需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

构建模拟疾病进展并预测药物活性的非小细胞肺癌原位异种移植模型

2.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/66787

⸱

2024年5月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Thomas J. Long School of Pharmacy, University of the Pacific

本文内容

摘要

本研究介绍了一种基于荧光标记A549-iRFP细胞多细胞球体肺内接种的原位非小细胞肺癌（NSCLC）模型。该模型可重现临床NSCLC分期，并对顺铂具有响应性，依据动态监测结果 体内 长波长荧光的监测

摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种致死率极高的疾病，其肿瘤微环境复杂且具有高度异质性。目前常用的动物模型通过皮下接种癌细胞悬液建立，但无法真实模拟非小细胞肺癌的肿瘤微环境。本文介绍一种小鼠原位肺癌异种移植模型，该模型通过将三维多细胞球体（MCS）经肺内接种实现。具体而言，将荧光标记的人源非小细胞肺癌细胞（A549-iRFP）在含胶原的低吸附96孔微孔板中培养3周，形成多细胞球体（MCS），随后通过肋间穿刺将球体接种至无胸腺裸鼠的左肺，从而建立原位肺癌模型。

与原始的 A549 细胞系相比，A549-iRFP 细胞系的多细胞球体（MCS）对抗癌药物的反应相似。A549-iRFP 细胞的长波长荧光信号与癌细胞生长的常见标志物（包括球形体体积、细胞活力和细胞蛋白水平）呈显著相关性，因而可实现对癌细胞生长的动态监测 体内 通过荧光成像观察。将A549-iRFP MCS异种移植瘤接种至小鼠后，该模型可靠地经历了与非小细胞肺癌（NSCLC）临床分期高度相似的疾病进展阶段，包括原发肿瘤的扩张、邻近继发性肿瘤的出现，以及癌细胞向对侧右肺和远端器官的转移。此外，该模型对标准抗肺癌药物顺铂表现出预期的毒性和减缓的肿瘤进展反应。因此，这一NSCLC小鼠原位异种移植模型可作为模拟疾病进展过程的平台，并有助于潜在抗癌药物的研发。

引言

在所有肿瘤类疾病中，肺癌不仅导致的生命损失最大，而且每年在美国新发患者数量也位居第二1。这种严重的恶性肿瘤是现代医疗面临的主要障碍之一，迫切需要更深入地理解其复杂的生物学机制，并开发更有效的治疗手段2。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的85%，通常会发展为实体瘤3。肺癌面临的主要挑战之一是其动态且异质性的肿瘤微环境，该微环境深刻影响着肿瘤的进展以及对治疗干预的反应4,5,6。为了更深入理解非小细胞肺癌不同发展阶段中癌细胞与其微环境之间的相互作用，亟需建立能够准确模拟NSCLC进展过程中组织学特征的精细化病理模型。

在这方面，原位动物模型为非小细胞肺癌（NSCLC）研究提供了一条颇具前景的途径。与常用的皮下异种移植模型7不同，原位模型是将癌细胞直接接种至其起源器官中。对于肺癌而言，这意味着将癌细胞直接植入肺组织8,9。因此，肺癌的原位模型能够更好地模拟原生肿瘤微环境，包括邻近组织、血管和免疫组分，从而显著提高其生理相关性和临床相关性。

三维多细胞球体（MCS）是模拟肿瘤微环境特征的另一种有前景的方法。大多数癌症的特征在于其复杂的肿瘤微环境，包括多种细胞间相互作用、细胞外基质以及氧气和营养物质的梯度分布10,11。传统的二维细胞培养缺乏足够的空间和结构复杂性，无法重现这些肿瘤特异性特征12。相比之下，适当大小的MCS具有异质性结构，包含缺氧和坏死的核心区域，不仅能够模拟肿瘤内部的微环境，还能再现阻碍药物渗透的生理屏障，而这一屏障正是抗癌治疗中产生药物耐药性的主要机制之一13,14,15。

通过结合原位动物模型和多细胞球体（MCS）培养技术，已将MCS接种至免疫缺陷小鼠，成功构建了乳腺癌和前列腺癌的原位模型16,17。本文中，我们报道了构建和表征小鼠肺癌原位异种移植模型的详细方法。该方法采用将来源于荧光标记的人肺癌细胞（A549-iRFP）的三维MCS经肺内接种18。该模型为在活体（in vivo）条件下观察肺癌进展提供了极佳的机会，其发展过程与非小细胞肺癌（NSCLC）的四个临床分期高度相似。此外，该模型中的异种移植肿瘤对临床上已确立的抗肺癌药物顺铂具有响应性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

动物实验经太平洋大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行（动物实验方案编号：19R10 和 22R10）。本研究使用了八只雄性裸鼠，年龄为5-6周，体重20-25 g，饲养于参照啮齿类动物饮食标准喂养，并在无特定病原体（SPF）条件下饲养。笼具、垫料和饮用水均经过高压灭菌并定期更换。图1展示了小鼠肿瘤接种的示意图。有关本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. A549-iRFP 细胞三维多细胞球体的建立

  1. 将A549-iRFP细胞（人肺腺癌细胞）在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育，并在完全培养基DMEM中培养，该培养基含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1 µg/mL嘌呤霉素。
  2. 将A549-iRFP细胞以每孔4,000个细胞的接种密度接种至96孔超低吸附圆底球体微孔板中，每孔加入100 µL含0.3%胶原蛋白的完全培养基。
  3. 将微孔板在4 °C下以300 × g离心7分钟，以促进多细胞球体（MCS）的形成。离心后在显微镜下观察MCS形态，确保细胞发生聚集。
  4. 48小时后，向每孔加入100 µL完全培养基，使每孔培养基总体积达到200 µL。
  5. 每隔一天将每孔中的100 µL培养基更换为新鲜的完全培养基。

2. A549-iRFP 多克隆细胞系的表征

  1. 使用显微镜观察并成像多细胞球体（MCS）的形态，并基于相差显微镜图像，利用MATLAB提供的参考软件通过模拟估算MCS体积。
    1. 在 ImageJ 软件中打开一个 MCS 图像。
    2. 使用 徒手选择 选择MCS的边缘并将其添加到 ROI 管理器.
    3. 点击 编辑 | 选择 | 创建遮罩.
    4. 点击 编辑 | 反转.
    5. 点击 文件 | 另存为 | Tiff.
    6. 打开 ReViSP 软件。
    7. 单击打开已保存的 TIFF 图像 浏览.
    8. 点击 开始 完成MCS模拟。
  2. 使用红外成像系统在700 nm通道下检测iRFP荧光信号，并利用软件（例如Image Studio）对荧光信号进行定量分析。
    1. 打开图像工作室软件。
    2. 在 通道 标签，选择 700 和 强度 = 5.
    3. 在 扫描控制 标签，选择 84 µm, 培养基，0.0 毫米，以及 翻转图像保持其余所有设置为默认值。
    4. 点击 开始 开始扫描。
  3. 根据供应商方案，使用3D细胞活力检测法评估并量化细胞活力。
  4. 根据试剂盒说明书，使用BCA法测定并定量细胞蛋白。

3. 肿瘤接种用 MCS 的选择

注意：在将MCS接种到球体微孔板中，并通过定期更换完全培养基培养2-3周后，应选择具有以下合适特征的MCS用于肿瘤接种。

  1. 在显微镜下观察多细胞球体（MCS）的形态，选择呈圆形、整体边缘光滑但具有5-10个粗糙出芽（如图2F中的箭头所示）且直径在700-800 µm范围内的MCS。
  2. 检测iRFP荧光信号（参见步骤2.2），选择荧光信号强度在平均值一个标准差范围内的MCS。

4. 肺内MCS接种

注意：在接触动物前，使用70%异丙醇喷雾清洁手术台和器械。手术过程中，术者应全程佩戴无菌手套。

  1. 通过腹腔注射每只小鼠 80 mg/kg 的氯胺酮和 12 mg/kg 的赛拉嗪进行麻醉；用镊子轻夹小鼠足部以确认其完全麻醉。
  2. 皮下注射 0.05 mg/kg 的盐酸布托啡诺以减轻疼痛。
  3. 在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥。
  4. 将小鼠以仰卧位置于红外加热垫上，并用胶带固定四肢使其处于伸展状态。
    注意：在整个手术过程中需持续为麻醉状态的小鼠提供保温支持。
  5. 使用棉签交替擦拭碘液和酒精对背部皮肤进行消毒，每种溶液至少擦拭三次。
  6. 使用手术剪在左侧背部做一道 0.5–1 cm 的切口（图 1B）。用镊子小心分离肌肉和脂肪组织，直至可见胸壁及肺部运动。
  7. 使用移液器将一个选定的 MCS 从微孔板转移至含有冰冷 PBS 的玻璃培养皿中。
  8. 将一根 20 G 针头连接至 100 µL 玻璃注射器上，预先在冰上冷却，并吸取 20 µL 预冷的 PBS 与 Matrigel 混合液（体积比 1:1）。
  9. 用该注射器迅速从培养皿中吸取一个 MCS，尽量减少 PBS-Matrigel 混合液体积，并使 MCS 保留在针头的金属部分。
    注意：紧握注射器和推杆，防止 MCS 从针头滑出。
  10. 将针头垂直插入两根肋骨之间约 3 mm 深度，缓慢注入含有 MCS 的全部 20 µL PBS 和 Matrigel 混合液。
    注意：插入时避免用力过猛，以防损伤肺、血管或心脏。
  11. 小心拔出针头，并在伤口处涂抹三重抗生素软膏。
  12. 使用手术夹闭合切口，夹子将在术后 2 周移除。
    注意：不要缝合切口，因为缝线可能干扰荧光成像。裸鼠术后可自然愈合。
  13. 将动物置于红外加热垫上，并用实验室擦拭纸覆盖以维持体温。监测动物至少 30–60 分钟，直至其苏醒并能正常活动。
  14. 术后前 48 小时内，每 8 小时皮下注射一次 0.05 mg/kg 的盐酸布托啡诺以减轻疼痛。

5. 术后监测

  1. 每3-4天测量一次体重。
  2. 每3-4天使用小动物成像系统在700 nm通道下检测肿瘤异种移植体的iRFP荧光信号，小鼠通过吸入含1.5%异氟烷的氧气（流速：1.5–2 L/min）麻醉2–3分钟，依次采集左侧、右侧、背侧和腹侧四种体位的图像。
    注意：将动物放入成像工作站前，应使用70%异丙醇喷雾清洁小动物成像系统。手术过程中，操作者应全程佩戴无菌手套。
  3. 定量分析异种移植癌的净荧光强度 体内 使用软件（例如 Image Studio）。
    1. 使用一个固定的矩形（A1，200 × 125 像素作为小鼠胸部区域的采样窗口。
    2. 使用 徒手功能 在矩形内描绘小鼠的轮廓（A1）并测量荧光强度（F1面积） A1.
    3. 使用另一个较小的矩形（A2, 25 x 40 像素）以测量背景荧光（F2小鼠大腿区域的)
    4. 使用公式（1) 以计算每只小鼠异种移植瘤的净荧光强度：
      净荧光强度计算公式 F1-F2×A1/A2；荧光分析公式。     (1)

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

A549-iRFP 多细胞球体的表征
在胶原蛋白和离心的辅助下，成功地在球形微孔板中培养了 A549-iRFP 多细胞球体（MCS）。经过约 1 周培养，当 MCS 直径达到约 500 µm 时，将 A549 和 A549-iRFP 多细胞球体暴露于多种抗癌药物和制剂中处理 3 天，随后在不含药物的生长培养基中继续培养 4 天。A549-iRFP 多细胞球体的反应模式与亲本 A549 细胞高度相似。A549 和 A549-iRFP 多细胞球体对顺铂（一种肺癌一线治疗药物）表现出相似的剂量-反应曲线和 IC50 值 (图 2A)。其他抗癌药物或制剂对 A549 和 A549-iRFP 多细胞球体的活力抑制程度也相似 (图 2B)。

通过iRFP荧光、细胞活力和细胞蛋白水平，对A549-iRFP多细胞球体（MCS）进行了长达6周的监测。M...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

A549-iRFP 多细胞球体（MCS）的构建是一种简单且高度可重复的实验操作，可推广应用于多种细胞系的多细胞球体形成。借助离心和胶原蛋白辅助，所生成的多细胞球体在 3–4 天内即可形成更为完整、类似实体瘤的结构。该方法可确保形成结构稳定的球状体，并在较长时间内维持其完整性，通常可持续 2–3 周甚至更久，直至出现微小的出芽现象。通过采用离心和胶原蛋白，我们实现了多细胞球体形成的标准化，从而保证了实验模型中球体的一致性和可靠性。该策略提高了实验结果的可重复性，并减少了肿瘤生长动力学的变异性，为研究肿瘤生物学特性及治疗干预提供了更为可靠的实验平台。

与传统的二维单层细胞培养相比，三维多细胞球（MCS）可生长更长时间，在本研究中至少可达6周。为了监测癌症的生长和进展，动态、长期的定量测量具有重要价值。现有的许多三维MCS检测方法在测量过程中具有破坏性，因而限制了其在长期评估中的应用。通过测量iRFP荧光信号的非破坏性方式，可实现对三维MCS中癌细胞生长的持续且长期的监测。这一特性在评估抗癌药物长期暴露效应以及捕捉癌细胞随时间动态演变过程方面尤为宝贵。A549-iRFP三维MCS发出的i...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了太平洋大学SAAG和SEED基金的资助。我们感谢William Chan博士提供Odyssey红外成像205系统，以及John Livesey博士提供SpectraMax iD3酶标仪的使用权限。我们感谢Melanie Felmlee博士在动物实验方案方面提供的技术建议。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 µL 玻璃注射器Hamilton部件/货号 #80601
20 G 针头Thermo Fisher Scientific Inc.14 826D
96孔超低吸附球体微孔板 Corning15-100-173
A549-iRFPImanis Life Sciences CL082-STAN
AIN-93M 成年啮齿类动物饲料 Research Diets, Inc.D10012M
裸鼠（无胸腺裸鼠）Charles River Laboratories, Inc.品系编号：490；纯合子
BCA 蛋白定量试剂Pierce23227
盐酸丁丙诺啡Patterson VeterinaryNDC 编号：42023-179-05
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒PromegaG9683
胶原蛋白GibcoA1064401 
DMEM 培养基CorningMT10013CV
胎牛血清（FBS）Cytiva HyCloneSH3039603
ImageJ开源工具（https://imagej.net/ij/）不适用
Image Studio LI-COR版本号：5.2
异氟烷Patterson VeterinaryNDC 编号：17033-0091-25
氯胺酮Patterson VeterinaryNDC 编号：50989-0161-06
显微镜 Keyence型号：BZ-X710
Matrigel 基质胶CorningCB-40234
Odyssey 红外成像系统 205 LI-COR型号：9140
PBS 缓冲液CorningMT21040CV
Pearl Trilogy 小动物活体成像系统 LI-COR型号：9430
青霉素-链霉素双抗溶液 CorningMT30002CI
嘌呤霉素Thermo Fisher Scientific Inc.AAJ67236XF
MATLAB 中的 ReViSP 软件 Sourceforge 上的开源工具（https://sourceforge.net/projects/revisp/）不适用
手术夹——AutoClip 系统Fine Science Tools12020-00
赛拉嗪Patterson VeterinaryNDC 编号：61133-6017-01

参考文献

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials. J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).
  4. Ducote, T. J., et al. Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers. Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).
  5. Lim, Z. F., Ma, P. C. Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy. J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).
  6. Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).
  7. Peterson, J. K., Houghton, P. J. Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development. Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).
  8. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).
  9. Mclemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  10. Zanoni, M., et al. 3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103(2016).
  11. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).
  12. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  13. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  14. Huang, B. W., Gao, J. Q. Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research. J Control Release. 270, 246-259 (2018).
  15. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  16. Sethi, P., et al. 3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation. Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).
  17. Valta, M. P., et al. Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer. Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).
  18. Huang, Y., et al. Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer. J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).
  19. Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. Lung cancer: Biology and treatment options. Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).
  20. Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. The eighth edition lung cancer stage classification. Chest. 151 (1), 193-203 (2017).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

多细胞球体肿瘤微环境肺内接种荧光成像A549-iRFP细胞药物反应预测肿瘤进展监测动物手术技术
构建模拟疾病进展并预测药物活性的非小细胞肺癌原位异种移植模型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。