本方案描述了使用高速气动钻在3月龄丹麦长白猪上进行开颅手术的操作过程。手术通路通过额骨，暴露腹侧硬脑膜及下方的大脑半球。该操作可实现对猪脑较大区域的暴露与接触。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
猪作为实验动物模型在神经科学研究中具有特别重要的意义，因为猪和人类的中枢神经系统（CNS）在功能和结构上具有许多重要的相似特性。因此，猪预计将在未来多种神经系统疾病的研究中发挥日益重要的作用。本文介绍了一种通过猪额骨进行前颅骨切除术的方法。首先沿中线做切口，暴露猪的额骨，然后利用解剖学标志确定颅骨切除部位的最佳位置。使用圆头钻头对额骨进行仔细且逐步的磨薄，最终形成一个通向硬脑膜及下方大脑半球的矩形开口。该方法需要某些外科器械，包括气动高速钻头，并要求操作者具备一定的外科经验。可能的并发症包括意外损伤硬脑膜或上矢状窦。然而，该方法操作简便、耗时短，且具有高度的可重复性。若操作得当，该技术可充分暴露大面积未受影响的猪脑组织，适用于多种神经监测或分析研究。
引言
通常，在因实际或伦理限制而无法使用人类患者来研究疾病或测试外科手术方法时，会采用动物模型。建立新的动物模型通常旨在为人类疾病提供具有转化价值的新知识。由于实际操作和经费方面的考虑，啮齿类动物常被使用，但其对人类的转化价值有限，尤其是由于存在显著的解剖学差异1。相比之下，猪具有多种优势。猪不仅在关键的解剖学、生理学、代谢和遗传特征方面与人类相似，而且其器官系统的大小可通过体重匹配来模拟人类器官2,3。这使得猪在外科动物模型和手术培训中具有独特地位4。尽管与啮齿类动物相比，使用猪模型需要更高的实际操作能力和经费投入，但相较于非人灵长类动物，猪在经济和伦理上均是更为可接受的选择。
猪脑在转化神经科学研究中具有特殊意义。首先，猪脑的结构与人脑相似，两者均以白质为主，且均为有沟回的大脑3,5,6。其次，与啮齿类动物相比，猪的脑体积较大，使得临床环境中常用的手术器械和多种成像技术也可应用于猪7,8。因此，近几十年来，多种猪模型已被广泛用于神经科学研究9。然而，这些猪中枢神经系统模型大多需要对脑组织进行直接分析，而脑组织可通过多种方式获取（例如，植入导管或电极、组织活检等）10。由于大多数此类方法需要一定程度的器械介入以及对脑组织的直接接触，因此必须考虑不同的手术入路方案。
该方法包括通过对一只3个月大、已镇静的雌性丹麦兰德瑞斯猪的额骨进行前颅骨切除术。本论文的总体目的是描述一种利用气动高速钻头通过颅骨切除术暴露大部分猪脑腹侧区域的技术。第一步是将实验动物置于合适的位置，并抬高头部。由于猪的颅骨结构与人类有较大差异，第二步需利用多种解剖学标志来规划颅骨切除的位置。第三步是在不损伤脑膜的前提下，暴露覆盖双侧大脑半球的下方硬脑膜。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有所述动物实验均在丹麦奥尔堡大学医院进行，遵循现行法律法规，并经丹麦动物实验监察局批准（许可证号：2020-15-0201-00401）。本研究采用雌性家猪，体重约40 kg，年龄约3个月。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 受试对象饲养
- 手术前至少7天，将受试动物分组饲养在符合标准的圈舍中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环环境，以确保其充分适应。
2. 麻醉与监测
- 使用一种混合物对动物进行肌肉注射，剂量为每10 kg体重2 mL，该混合物包含替来他明（Tiletamine）6.25 mg/mL、氯胺酮（Ketamine）6.25 mg/mL、唑拉西泮（Zolazepam）6.25 mg/mL、布托啡诺（Butorphanol）1.25 mg/mL 和赛拉嗪（Xylazine）6.25 mg/mL，以实现镇静。
- 将动物仰卧置于加热毯上，以确保最佳的体温调节。
- 使用6.5号导管对动物进行气管插管7，并以非湿化空气进行机械通气，潮气量为8 mL/kg，呼吸频率为16–20次/分钟，根据呼气末二氧化碳分压（end-tidal CO2）浓度<6.0 kPa进行调整。
注意：此步骤还可确认导管在气管内的正确位置。 - 通过吸入1%至2%的七氟烷维持麻醉状态。
- 小心地将眼用软膏涂抹于动物双眼，以防止麻醉期间角膜干燥。
- 通过检查睫状反射评估麻醉深度，并相应调整七氟烷浓度。
- 经尿道将带有温度计的膀胱导管插入动物膀胱，用于监测体温并收集尿液至导尿袋中。
- 在整个操作过程中持续监测动物的生命体征。
注意：生命体征包括脉搏、连续动脉血压、体温和呼气末二氧化碳（end-tidal CO2）。 - 通过经皮穿刺在右颈静脉插入中心静脉导管（6 Fr鞘管），用于持续输注生理盐水（0.9% NaCl）、给药，并在实验结束时用于实施安乐死。
3. 动物体位
- 将受试者置于俯卧位，抬高头部并用沙袋固定，直至额骨接近水平位置，以确保最佳定位。
注意：应适度固定头部，防止不必要的移动。 - 使用修剪器或剃刀剃除手术区域的毛发。
4. 外科手术器械的准备
- 按照材料表中列出的清单准备手术器械。
5. 暴露额骨
- 确定枕部隆起和每侧眶上嵴的尾侧部分（图1），以界定预期的矢状中线。
- 使用24号手术刀沿中线切开，切透皮肤和帽状腱膜，直至额骨骨膜。
- 用外科棉片擦去血液。
- 使用12 mm扁平咬骨钳，从切口周围逐步将帽状腱膜与下方的额骨分离。
- 使用外科牵开器撑开帽状腱膜，暴露其下方的额骨（图2）。
6. 确定暴露的额骨的解剖学标志
- 以矢状缝作为解剖中线的参考，并识别冠状缝（图2）。
- 通过手动触诊识别三个骨性结构：枕外隆凸以及两侧眶上嵴的尾侧部分（图1 和 图3）。
注意：这些解剖标志构成一个三角形区域，颅骨切除术即在此区域内进行（图1 和 图4A）。
7. 硬脑膜的暴露
- 使用高速气动钻和圆头金刚砂钻头（图3A），在先前确定的三角形边界内标出矩形的每个角。
- 使用4 mm圆头金刚砂钻头连接各个角，以确保开窗位置准确（图4B）。
- 使用4 mm圆头金刚砂钻头逐渐磨薄额骨，直至暴露硬脑膜。
注意：避免在中线处首次接触硬脑膜，该位置对应矢状缝（图1），因为此处有较大的背侧矢状窦。在此处穿孔可能导致严重的静脉出血。 - 通过首次接触硬脑膜的点，目视评估剩余额骨的厚度。
- 继续使用4 mm圆头金刚砂钻头小心地磨薄已定义矩形区域内的额骨。
注意：保留骨屑，用于后续控制静脉或暴露的额骨松质骨出血。 - 将3 mm剥离器插入已充分磨薄的骨板周围骨下，通过轻柔的手动压力将骨片撬下，从而扩大至硬脑膜的暴露范围。
注意：交替进行钻孔和撬除骨片，直至骨板周围多处硬脑膜暴露。 - 使用注射器注入无菌生理盐水以清除视野。
8. 去除骨板
- 将3 mm剥离器插入骨板下方，逐渐对其手柄施加向下的压力，以折断骨板。
注意：此时应暴露出下方的硬脑膜，可见两侧大脑半球的轮廓（图5 和 图6）。 - 通过肉眼观察是否有脑脊液（CSF）渗漏，评估硬脑膜的完整性。
注意：若硬脑膜无明显缺损，两侧半球将呈现同步搏动。 - 使用预先保留的骨粉，或在低电压下小心使用单极或双极电凝器进行凝固，以止住轻微的静脉出血。
注意：预期可能会出现来自导静脉或板障静脉的轻微静脉出血。
9. 保护暴露的硬脑膜
- 用浸有无菌生理盐水的无菌手术棉片覆盖暴露的硬脑膜，以防止 underlying 组织干燥。
10. 微透析导管（MDC）的插入
- 以背侧矢状窦作为中线参考。将微透析导管（MDC）置于一次性18 G针头的腔内。从背侧矢状窦外侧10 mm处，以10°–15°的角度向头侧-喙侧方向穿刺硬脑膜，直至针头进入组织深度达20 mm。
- 缓慢撤出针头，同时确保MDC在浅层大脑皮层中的位置保持不变。
- 将导管牢固地固定于邻近皮肤，以防止MDC移位。
注意：确保MDC的尖端不接触针头的锐利端部，以免造成损伤。 - 再次以背侧矢状窦作为中线参考，重复上述操作。将MDC置入针头中，如上所述，在对侧半球距中线15 mm处，以垂直（90°角）穿刺硬脑膜。
- 将针头插入20 mm后，按上述方法缓慢撤出，使MDC留置于皮层下脑组织内。按上述方法固定MDC。
- 准备一支2 mL一次性塑料注射器，并安装一次性18 G针头。用0.5 mL无菌生理盐水填充注射器。
- 从距中线20 mm处外侧穿刺硬脑膜，保持针头与组织呈45°角，方向朝向中线。每次进针1 mm时，缓慢推进并轻柔抽吸，逐段操作。
- 每次抽吸时观察注射器内情况，直至获取脑脊液（CSF）。
- 在保持针头解剖位置不变的前提下，将针头与注射器分离。将MDC经针头插入侧脑室，直至感到阻力。
- 按上述方法使用手术胶带牢固固定MDC。
11. 微透析（MD）
- 将每根微透析导管（MDC）连接至独立的微透析泵。
- 通过向MDC中泵入无菌生理盐水，并将其收集至适当的样品管中，启动微透析过程。通过观察每个样品管中的生理盐水，确认每根MDC均有液体流过。
- 以1 µL/min的流速持续进行30分钟的微透析，开始组织校准期。
12. 安乐死
- 通过中心静脉导管注射戊巴比妥钠静脉推注剂量（50 mg/kg）（遵循机构批准的方案）。
- 观察呼吸机上的脉搏、血压和呼气末 CO2 曲线是否呈直线，以确认心脏停搏。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
猪头的俯卧位可为术中外科医生提供最佳操作通路，使用稳定用沙袋可降低钻孔过程中猪头位置意外移动的风险。
在本演示过程中，通过猪颅骨上部的浅表解剖标志（两侧眶上嵴和枕外隆凸）（图1 和 图3）来精确定位正中矢状线，然后进行切口。切开并去除帽状腱膜后，通过识别矢状缝来确定真实的解剖中线（图2）。在暴露额骨后，结合三个可触及的解剖标志（图1 和 图3）以及矢状缝（图2），确定一个三角形区域，并在此区域内设定颅骨切除的边界位置（图4A）。这些解剖标志非常适合该操作，因为它们与猪的大脑位置关系密切（图7）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
演示的操作过程包含若干关键步骤。首先，准确规划颅骨切除的位置至关重要，这与猪颅骨的结构有关。由于猪额骨的厚度在侧缘处增加，若将骨窗位置过于偏向外侧11，在钻孔过程中可能难以到达硬脑膜。此外，将骨窗准确定位于中线位置对于降低意外损伤下方矢状窦的风险具有重要意义。然而需要注意的是，猪的颅骨结构存在显著的个体差异，且并非所有个体都能观察到清晰可辨的矢状缝或冠状缝11。因此，本操作所采用的方法依赖于更普遍的解剖学标志，如项嵴和眶突，以提高颅骨切除定位的准确性。
尽管高速旋转的圆钻效率较高，但也存在 较高的意外损伤硬脑膜的风险，尤其是在初始接触点处。逐步积累的实践经验有助于降低此类风险。然而，与常规手动钻等替代工具相比，气动高速钻通常价格昂贵，这是一个显著的局限性。有人可能会建议改进操作流程，即先使用手动颅骨钻进行硬脑膜的初始接触，随后再使用带足状结构的开颅器。这种方法可能降低硬脑膜损伤的风险，因为硬脑膜将不会暴露于高速运动的器械之下。然而，根据我们的经验，猪额骨内窦状结构的厚度和分布存...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢丹麦奥尔堡大学医院生物医学实验室工作人员提供的支持与技术经验。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 塑料注射器 | Becton, Dickinson and Company | 303219 | |
| 107 微透析泵 | M Dialysis | P000127 | 107 Microdialysis Pump |
| 2 mL 塑料注射器 | Becton, Dickinson and Company | 300928 | |
| 25 mm，18 G 针头 | Becton, Dickinson and Company | 304100 | |
| Bair Hugger 加热器 | 3M | B5005241003 | |
| Bair Hugger 加热毯 | 3M | B5005241003 | |
| 微透析泵电池 | M Dialysis | 8001788 | 6V 电池，106 & MD 泵 |
| 剥离器 | Karl Storz | 223535 | 扁平 3 mm 剥离器 |
| 6.5 号气管插管 | DVMed | DVM-107860 | 带套囊气管插管 |
| Euthasol Vet | Dechra Veterinary Products A/S | 380019 | 用于安乐死的苯巴比妥，400 mg/mL |
| Farabeuf Rougine | Mahr Surgical | 平头 Rougine（12 mm） | |
| 12 F 导尿管 | Becton, Dickinson and Company | D175812E | 内置热敏传感器的导尿管 |
| 静脉套管 | Coris Avanti | Avanti Cordis 股静脉套管 6 F | |
| 脑部微透析导管 | M Dialysis | P000050 | 膜长 10 mm，轴长 100 mm，4 支/包 |
| 微透析注射器 | M Dialysis | 8010191 | 106 Pump Syringe 20/pkg |
| 微透析采样用微量管 | M Dialysis | P000001 | 微量管 250 支/包 |
| 手术台 | |||
| 气动高速钻 | Medtronic | Medtronic Midas Rex 7 钻机 | |
| Primus 呼吸机 | Dräger | 内置蒸发器的呼吸机，用于辅助七氟烷麻醉 | |
| 圆形金刚石钻头 | Medtronic | 7BA40D-MN | |
| 自持式牵开器 | World Precission Instruments | 501722 | Weitlander 牵开器，自持式，14 cm，钝头 |
| 无菌生理盐水 | Fresnius Kabi | 805541 | 1000 mL |
| 无菌外科棉签 | |||
| 24 号外科手术刀 | Swann Morton | 5.03396E+12 | Swann Morton 无菌一次性 24 号手术刀 |
| Zoletil Vet | Virbac | 用于诱导麻醉的药物混合物 |
参考文献
- Mariager, T., Bjarkam, C., Nielsen, H., Bodilsen, J. Experimental animal models for brain abscess: a systematic review. Br J Neurosurg. , 1-8 (2022).
- Bassols, A., et al. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. Proteomics Clin Appl. 8, 715-731 (2014).
- Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. The pig: A model for human infectious diseases. Trends Microbiol. 20 (1), 50-57 (2012).
- Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Vet Pathol. 49 (2), 344-356 (2012).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neurosci Biobehav Rev. 31 (5), 728-751 (2007).
- Hoffe, B., Holahan, M. R. The use of pigs as a translational model for studying neurodegenerative diseases. Front Physiol. 10, 838(2019).
- Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the göttingen minipig: Intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. J Vis Exp. (52), e2652(2011).
- Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C. H., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the Göttingen minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Struct Funct. 222 (5), 2093-2114 (2017).
- Hou, N., Du, X., Wu, S. Advances in pig models of human diseases. Animal Model Exp Med. 5 (2), 141-152 (2022).
- Munk, M., Poulsen, F. R., Larsen, L., Nordström, C. H., Nielsen, T. H. Cerebral metabolic changes related to oxidative metabolism in a model of bacterial meningitis induced by lipopolysaccharide. Neurocrit Care. 29 (3), 496-503 (2018).
- Kyllar, M., et al. Radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging of craniofacial structures in pig. J Vet Med C: Anat Histol Embryol. 43 (6), 435-452 (2014).
- Mariager, T., et al. Continuous evaluation of single-dose moxifloxacin concentrations in brain extracellular fluid, cerebrospinal fluid, and plasma: A novel porcine model. J Antimicrobial Chemother. , (2024).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
