 5% 脱纤维羊血的 TSB 琼脂平板（血琼脂平板）上于 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时后形成的单菌落，接种液体培养基过夜培养。
    2. 将 THB-YE 培养物在厌氧条件或 37 °C、5% CO2 条件下静置培养 18–22 小时过夜。
  3. 培养 Prevotella spp. 时，通过向一个洁净瓶中加入以下成分配制 1 L Prevotella 生长培养基（PGM）：
    1. 30.0 g TSB，5.00 g 酵母提取物，0.50 g 盐酸-L-半胱氨酸，10.0 mL 浓度为 0.5 mg/mL 的血红素储备液，以及 100 µL 浓度为 10 mg/mL 的甲萘醌储备液。
    2. 加入 990 mL 去离子水（diH2O），于 121 °C 高压灭菌 15 分钟。用铝箔包裹瓶子以避光。
    3. 将 Prevotella spp. 菌落在血琼脂平板上于 37 °C 厌氧条件下培养 48 小时以获得菌落。
    4. 挑取单菌落接种至 PGM 中，于 37 °C 厌氧条件下静置培养 24 小时过夜。
      注：PGM 可在室温下保存最多两周。强烈建议在使用前对每批培养基进行无菌检测。若未使用厌氧工作站，可能需要从菌苔区域而非单菌落开始 Prevotella spp. 的液体过夜培养。

4. 共培养实验准备

注意：图1 展示了简化的实验流程。如果准备时间少于1小时，可在有氧条件下进行实验设置。若预计准备时间超过1小时，强烈建议在厌氧培养箱（混合气体组成为10% CO2、10% H2 和80% N2）中进行实验。厌氧罐也可用于实验样品的孵育。

  1. 单培养和共培养的制备
    注意：所有离心步骤均在室温下以 10,000 × g 离心 2 分钟。对于共培养，在接种 96 孔板前立即混合细菌样品。通常，从过夜培养物中收集 1 mL 的 P. aeruginosa 和 S. aureus 菌株。对于 Streptococcus spp. 和 Prevotella spp.，过夜培养体积可能在 2–4 mL 之间。这些体积可根据待测试条件的数量进行调整。
    1. 使用过夜培养的细菌液体，执行以下步骤：
      1. 对于 P. aeruginosa 和 S. aureus 菌株，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。
      2. 对于 Streptococcus spp. 和 Prevotella spp.，使用无菌 PBS 洗涤一次。
        注意：使用移液器小心弃去上清液，因为沉淀物容易丢失。
      3. 洗涤后，将每种沉淀物重悬于 1 mL 的 1× 水稀释 ASMb 中。
      4. 将每种样品在无菌 PBS 中进行 1:10 稀释，并测定 OD600。
      5. 将所有培养物的 OD600 调整为 0.2（在 ASM 中）。
      6. 使用 OD600 = 0.2 的菌悬液，在 ASM 中将细菌样品稀释至最终 OD600 为 0.01（每种微生物），用于单培养和共培养。
      7. 充分涡旋振荡 5 秒。
        注意：例如，为制备总量为 1 mL、OD600 = 0.01 的 P. aeruginosa 单培养 ASM 悬液，可将 50 µL OD600 = 0.2 的 P. aeruginosa 菌液加入 950 µL ASM 中。对于共培养，取 OD600 = 0.2 的 P. aeruginosa、S. aureus、Streptococcus spp. 和 Prevotella spp. 菌悬液各 50 µL，加入 800 µL ASM 中。
      8. 使用移液器将 100 µL 单培养和共培养菌悬液分别加入无菌平底 96 孔板的三个独立孔中。
      9. 将 96 孔板在 37 °C、无氧条件下孵育 24 小时（不振荡）。
        注意：此处也可使用其他氧张力条件（如微氧、常氧）。但该模型是在无氧条件下建立并验证的。强烈建议通过连续稀释单培养和共培养菌悬液，并接种于 PIA、MSA、SSA 和 PSA 培养基上，以确认初始接种量。各细菌物种的目标起始浓度分别为：1 × 107 CFU/mL（P. aeruginosa）、3.5 × 106 CFU/mL（S. aureus）、1.2 × 106 CFU/mL（Streptococcus spp.）和 4.6 × 106 CFU/mL（Prevotella spp.）。细菌接种量也可根据 Jean-Pierre 及其同事所述方法进行调整10。
  2. 生物膜形成后更换培养基。
    1. 孵育 24 小时后，使用多通道移液器通过抽吸去除未附着的（浮游）细胞。
    2. 向已形成的生物膜中补充 100 µL 新鲜 ASM 或所需处理液（如抗生素、代谢物等）。
    3. 将 96 孔板在 37 °C、无氧条件下继续孵育 24 小时。
      注意：若操作迅速（即少于 1 分钟），这些步骤可在有氧条件下进行。否则，请使用厌氧舱。

5. 样品的收集与接种

  1. 额外培养24小时后，使用多通道移液器吸除未贴壁（浮游）的细胞。
    注意：浮游菌部分可保留，进行系列稀释后接种于选择性培养基，也可弃去。
  2. 用125 µL无菌PBS轻柔洗涤生物膜两次，并弃去洗涤液。
  3. 加入50 µL无菌PBS，使用96针复制器轻柔刮取培养板上的细胞，使生物膜脱离。
  4. 将重悬的生物膜细胞转移至新的无菌96孔板的A行。
    注意：该96孔板的B至H行应含有无菌PBS。
  5. 对浮游菌（如需要）和生物膜部分进行10倍系列稀释。
  6. 将每种稀释样品3–5 µL分别接种于PIA、MSA、SSA和PSA培养基上。
  7. 让接种点自然干燥。

6. 选择性平板的孵育及菌落形成单位（CFU）计数

  1. 对于 P. aeruginosa 和 S. aureus，在 37 °C 下培养 18–20 小时。
  2. 对于 Streptococcus spp，在 37 °C 的无氧条件下培养 24 小时。
  3. 对于 Prevotella spp，在 37 °C 的无氧条件下培养 48 小时。
  4. 培养后，计数菌落（每点约 10–35 个），并计算每毫升的菌落形成单位（CFU）。
  5. 使用可视化工具绘制数据。

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结果

如图2所示，已报道多种表型现象，包括：(1) 与单一种培养相比，P. aeruginosa 和 S. aureus 在混合浮游菌群中共培养时，其活菌数量减少；(2) S. sanguinis 细胞的多菌种生长增加；以及 (3) P. melaninogenica 的混合菌群生长，该现象此前已由 Jean-Pierre 及同事报道过10。

此外，如图所示 图1 的 体外 该系统还可用于在生物膜群落建立后，检测感兴趣的分子（如 Abx、代谢物等）。也就是说，共培养生长的微生物已显示出：（1）敏感性增加P. aeruginosa-图3A)，(2) 敏感性降低（S. aureus 和 S. sanguinis-

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讨论

这一临床指导下的方法的实用性 体外 共培养系统的优势在于其能够检测多微生物特异性的细菌功能。也就是说，通过利用该模型，我们已报道了从群落特异性生长等范围广泛的微生物表型 普雷沃菌属 种（spp.）图2) 对一线囊性纤维化抗生素敏感性变化的影响 P. aeruginosa, S. aureus 和 S. sanguinis (图3）。此外，尽管所展示的数据表明 图2 代表实验室菌株，使用每种微生物的不同物种/菌株（包括耐甲氧西林的）已获得类似结果 S. aureus （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）菌株，SMG， P. intermedia 和临床分离株 P. aeruginosa10.

通过利用该共培养系统，我们先前报道...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们希望感谢 George A. O'Toole 博士和 Thomas H. Hampton 博士在设计与开发过程中所发挥的重要作用 体外 多微生物群落模型。我们感谢索菲·罗比特艾尔博士（Dr. Sophie Robitaille）对本文手稿提出的宝贵意见。本研究由囊性纤维化基金会资助，项目编号JEAN21F0，授予F.J-P。 图1 手稿中的插图使用 BioRender 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC）Fisher ScientificNC0387928在瓶中用氯仿配制250 mg/mL的储备液。于-20°C保存。在2x ASM基础培养基中的终浓度为200 μg/mL。
3-吗啉丙磺酸（MOPS）SigmaM1254在2x ASM基础培养基中的终浓度为200 mM。
96针复制器Fisher Scientific05-450-9也可使用一次性复制器。货号 #NC1567338。
带盖的96孔无菌标准板Fisher Scientific62406-081
琼脂Fisher ScientificDF0145-17-0
2.5 L矩形厌氧罐（AnaeroPack）Fisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500用水配制1 M储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为3.5 mM。
脱纤维绵羊血用于制备链球菌和普雷沃菌的生长平板。
鲱鱼精子脱氧核糖核酸SigmaD7290在2x ASM基础培养基中的终浓度为1.2 mg/mL。
FeSO4*7H2O Fisher ScientificAA1449830用水配制1 mg/mL（3.6 mM）储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。避光铝箔包裹保存。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.0072 mM。
GasPaksFisher ScientificB260678
葡萄糖Fisher ScientificD16-3用水配制20%储备液（1.1 M），高压灭菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为6 mM。
血红素Sigma51280将100 mg血红素溶于2 mL 1 M NaOH中，再加水定容至200 mL。储存于棕色瓶中或用铝箔包裹的普通瓶中，4 °C保存。
K2SO4Fisher ScientificP304-500用水配制0.25 M储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.54 mM。
卡那霉素用水配制50 mg/mL储备液。用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 °C保存。
KClFisher ScientificP217-500在2x ASM基础培养基中的终浓度为30.0 mM。
KNO3Fisher ScientificP263-500用水配制1 M储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.70 mM。
L-半胱氨酸盐酸盐Fisher ScientificAAA1038922
L-乳酸 SigmaL1750用水配制1 M储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。调节pH至7.0。在2x ASM基础培养基中的终浓度为18.6 mM。
L-色氨酸SigmaT0254用0.2 M NaOH配制0.1 M储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。4 °C冷藏，铝箔包裹避光保存。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.132 mM。
甘露醇盐琼脂Fisher ScientificB11407按生产商推荐方法配制。
甲萘醌SigmaM5625用96-100%乙醇配制10 mg/mL储备液。4 °C避光铝箔包裹保存。使用前涡旋混匀。
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9用水配制1 M储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为1.21 mM。
猪胃黏蛋白 - II型 SigmaM2378用水配制10 mg/mL（2x）储备液；高压灭菌前充分混匀。4 °C保存。
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500用水配制0.2 M储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为2.5 mM。
N-乙酰葡糖胺 SigmaA8625用水配制0.25 M储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。储备液4 °C冷藏保存。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.6 mM。
NaClFisher ScientificS271-500在2x ASM基础培养基中的终浓度为103.7 mM。
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500用水配制0.2 M储备液，并用0.22 μm滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为2.6 mM。
NaOHFisher ScientificS318-500配制5 M储备液。用于调节2x ASM基础培养基储备液的pH。
NH4ClFisher ScientificA661-500在2x ASM基础培养基中的终浓度为4.6 mM。
氧氟酸用0.5 M NaOH配制10 mg/mL储备液。用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 °C保存。
多粘菌素B用水配制10 mg/mL储备液。用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 °C保存。
假单胞菌分离琼脂Fisher ScientificDF0927-17-1按生产商推荐方法配制。
托德-休伊特肉汤Fisher ScientificDF0492-17-6按生产商推荐方法配制。
胰蛋白胨大豆肉汤Fisher ScientificDF0370-17-3按生产商推荐方法配制。
万古霉素用水配制50 mg/mL储备液。用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 °C保存。
酵母提取物Fisher ScientificB11929
不含色氨酸的酵母合成缺陷培养基 SigmaY1876在2x ASM基础培养基中的终浓度为8.0 mg/mL。

参考文献

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