本文介绍了一种在三维纤维蛋白水凝胶中培养人诱导多能干细胞来源的胸腺类器官的方案，旨在支持胸腺上皮细胞（TEC）的成熟与长期维持，以及体外胸腺生成。
本文内容
摘要
摘要
功能性且具有自我耐受性的T细胞库的生成是一个复杂过程，依赖于胸腺微环境，尤其是其细胞外基质（ECM）的特性。胸腺上皮细胞（TECs）在胸腺生成过程中起关键作用，通过清除自身反应性克隆来滋养并筛选发育中的T细胞。已有实验证实，TECs对ECM提供的物理和化学信号特别敏感，而传统的单层细胞培养会导致其功能迅速丧失直至死亡。由于TECs维持困难且相对稀少，尽管在模拟胸腺生物学方面具有重要意义 体外，能够长期且大规模地真实模拟胸腺上皮细胞（TEC）微环境的模型仍然缺乏。在此，我们描述了一种多细胞人源胸腺类器官模型的构建方法，其中胸腺上皮细胞（TEC）组分来源于人诱导性多能干细胞（iPSC），并与原代早期胸腺细胞前体在基于纤维蛋白的三维（3D）水凝胶中重新聚集。该模型满足了当前对可扩展培养系统的需求，能够重现胸腺微环境 离体 并展示其功能，即产生T细胞的能力以及在数周内支持胸腺类器官生长的能力。因此，我们提出一种实用的 体外 通过iPSC衍生的类器官构建胸腺功能模型，将有助于胸腺上皮细胞生物学及T细胞生成的研究 离体
引言
胸腺是一种初级淋巴器官，在产生具有免疫功能且耐受性良好的免疫系统中发挥着关键作用1,2,3早期胸腺前体细胞（ETPs）从骨髓迁移至胸腺，在此扩增并分化为功能性T细胞1,2,4,5这些过程由一类特殊的细胞群体——胸腺上皮细胞（TECs）介导。2,6,7胸腺上皮细胞（TECs）来源于胸腺上皮祖细胞（TEPs）。8,9 包括皮质胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质胸腺上皮细胞（mTECs），它们在构建T细胞迁移、扩增和成熟所需的特异性三维微环境方面发挥特定作用。胸腺上皮细胞主要通过提供生长因子和分化因子来介导T细胞的发育过程。1,10,11 并通过呈递自身抗原，对无功能性和不耐受的胸腺细胞进行阴性筛选5,7,12发育中的T细胞与胸腺上皮细胞之间的复杂相互作用在胸腺上皮细胞群体的成熟和三维结构形成过程中也起着核心作用，这一过程被称为胸腺交互作用。1,11. 胸腺中不同细胞群体之间的相互作用在很大程度上依赖于由细胞外基质（ECM）所形成的特定微环境。胸腺ECM与胸腺细胞群体之间处于动态互作状态，不仅影响基因调控，还通过细胞分泌的酶或基质蛋白不断被重塑。13细胞外基质通过调节生长因子和细胞因子的生物可利用性、经由整合素等膜结合受体进行直接信号传导，以及通过物理力改变细胞骨架结构，从而影响细胞行为。14胸腺ECM成分（如胶原蛋白和层粘连蛋白）已被证明对TGFb和FGFs等生长因子具有高亲和力，这些生长因子对于胸腺上皮细胞（TEC）的维持至关重要，并起到固定作用 通过形成复合物来调控它们。胸腺ECM的可塑性、弹性模量和密度在指导胸腺上皮细胞（TEC）命运以及塑造胸腺的区室化结构中也起着关键作用，而这种区室化结构对其功能至关重要。这些线索强调了在模拟胸腺时必须考虑ECM及其三维结构的重要性 离体这一点得到了以下事实的支持：在经典细胞培养体系中，原代胸腺上皮细胞会迅速去分化，失去其功能，并最终死亡15,16,17.
已开发出培养模型，用于扩增来自人胸腺组织外植体的功能性胸腺上皮细胞（TEC）群体，以保留细胞外基质（ECM）的结构及其为TEC提供的关键信号线索18,19,20该培养体系能够成功扩增并维持一群功能性的胸腺上皮细胞（TECs） 体外 但无法在培养7至8天后持续维持18因此，开发一种可及且实用的三维培养系统，能够重现胸腺微环境及其功能 体外 从长远来看，这是该领域的一个关键利益所在。最近，基于水凝胶的三维培养系统的开发催生了多种人工胸腺类器官系统，标志着该领域取得了重大进展 体外 胸腺建模15,16,21,22我们开发了一种人源胸腺类器官（hTO）共培养系统，通过将人原代早期T细胞前体（ETP）与来源于诱导性多能干细胞（iPSC）的人T系祖细胞（TEP）重聚形成球状体，并将其接种于纤维蛋白水凝胶上实现。
本研究中材料的选择和水凝胶体系的设计旨在模拟胸腺细胞外基质的天然结构，同时兼顾实用性，并能够扩大工艺规模，以获得价格低廉且来源充足的实验材料。15该hTO系统具有多向分化潜能，并可支持从ETP进行有效的胸腺生成23该类器官系统为研究胸腺内细胞相互作用以及建模正常与病理状态下的人类淋巴细胞生成提供了可靠的工具。诱导性多能干细胞（iPS细胞）的应用还为该模型引入了基因编辑能力。将诱导性多能干细胞（iPSC）有效分化为功能性胸腺组织是该领域过去15年来的长期目标，目前在解析胸腺上皮细胞（TEC）谱系命运决定信号方面已取得显著进展。21,24,25,26,27.为了满足这一需求 体外 3D 胸腺模型，本技术说明详细描述了逐步生成由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的人胸腺类器官的方法与技术细节，重点包括水凝胶支架的形成、细胞微团重聚与接种，以及类器官的培养与收获。
方案
hiPSC 细胞系 hiN.Fm.m.Lon71.019 来源于男性成年成纤维细胞，通过 mRNA 转染进行重编程。hiPSC 细胞系 hiN.Fm.f.Lon80.002 来源于女性成年成纤维细胞，通过 mRNA 转染进行重编程。hiPSC 细胞系 hiN.Fs.f.MIPS203.003 来源于女性成年成纤维细胞，通过重组仙台病毒载体感染进行重编程。所有细胞系均由南特 iPSC 平台提供。患者已签署知情同意书，同意将其细胞用于科研目的（匿名样本收集，Lonza，货号 # CC-2511）。原始早期T细胞前体（ETP）通过分离中国台湾南特医院（CHU Nantes）儿科心脏手术患者同日术后废弃的匿名人类胸腺组织获得，该过程符合法国 CODECOH 法规，备案号 DC-2017-2987。
1. 将iPSCs定向分化为TEP细胞身份
注意：自 Lai 和 Jin 首次发表研究以来，已证实小鼠胚胎干细胞（ESCs）可向胸腺上皮细胞表型分化28已有多个研究开发并优化了将人iPS细胞定向分化为TEP细胞的方案21,24,25,26,27,29这些研究导致了表达胸腺上皮细胞身份标志物（如）的胸腺上皮前体细胞（TEPs）的分化 FOXN1 和 PAX924,25,28,30以及功能标记，例如 DLL4 和 AIRE26，但缺乏胸腺上皮细胞成熟的标志物24,25已有两种方法被证明可支持已分化的胸腺上皮前体细胞（TEPs）向成熟胸腺上皮细胞（TEC）身份的成熟：移植至体内 体内 小鼠等模型29，并在气液界面培养系统中重新聚集形成三维胸腺类器官体系21两种系统均证实了三维结构在维持和支持功能性胸腺上皮细胞群体成熟方面的重要作用，这些细胞具有支持能力 体内 或 体外 T淋巴细胞生成15,24,25,31.
- 本研究中使用的胸腺类器官系统，需按照 Provin 等人23 开发并详细描述的方案，将iPS细胞向TEP细胞身份进行分化。
2. 从儿童胸腺样本中分离原代早期T细胞前体细胞
注意：ETP 是起源于骨髓的前体细胞，可分化为胸腺中的 T 细胞谱系和树突状细胞，其表型如下：CD3- CD4- CD8- CD14- CD19- CD56- CD45+ CD34+ CD7+32,33。
- 耗竭磁珠的制备
- 前一日，将磁性细胞分离磁珠（材料表）转移至15 mL离心管中，加入4 mL分离缓冲液（PBS + 0.1% BSA + 2 mM EDTA）洗涤。
- 将离心管置于磁力架上，吸除上清液，再加入2 mL分离缓冲液。
- 向磁珠中加入小鼠抗人CD3、CD4和CD8抗体，于4 °C在振荡条件下孵育45分钟。将离心管置于磁力架上，用分离缓冲液洗涤数次，最后重悬于20 mL分离缓冲液中。
- 胸腺样本解离
- 将新鲜胸腺样本转移至盛有RPMI1640培养基（材料表）的培养皿中，使用无菌解剖剪刀和镊子将其剪切成约1 mm3大小的组织块。
- 用25 mL移液管反复冲洗培养基和组织碎片数次（培养基应逐渐变浑浊），静置使组织碎片沉降，收集一半上清液至50 mL离心管中。加入新鲜培养基重复此步骤，直至上清液保持澄清。
- 将收集的上清液分装至若干50 mL离心管中，于200 × g离心5分钟。
- 吸除上清液，将沉淀重悬于10 mL红细胞裂解液（材料表）中，在室温（RT）孵育5分钟，随后加入20 mL洗涤缓冲液（PBS + 0.5% BSA + 4 mM EDTA + 1%青霉素/链霉素）。
- 于200 × g离心5分钟，吸除上清液。将沉淀重悬于10 mL洗涤缓冲液中，经70 µm细胞筛过滤，计数细胞。
- ETP富集
- 细胞计数后，用洗涤缓冲液调整体积至每管10 mL。按每2亿个细胞加入500 µL磁珠（溶于20 mL分离缓冲液中）的比例加入细胞分离磁珠，于4 °C振荡孵育30分钟。
- 将离心管置于磁力架上2分钟，小心将上清液转移至洁净离心管中。取下离心管，用20 mL分离缓冲液清洗磁珠。涡旋混匀后再次置于磁力架上，收集上清液。重复此步骤两次。
- 将合并的上清液于200 × g离心5分钟。将沉淀重悬于2 mL分离缓冲液中，计数细胞。
- ETP分离
- 调整细胞浓度至每毫升2亿个细胞，并保留少量样本作为未染色对照。
- 使用小鼠抗人谱系标记（Lin）（CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD56）、CD7和CD34抗体对细胞进行标记（所有Lin标记物使用相同的荧光染料），于4 °C孵育45分钟。
- 用等体积的洗涤缓冲液洗涤细胞，于200 × g离心5分钟，将沉淀重悬于1 mL缓冲液中，计数细胞。
- 调整细胞浓度至每毫升5千万个细胞，并经70 µm细胞筛过滤。
- 加入所选的活细胞标记物，使用配备70 µm喷嘴的流式细胞仪分选活的Lin⁻ CD34⁺ CD7⁺细胞。
3. 三维胸腺类器官培养
- TEP 制备
- ETP 分离后立即在第13至15天检测TEP培养物的质量。确保细胞达到汇合状态，形成致密的单层，并出现隆起图1).
- 为收获已分化的 TEPs，用 DPBS-/- 洗涤细胞，移除液体后加入 1 mL TrypLE（材料表每孔加入，并在 37 °C 下孵育 5–7 分钟。
- 加入1 mL XVIVO10（材料表每孔加入适量溶液，反复冲洗以使细胞脱落，转移至15 mL离心管中，200 x g离心 g 用于 5 分钟
- 移除上清液，将沉淀重悬于1 mL XVIVO10中，并计数细胞。
注意：为提前评估分化效率，需单独使用培养孔，并验证相关标志物的表达情况 FOXN1 和 PAX9 通过RT-qPCR检测，并通过流式细胞术计算分化效率（定义为EPCAM+ CD205+细胞所占比例，应高于50%）（图1在此分化阶段，几乎所有EPCAM+细胞也呈CD205阳性，表明其前体细胞身份。11.
- ETP 制备
- ETP 分离后立即以 200 x g 孵育5分钟。将沉淀重悬于1 mL XVIVO10中，并计数细胞。
- 胸腺类器官聚集
- 用移液器吸取适量体积，将两种细胞悬液混合，使终浓度为每毫升含 200,000 个 TEP 和 40,000 个 ETP，轻轻吹打混匀一次。
- 根据需要添加适当的补充剂 表1，每孔加入100 µL混合细胞悬液至低吸附U型底96孔板中。可使用多通道移液器以提高操作效率；然而，使用传统的单通道移液器可减少珍贵细胞样本的损失。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 过夜。
- 水凝胶的制备
注意：用于水凝胶形成、类器官接种和培养基分布的实验装置如图所示 图2.- 第二天（类器官培养阶段的第1天），解冻凝血酶（10 U/mL）、抑肽酶（26,000 U/mL）和纤维蛋白原（8 mg/mL）的等分试样材料表将凝血酶和抑肽酶在冰上解冻，纤维蛋白原在37 °C水浴中解冻（切勿置于冰上，否则会沉淀）。不要涡旋，将分装样品置于超净台内，通过轻柔吹打混匀。
- 根据所提供的比例，准备与所培养类器官数量相对应的悬挂式培养插件 表2用无菌镊子将插入物放入培养板孔中，并在培养板中至少留出一列或一行为空。
- 准备与待制备凝胶数量相同的 1.5 mL 离心管。在每管中，先用移液器加入凝血酶原和抑肽酶所需的体积，具体如下所述 表2.
- 在一个 第二次操作时，将所需体积的凝血酶加入单个离心管中，迅速吹打混匀2次，避免产生气泡以确保试剂充分混匀，然后吸取管内全部液体，迅速将混合液冲洗至悬挂式插件中。将移液枪垂直置于插件中央上方，轻轻冲洗试剂混合物，避免产生气泡。
注意：此步骤中操作速度至关重要，因为试剂会在几秒钟内发生聚合，必须充分混匀以避免凝胶中产生结块或密度不均。每次处理一个孔，每个孔使用新的1.5 mL离心管（若重复使用同一离心管，残留的固体凝胶颗粒可能堵塞移液器吸头）。若因凝血酶活性过高导致聚合过快，可采用1:2稀释。浇注后，凝胶应呈透明至微半透明状，当将培养板垂直倾斜时，数秒内仍应具有流动性。 - 37 °C 下孵育至少 1 小时，直至透明溶液凝固并变为不透明的白色，且当培养板垂直倾斜时凝胶仍能牢固固定在原位（图2A).
- 类器官接种
- 验证聚集步骤的质量。确保微团形成球形的细胞团，具有致密的核心，并被一层密度较低的ETP细胞晕环绕。图3).
- 剪切P200吸头尖端，并用抗黏附溶液清洗材料表将培养板倾斜至接近垂直的位置以收集细胞团：微团将沉降至孔的下壁，可通过在吸液的同时逐步将移液枪头推至孔底而轻松回收。
- 将细胞悬液轻柔地接种于水凝胶顶部，注意移液枪头勿接触凝胶表面，接种比例遵循下文所示。 表1 (图2B）。即使类器官在此阶段看似悬浮，当培养基使其膨胀后，凝胶会软化，类器官将嵌入上层。在显微镜下检查，确保P96孔板各孔中无残留类器官。
- 根据要求配制所需体积的培养基 表1 和 表2，每个孔中，先沿插入物的壁面缓慢加入上层水凝胶体积的四分之一，避免触碰水凝胶；再将移液枪置于悬空插入物的臂之间，向孔底部加入剩余的四分之三体积图2C).
- 在空的培养孔中加入 1 mL PBS，以维持培养板内的湿度。于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。2.
- 胸腺类器官培养
- 第2天，检查类器官是否接种良好：水凝胶必须保持在原位，且类器官不得沉降至插入物底部。
- 按照要求配制所需量的培养基 表1 和 表2用吸液头在悬空插入物的臂之间小心吸取培养基，注意不要触碰凝胶。以同样方式将移液管置于相同位置加入新的培养基。
- 每2天更换一次培养基，更换为第二阶段培养基（表12至4天后（自TEP分化开始起第18天）。
注意：该类类器官批次可在培养条件下维持长达6周。
- 类器官收获
- 准备一个15 mL离心管，每孔加入1 mL TrypLE用于收集细胞。
- 剪下P1000枪头的尖端，并将其浸入抗黏附溶液中进行包被。将移液枪垂直置于小室中央，轻柔吸取凝胶（注意避免刺穿膜），转移至含TrypLE的离心管中。用TrypLE冲洗小室的膜，一并转移至该离心管中。
- 37 °C孵育15分钟，每5分钟轻轻涡旋振荡一次。确保凝胶和类器官完全解离。
- 15分钟后，用70 µm滤网过滤，200 x g离心 g 用于 5 分钟。将沉淀重悬于洗涤缓冲液中，随后进行选定的分析方法。
结果
该实验方案的工作流程如图4所示。在此3D类器官培养模型中，我们采用了一种凝血酶与纤维蛋白原水凝胶，该凝胶此前已被我们团队用于维持原代小鼠胸腺上皮细胞（mTECs）数天，这得益于其提供的物理与力学信号34。聚合完成后，凝胶应呈现出疏松、海绵状的网状结构（图5）。
在初始接种和贴壁阶段后，类器官在凝胶表面及其最上层内部逐渐生长并发育。根据凝胶的特性、接种条件以及接种到凝胶上的类器官数量，类器官形成了从球形到椭圆形的结构（图6），并偶尔融合形成更大的结构。在培养的第一周后，观察到类器官内部存在两种特定的组织亚层次：首先，我们观察到由大细胞从类器官向外辐射并朝各个方向定植于水凝胶中，形成类似细胞表面突起的长条状结构（图6 和 图7）；其次，我们观察到由较小细胞聚集在这些细胞突起周围形成的团簇样结构。尽管我们未能分离这两种细胞类型以验证研究假设，但这一现象类似于胸腺皮质内存在的三维结构，即单个胸腺上皮细胞（cTECs）与大量更小的正在发育的T细胞相互作用所形成的胸腺哺育细胞复合体11（图8）。
在类器官培养阶段的多个时间点，我们通过流式细胞术评估了胸腺类器官的细胞组成，鉴定出几个关键的细胞群：胸腺上皮细胞（TEC，特征为 EPCAM+ CD45-）、胸腺细胞（thymocytes，EPCAM- CD45+ CD3+）（图9），以及一个包含胸腺造血非胸腺细胞亚群的 EPCAM- CD45+ CD3- 细胞群。更多细节见 Provin 等人23。
图1：iPSC向TEP分化的表征。（A）iPSC向TEP分化第13天的示例，倒置相差显微镜，400倍放大。比例尺：500 µm。（B）点图示例，显示分化第14天DAPI阴性细胞中EPCAM+细胞的比例，图像来自FlowJo 10.0.7。（C）iPSC向TEP分化第16天的DAPI（蓝色）、PAX9（红色）和KRT8（绿色）免疫染色，采用免疫荧光与共聚焦成像。白色箭头指示抗PAX9染色的示例。比例尺：50 µm。（D）iPS向TEP分化过程中FOXN1（相对于GAPDH的RQ值）的表达水平。TEC：阳性对照参考，从儿童胸腺样本中分离的原代人胸腺上皮细胞。图表来自Prism（GraphPad 8.0.1版）。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：水凝胶形成、类器官接种及培养基分布的实验设置。（A）培养板中，悬挂式插件的顶部和底部行已浇铸水凝胶。（B）类器官接种：将含有1个类器官的截短移液头置于水凝胶上方但不接触，轻柔地将类器官接种至凝胶表面。（C）通过将移液枪头置于悬挂式插件的臂之间，将培养基加入培养孔中。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：接种前胸腺类器官培养物的 D0 阶段（完整方案的第13-15天）。（A）由 Lon71.019 iPS 细胞系衍生的胸腺上皮细胞（TEC）生成的类器官。（B）由 MIPS203.003 iPS 细胞系衍生的胸腺上皮细胞（TEC）生成的类器官。倒置相差显微镜，1000×。比例尺：500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：本实验方案各步骤的汇总示意图。 收集儿童胸腺样本并进行解离，通过流式细胞术分选出 Lin- CD34+ CD7+ 的早期胸腺前体细胞（ETP）。将诱导多能干细胞（iPS细胞）定向分化为TEP样细胞。将原代ETP与iPS来源的TEP混合，接种于低吸附96孔板中，过夜形成胸腺类器官。使用抑肽酶、纤维蛋白原和凝血酶制备纤维蛋白水凝胶，并浇注至悬滴培养插件中。待凝胶聚合后，将类器官接种于水凝胶表面，并向孔板中加入第一阶段培养基。类器官可维持培养长达6周。图示使用BioRender绘制，出版许可编号 AG26EFCZOM。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 5：水凝胶的组织结构。 倒置相差显微镜，1000倍放大。比例尺：500 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图6：成熟的类器官及其三维结构。（A）第24天三维培养的胸腺类器官，iPS细胞系MIPS203.003。（B）第32天三维培养的胸腺类器官的合成图像，iPS细胞系Lon71.019。倒置相差显微镜。比例尺：500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 7：胸腺类器官的结构细节。 （A）第32天三维培养的胸腺类器官，L71.019 诱导多能干细胞系。 （B）第27天三维培养的胸腺类器官，L80.002 诱导多能干细胞系。倒置相差显微镜，400倍。比例尺：500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8：三维培养第32天胸腺类器官的结构细节。 白色箭头指向紧邻胸腺上皮细胞（TEC）增殖的小型胸腺细胞簇。倒置相差显微镜，400倍放大。比例尺：500 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
图9：胸腺类器官中T细胞组分的比例。（A）点图示例，显示三维培养第35天胸腺类器官中活细胞（DAPI-）内CD45+ CD3+ 细胞的比例，图像来自FlowJo 10.0.7。CD45+ CD3- 细胞群为造血非胸腺细胞。（B）三维培养第17、24/25、32和39/40天胸腺类器官中活细胞内CD45+ CD3+ 细胞的比例，n=2，技术重复2-3次，图表来自Prism（GraphPad 8.0.1版）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 单位 | 第1阶段培养基 第14天至第18天 | 第2阶段培养基 第19天起 | |
| 基础培养基 | XVIVO10 | XVIVO10 | |
| BMP4 | ng/mL | 50 | |
| FGF8 | ng/mL | 10 | |
| FGF10 | ng/mL | 10 | |
| IGF1 | ng/mL | 10 | |
| EGF | ng/mL | 10 | |
| RANK L | ng/mL | 50 | 50 |
| IL7 | ng/mL | 5 | 5 |
| FLT3 L | ng/mL | 5 | 5 |
| SCF | ng/mL | 10 | 10 |
| Glutamax | ng/mL | 1% | 1% |
表1：补充剂及其相应浓度。
| 抑肽酶 (µL) | 凝血酶 (µL) | 纤维蛋白原 (µL) | 第一阶段培养基 | 类器官 (单位) | |
| 24 孔板 | 5 | 75 | 75 | 1 | 3 至 5 |
| 12 孔板 | 9.2 | 138.2 | 138.2 | 1.8 | 5 |
| 6 孔板 | 16 | 240.8 | 240.8 | 3.2 | 8 至 9 |
表2：在6孔、12孔和24孔板中制备水凝胶及接种类器官所需的各组分比例
讨论
与传统的二维单层培养，甚至与更先进的现有三维模型（如再聚集胸腺器官培养，RTOC）相比，本文所述模型具有显著改进。从技术角度来看，该模型具有更好的可扩展性和可重复性，因为胸腺上皮细胞（TEC）来源于可自我更新的诱导多能干细胞（iPS细胞）。此外，该模型允许在iPSC阶段进行基因编辑，从而更便于开展TEC中的基因敲入或敲除研究。本研究中展示的胸腺类器官存活能力显著，相较于二维培养或RTOC培养具有明显优势，T细胞生成可持续长达6周（图9）。因此，胸腺类器官中三维结构和细胞外基质（ECM）特性的重建，维持了胸腺的长期功能，即能够从最成熟的胸腺细胞区室生成T细胞——在三维培养约第4周时出现近期胸腺移行细胞，并生成CD4+和CD8+ T细胞23。
由于胸腺微环境支持强烈的扩增和分化活动，适当的气体交换是任何实验中的一个关键参数 体外 胸腺模型。事实上，在富氧环境或气液界面条件下维持的模型中，已观察到更优的结果。21,35我们的观察结果支持这一观点，并强调了在气液界面下方的水凝胶顶部正确接种类器官的重要性。若聚合过程存在缺陷，导致水凝胶呈黏性甚至液态，则会引起类器官沉降至插入物底部，从而阻碍其生长。芯片上与内皮细胞共培养是一种有前景的替代方案，可通过引入血管化来突破这一限制。本研究中生成的胸腺类器官尺寸局限于约5 mm，据推测是由于核心区域缺乏有效的气体和营养物质交换所致。因此，实现血管化将有助于扩大培养规模，并结合工艺优化，实现含有数百万胸腺上皮细胞（TECs）和T细胞的类器官生产。水凝胶的密度也是一个关键参数，而其在不同批次间的可重复性则是本方案的主要局限之一，原因在于所用酶对冻融循环高度敏感。水凝胶浇铸步骤是本方案中的关键环节，我们建议在每次计划实验前1小时预先浇铸一份水凝胶进行测试，以验证试剂活性。若因酶活性不足导致聚合不完全，且考虑到iPSC来源的胸腺祖细胞（TEPs）成本较高，除使用新鲜分装的试剂重新开始实验外，不建议采取其他故障排查措施。胸腺上皮细胞（TECs）是细胞外基质（ECM）的重要生产者；然而，鉴于近年来对胸腺成纤维细胞作用机制的理解不断深入，将经辐照处理的成纤维细胞群体加入类器官模型中可能具有研究价值。这类细胞可分泌生长因子和细胞外基质，有助于更真实地模拟胸腺微环境，从而对TECs和T细胞的分化与维持产生积极影响。当前胸腺类器官模型的另一重要局限在于缺乏正常的皮质-髓质分区结构。由于已有研究表明胸腺的被膜成纤维细胞在皮质形成过程中发挥塑造作用，将其引入培养体系可能有助于克服这一缺陷。因此，本方案为构建复杂的胸腺类器官模型奠定了基础 体外 胸腺模型。该方法结合了诱导多能干细胞胸腺分化、基于三维水凝胶的培养以及 体外 淋巴细胞生成。该模型可进一步优化以提高可扩展性并增加复杂性，例如通过引入间充质和血管区室。因此，该模型有望成为研究免疫机制或开发个性化T细胞疗法的重要研究平台。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢法国南特iPSC核心设施中心成员，该中心由Laurent David负责。本工作由ANR资助的JP-Rare疾病JTC2019项目TARID（EJPRD19-208，项目编号ANR-19-RAR40011-5）支持，资助对象为M.G. 由法国卢瓦尔河地区大区（la Région Pays de la Loire）授予 M.G. 的 RFI Bioregate 项目（ThymIPS）资助， 由法国国家研究局（ANR-22-CE15-0045）资助给 M.G. 和 "SATT Ouest Valorisation" 项目OrgaTreg由M.G.和N.P.负责，得到资助 "企业基金会 ProGreffe"M.d.A. 获得了资助 "医学研究基金会". 感谢南特iPSC核心设施（由IBiSA和Biogenouest支持）提供资源使用和技术支持。 本工作部分由法国国家科研署通过“未来投资计划”资助的Labex IGO项目（ANR-11-LABX-0016-01）提供资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抑肽酶 | Sigma Aldrich | 616370 | |
| BMP4 | Miltenyi | 130-111-165 | |
| CCR7 (CD197) | BD Biosciences | PE | 克隆：3D12；稀释比例：1:200 |
| CD14 | BD Biosciences | FITC | 克隆：M5E2；稀释比例：1:200 |
| CD19 | BD Biosciences | PE | 克隆：HIB19；稀释比例：1:200 |
| CD205 | BioLegend | FITC | 克隆：MG38；稀释比例：1:200 |
| CD3 | BD Biosciences | PE | 克隆：HIT3a；稀释比例：1:200 |
| CD34 | BD Biosciences | FITC | 克隆：8G12；稀释比例：1:100 |
| CD4 | BD Biosciences | PE | 克隆：RPA-T4；稀释比例：1:100 |
| CD4 | BD Biosciences | BV711 | 克隆：L200；稀释比例：1:200 |
| CD45 | BD Biosciences | PerCP | 克隆：HI30；稀释比例：1:200 |
| CD56 | BD Biosciences | PE | 克隆：B159；稀释比例：1:200 |
| CD62L | BD Biosciences | BV605 | 克隆：DREG-56；稀释比例：1:200 |
| CD69 | BD Biosciences | BV510 | 克隆：FN50；稀释比例：1:200 |
| CD7 | BD Biosciences | APC | 克隆：M-T701；稀释比例：1:200 |
| CD8 | BD Biosciences | PeCy7 | 克隆：RPA-T8；稀释比例：1:200 |
| CD8 | BD Biosciences | PE | 克隆：HIT8a；稀释比例：1:200 |
| Dynabeads Pan Mouse IgG | Invitrogen | 11041 | |
| EGF | Miltenyi | 130-097-751 | |
| EPCAM (CD326) | BD Biosciences | PE | 克隆：HEA-125；稀释比例：1:200 |
| EPCAM (CD326) | Miltenyi | BV711 | 克隆：EBA-1；稀释比例：1:200 |
| FGF10 | Miltenyi | 130-127-858 | |
| FGF8 | Biotechne R&D | 423-F8 | |
| 纤维蛋白原 | Sigma Aldrich | 341578 | |
| FLT3 L | Peprotech | AF-300-19 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-61 | |
| IGF1 | Miltenyi | 130-093-886 | |
| IL7 | Peprotech | AF-200-07 | |
| RANK L | Biotechne R&D | 6449-TEC | |
| 红细胞裂解液 | Miltenyi | 130-094-183 | |
| RPMI1640 | Gibco | 11875093 | |
| SCF | Peprotech | AF-300-07 | |
| 凝血酶 | Sigma Aldrich | 605190 | |
| TrypLE | Gibco | 2605010 | |
| XVIVO10 | Lonza | LONBE04-380Q |
参考文献
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).
- Miller, J. F. A. P. The function of the thymus and its impact on modern medicine. Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).
- Haddad, R., et al. Dynamics of thymus-colonizing cells during human development. Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).
- Cumano, A., et al. New molecular insights into immune cell development. Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).
- Bautista, J. L., et al. Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla. Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).
- Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC. Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).
- Alves, N. L., et al. Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments. Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).
- Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
- Tavian, M., Peault, B. Embryonic development of the human hematopoietic system. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).
- Abramson, J., Anderson, G. Thymic epithelial cells. Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Sharma, H., Moroni, L. Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation. Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci STKE. 2002 (119), 6(2002).
- Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).
- Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation. Biomaterials. 118, 1-15 (2017).
- Asnaghi, M. A., et al. Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells. Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).
- Villegas, J. A., et al. Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality. Front Immunol. 9, 1663(2018).
- Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla. Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).
- Campinoti, S., et al. Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds. Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).
- Ramos, S. A., et al. Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).
- Fan, Y., et al. Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts. Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).
- Provin, N., et al. Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development. bioRxiv. 2023, 572664(2023).
- Parent, A. V., et al. Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development. Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).
- Sun, X., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo. Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).
- Inami, Y., et al. Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype. Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).
- Gras-Pena, R., et al. Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus. J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).
- Lai, L., Jin, J. Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).
- Ramos, S. A., et al. Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).
- Provin, N., Giraud, M. Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED. Front Immunol. 13, 930963(2022).
- Montel-Hagen, A., et al. In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells. Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).
- Park, J. -E., et al. A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation. Science. 367 (6480), 3224(2020).
- Flippe, L., et al. Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).
- Padonou, F., et al. Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium. EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).
- Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis. Front Immunol. 12, 652665(2021).
重印与许可
标签
