构建模拟疾病进展并预测药物活性的非小细胞肺癌原位异种移植模型

摘要

本研究介绍了一种基于荧光标记A549-iRFP细胞多细胞球体肺内接种的原位非小细胞肺癌（NSCLC）模型。该模型可重现临床NSCLC分期，并对顺铂具有响应性，依据动态监测结果 体内 长波长荧光的监测

摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种致死率极高的疾病，其肿瘤微环境复杂且具有高度异质性。目前常用的动物模型通过皮下接种癌细胞悬液建立，但无法真实模拟非小细胞肺癌的肿瘤微环境。本文介绍一种小鼠原位肺癌异种移植模型，该模型通过将三维多细胞球体（MCS）经肺内接种实现。具体而言，将荧光标记的人源非小细胞肺癌细胞（A549-iRFP）在含胶原的低吸附96孔微孔板中培养3周，形成多细胞球体（MCS），随后通过肋间穿刺将球体接种至无胸腺裸鼠的左肺，从而建立原位肺癌模型。

与原始的 A549 细胞系相比，A549-iRFP 细胞系的多细胞球体（MCS）对抗癌药物的反应相似。A549-iRFP 细胞的长波长荧光信号与癌细胞生长的常见标志物（包括球形体体积、细胞活力和细胞蛋白水平）呈显著相关性，因而可实现对癌细胞生长的动态监测 体内 通过荧光成像观察。将A549-iRFP MCS异种移植瘤接种至小鼠后，该模型可靠地经历了与非小细胞肺癌（NSCLC）临床分期高度相似的疾病进展阶段，包括原发肿瘤的扩张、邻近继发性肿瘤的出现，以及癌细胞向对侧右肺和远端器官的转移。此外，该模型对标准抗肺癌药物顺铂表现出预期的毒性和减缓的肿瘤进展反应。因此，这一NSCLC小鼠原位异种移植模型可作为模拟疾病进展过程的平台，并有助于潜在抗癌药物的研发。

引言

在所有肿瘤类疾病中，肺癌不仅导致的生命损失最大，而且每年在美国新发患者数量也位居第二¹。这种严重的恶性肿瘤是现代医疗面临的主要障碍之一，迫切需要更深入地理解其复杂的生物学机制，并开发更有效的治疗手段²。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的85%，通常会发展为实体瘤³。肺癌面临的主要挑战之一是其动态且异质性的肿瘤微环境，该微环境深刻影响着肿瘤的进展以及对治疗干预的反应^4,5,6。为了更深入理解非小细胞肺癌不同发展阶段中癌细胞与其微环境之间的相互作用，亟需建立能够准确模拟NSCLC进展过程中组织学特征的精细化病理模型。

在这方面，原位动物模型为非小细胞肺癌（NSCLC）研究提供了一条颇具前景的途径。与常用的皮下异种移植模型⁷不同，原位模型是将癌细胞直接接种至其起源器官中。对于肺癌而言，这意味着将癌细胞直接植入肺组织^8,9。因此，肺癌的原位模型能够更好地模拟原生肿瘤微环境，包括邻近组织、血管....

方案

动物实验经太平洋大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行（动物实验方案编号：19R10 和 22R10）。本研究使用了八只雄性裸鼠，年龄为5-6周，体重20-25 g，饲养于参照啮齿类动物饮食标准喂养，并在无特定病原体（SPF）条件下饲养。笼具、垫料和饮用水均经过高压灭菌并定期更换。图1展示了小鼠肿瘤接种的示意图。有关本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. A549-iRFP 细胞三维多细胞球体的建立

1. 将A549-iRFP细胞（人肺腺癌细胞）在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育，并在完全培养基DMEM中培养，该培养基含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1 µg/mL嘌呤霉素。
2. 将A549-iRFP细胞以每孔4,000个细胞的接种密度接种至96孔超低吸附圆底球体微孔板中，每孔加入100 µL含0.3%胶原蛋白的完全培养基。
3. 将微孔板在4 °C下以300 × g离心7分钟，以促进多细胞球体（MCS）的形成。离心后在显微镜下观察MCS形态，确保细胞发生聚集。
4. 48小时后，向每孔加入100 µL完全培养基，使每孔培养基总体积达到200 µL。
5. 每隔一天将每孔中的100....

结果

A549-iRFP 多细胞球体的表征
在胶原蛋白和离心的辅助下，成功地在球形微孔板中培养了 A549-iRFP 多细胞球体（MCS）。经过约 1 周培养，当 MCS 直径达到约 500 µm 时，将 A549 和 A549-iRFP 多细胞球体暴露于多种抗癌药物和制剂中处理 3 天，随后在不含药物的生长培养基中继续培养 4 天。A549-iRFP 多细胞球体的反应模式与亲本 A549 细胞高度相似。A549 和 A549-iRFP 多细胞球体对顺铂（一种肺癌一线治疗药物）表现出相似的剂量-反应曲线和 IC₅₀ 值 (图 2A)。其他抗癌药物或制剂对 A549 和 A549-iRFP 多细胞球体的活力抑制程度也相似 (图 2B)。

通过iRFP荧光、细胞活力和细胞蛋白水平，对A549-iRFP多细胞球体（MCS）进行了长达6周的监测。M.......

讨论

A549-iRFP 多细胞球体（MCS）的构建是一种简单且高度可重复的实验操作，可推广应用于多种细胞系的多细胞球体形成。借助离心和胶原蛋白辅助，所生成的多细胞球体在 3–4 天内即可形成更为完整、类似实体瘤的结构。该方法可确保形成结构稳定的球状体，并在较长时间内维持其完整性，通常可持续 2–3 周甚至更久，直至出现微小的出芽现象。通过采用离心和胶原蛋白，我们实现了多细胞球体形成的标准化，从而保证了实验模型中球体的一致性和可靠性。该策略提高了实验结果的可重复性，并减少了肿瘤生长动力学的变异性，为研究肿瘤生物学特性及治疗干预提供了更为可靠的实验平台。

与传统的二维单层细胞培养相比，三维多细胞球（MCS）可生长更长时间，在本研究中至少可达6周。为了监测癌症的生长和进展，动态、长期的定量测量具有重要价值。现有的许多三维MCS检测方法在测量过程中具有破坏性，因而限制了其在长期评估中的应用。通过测量iRFP荧光信号的非破坏性方式，可实现对三维MCS中癌细胞生长的持续且长期的监测。这一特性在评估抗癌药物长期暴露效应以及捕捉癌细胞随时间动态演变过程方面尤为宝贵。A549-iRFP三维MCS发出的i.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 µL 玻璃注射器	Hamilton	部件/货号 #80601
20 G 针头	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96孔超低吸附球体微孔板	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M 成年啮齿类动物饲料	Research Diets, Inc.	D10012M
裸鼠（无胸腺裸鼠）	Charles River Laboratories, Inc.	品系编号：490；纯合子
BCA 蛋白定量试剂	Pierce	23227
盐酸丁丙诺啡	Patterson Veterinary	NDC 编号：42023-179-05
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒	Promega	G9683
胶原蛋白	Gibco	A1064401
DMEM 培养基	Corning	MT10013CV
胎牛血清（FBS）	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	开源工具（https://imagej.net/ij/）	不适用
Image Studio	LI-COR	版本号：5.2
异氟烷	Patterson Veterinary	NDC 编号：17033-0091-25
氯胺酮	Patterson Veterinary	NDC 编号：50989-0161-06
显微镜	Keyence	型号：BZ-X710
Matrigel 基质胶	Corning	CB-40234
Odyssey 红外成像系统 205	LI-COR	型号：9140
PBS 缓冲液	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy 小动物活体成像系统	LI-COR	型号：9430
青霉素-链霉素双抗溶液	Corning	MT30002CI
嘌呤霉素	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
MATLAB 中的 ReViSP 软件	Sourceforge 上的开源工具（https://sourceforge.net/projects/revisp/）	不适用
手术夹——AutoClip 系统	Fine Science Tools	12020-00
赛拉嗪	Patterson Veterinary	NDC 编号：61133-6017-01