本方案描述了从原代人卵巢表面上皮（hOSE）细胞建立三维（3D）组织类器官的方法。该方案包括从新鲜采集的卵巢组织中分离hOSE细胞、hOSE细胞的扩增培养、冻存与复苏操作，以及类器官的衍生过程。同时包含免疫荧光染色、定量分析，以及作为筛选平台的应用展示。
本文内容
摘要
摘要
卵巢表面上皮（OSE）是卵巢的最外层，在每次排卵过程中会发生破裂，并在恢复卵巢完整性的同时，在卵巢伤口愈合中发挥关键作用。此外，OSE可能也是上皮性卵巢癌的来源。尽管小鼠中OSE的再生特性已被广泛研究，但由于难以获取人卵巢组织以及缺乏合适的人体in vitro培养方案，目前对人类卵巢组织修复机制的理解仍受到限制。组织特异性类器官是一种微型化的in vitro模型，能够模拟原始器官的结构和功能特征，为研究器官生理、疾病建模及药物筛选提供了新的机遇。
本文介绍了一种从完整卵巢组织中分离原代人卵巢表面上皮细胞（hOSE）并建立hOSE类器官的方法。我们对不同供体来源的细胞进行了形态学和细胞学表征，展示了供体间的异质性。此外，我们还展示了该培养方法在为期两周的时间内评估激素对OSE类器官生长影响的能力。该方法可能有助于发现参与OSE再生的关键因素，并推动针对恶性OSE的个体化药物筛选。
引言
卵巢被认为是人体内最富动态变化的器官之一，在个体整个生殖生命周期中持续经历着反复的伤口愈合与组织重塑过程。每次排卵周期后，卵巢组织再生的主要参与者是卵巢表面上皮（OSE）1。OSE 是一种来源于间皮的单层结构，包含扁平、立方和柱状的上皮细胞，覆盖整个卵巢表面2。在排卵前，排卵卵泡表面的卵巢间质组织发生蛋白水解性破裂，以释放卵丘-卵母细胞复合物。随后，这一受损区域（称为排卵裂孔）被修复，在小鼠中可在不到72小时内实现卵巢表面的完全闭合3。OSE 具有高效增殖并闭合排卵伤口的能力，提示其内部可能存在定居的干细胞群体4。由于来自育龄供体的人卵巢组织极为有限，目前关于 OSE 修复机制的大部分知识均来源于动物模型。然而，物种间的特异性差异限制了将基于动物的卵巢研究成果转化为人类应用5。
体外 研究主要采用人卵巢表面上皮细胞（OSE）的二维（2D）培养，即细胞在培养板表面形成单层贴壁生长，因其成本低且操作简便而被广泛使用6,7,8然而，这种方法在模拟卵巢组织动态复杂性方面存在局限性9在这方面，以卵巢类器官为重点的三维细胞培养平台彻底改变了卵巢研究10组织类器官是微型化的 体外 源自其来源器官的三维类器官，具有自我组织能力，并能模拟来源器官的关键结构与功能 体内 对应物11该技术为揭示人类卵巢发育、再生及组织修复中的基本问题提供了可能10近年来，研究人员还将卵巢类器官的相关知识应用于构建患者特异性的卵巢癌（OC）类器官，以进行疾病建模和个体化医疗。12,13,14.
基于小鼠卵巢表面上皮（OSE）类器官和输卵管（FT）类器官15,16以及人卵巢表面上皮（OSE）类器官12和输卵管（FT）类器官17的不同构建方法，本文描述了一种从人卵巢组织中建立人卵巢表面上皮类器官（hOSE类器官）的实验方案，该方案在卵巢表面上皮再生研究中具有潜在应用价值。本方案可高效地从完整的人卵巢组织中分离原代OSE细胞，并详细介绍了二维细胞扩增和三维hOSE类器官生成的分步操作流程。所获得的hOSE类器官在形态和生长特性方面表现出供体特异性的差异，凸显其在个体化研究中的应用潜力。此外，本方案还涵盖了在同一培养板内进行hOSE类器官的维持、传代及免疫荧光检测的操作步骤。同时，方案系统描述了hOSE类器官可能呈现的多种形态特征，并表征了其在培养过程中免疫表型的变化。最后，通过评估环境信号（如卵巢激素）对hOSE类器官数量和大小的影响，展示了该类器官在功能研究中的应用价值。
hOSE类器官技术的应用将增进我们对卵巢的理解，特别是针对其显著再生能力相关机制的研究。随着三维人类卵巢模型的不断发展，卵巢研究中对动物模型的依赖将减少，从而推动再生医学领域的创新疗法18。
方案
本研究遵循《赫尔辛基宣言》的指导原则进行。研究方案已提交至莱顿大学医学中心（LUMC）医学伦理委员会，并在研究开始前获得无异议函（B18.029）。所使用的原代人卵巢组织来自在荷兰阿姆斯特丹VUmc医院接受性别肯定手术的跨性别男性个体。所有供体均签署了知情同意书。本方案中使用的所有材料均列于材料表中。
1. 人原代OSE细胞的分离
- 切除卵巢后，将卵巢置于0.9% NaCl或类似的无菌生理盐水中，并在冰上运送至实验室。
- 将单个卵巢转移至含有2–3 mL消化液（表1）或足以覆盖卵巢的消化液的50 mL锥形管中。
注意：如果卵巢不完整（部分器官已被切下用于组织学分析），切勿将消化液覆盖在该破损区域。 - 将锥形管置于预热的珠浴（或水浴）中，在37 °C下孵育30分钟。
- 小心地将卵巢转移至含有10 mL收集液（表1）的60 mm培养皿中。
- 使用细胞刮匙轻轻刮取含有hOSE细胞的卵巢表面。在培养基中清洗刮匙，并重复此步骤至少三次（图1）。
注意：如果卵巢不完整，应避免刮取和浸没受损区域，以尽量减少非目标细胞类型的污染。 - 将收集液中的hOSE细胞转移至15 mL离心管中。
- 在240 × g下离心5分钟，沉淀hOSE细胞。
- 如果沉淀呈现红色，提示存在红细胞（RBC）污染，用1 mL红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。室温（RT）孵育3分钟，期间偶尔吹打混匀，加入4 mL含钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS+/+），在240 × g下离心5分钟。若红细胞仍存在，重复此步骤。
- 对hOSE细胞沉淀进行冷冻保存（第2节），或用于二维培养（第3节）或三维类器官培养（第4节）（图1）。
2. hOSE 细胞的冷冻保存与解冻
- 冷冻保存
- 用1 mL细胞冻存液重悬hOSE细胞沉淀。
- 将细胞悬液转移至冻存管中（每卵巢使用2支冻存管）。
- 将冻存管放入冻存盒中，并于-80 °C过夜。
- 将冷冻后的冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。
- 解冻：
- 从液氮中取出冻存管。
- 将冻存管放入预热的珠浴仪（或水浴）中，在37 °C下放置5分钟，或直至冻存管内仅可见少量冰核。
- 用移液器将hOSE细胞悬液转移至含10 mL收集培养基（表1）的15 mL离心管中。
- 在240 × g 条件下离心5分钟。
- 将获得的hOSE细胞沉淀用于二维培养（第3节）或三维类器官培养（第4节）。
3. 单层培养2D hOSE细胞
- 将hOSE细胞沉淀用1 mL OSE_2D培养基（表1）重悬，并转移至12孔板中的一个孔内。
- 向孔中再加入1 mL OSE_2D培养基，在37 °C、加湿的培养箱（5% CO2）中培养72小时，以确保hOSE细胞在首次换液前充分贴壁。
- 每2–3天更换一次培养基，直至hOSE细胞达到70%–90%融合度（P0）（图2A）。
注意：如果培养物中仍存在红细胞，它们将在首次换液时被去除，仅有hOSE细胞保留在孔壁上贴壁生长。 - 传代hOSE细胞时，请按以下步骤操作：
- 移除孔内的培养基。
- 用1 mL无菌PBS洗涤细胞。
- 吸除PBS，加入足量0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液覆盖细胞表面。
- 将培养板置于37 °C、加湿的培养箱（5% CO2）中孵育4–7分钟，直至观察到细胞变圆并从孔壁脱落。
- 加入1 mL收集培养基以终止酶反应。
- 收集hOSE细胞，于240 × g 离心5分钟。
- 按所需密度将细胞接种至新的孔中，每2–3天更换培养基，直至hOSE细胞再次达到70%–90%融合度，随后重复步骤3.4。
注意：原代hOSE细胞最多可传代三次；此后大部分细胞将进入衰老状态（图2A）。
- 可将扩增后的hOSE细胞用于进一步表征，例如免疫荧光分析（图2B），以检测不同培养基的影响（图2C），或用于三维类器官培养（第4节）。
4. 人卵巢表面上皮类器官的三维培养
- 将多孔板玻片预热至 37 °C。
- 使用自动细胞计数器或血细胞计数板对新鲜分离或冻存-解冻的hOSE细胞进行计数。
- 重悬所需数量的hOSE细胞于1 mL冰上预冷的OSE类器官基础培养基中（表1) 置于1.5 mL离心管中。
- 以 240 x g 离心 g 5 分钟。
- 将hOSE细胞沉淀重悬于适量预冷的未稀释基底膜提取物（BME）溶液中，调整细胞浓度至1 x 10⁶4 细胞/10 µL BME
- 用移液器反复吹打hOSE-BME溶液，以确保均匀分布。
- 在预热的多孔板载玻片中，每孔加入10 µL hOSE-BME溶液形成液滴。
注意：确保每个液滴位于孔的中心，以获得完整的液滴形状。 - 将含有液滴的培养板倒置于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中2）15 分钟，以使凝胶凝固。
- 加入100 µL OSE_3D培养基（表1）以及在加湿培养箱中于 37 °C 培养（5% CO2).
- 每3-4天更换一次培养基。
注意：人卵巢表面上皮类器官在培养中至少可持续生长至28天图3A，B），但建议每14至28天传代一次（生长速率取决于供体以及原代与冻存的hOSE细胞状态），以促进细胞增殖和类器官存活。三个独立的hOSE类器官系均成功传代至少4次，且未出现衰老迹象。hOSE类器官呈现不同的形态特征（图3C). - 用于hOSE类器官的传代：
- 吸除培养基，每孔加入 100 µL 冰冷的高级 DMEM/F12 培养基。
- 用 P1000 移液器吸头刮擦孔板底部，使凝胶液滴脱离。
- 将每个悬浮的凝胶液滴转移至1.5 mL离心管中。
- 将含有凝胶微滴的管子在240 x g下离心 g 5 分钟。
- 去除上清液，将沉淀重悬于300 µL细胞解离缓冲液中，将离心管置于预热的珠浴（或水浴）中，37 °C孵育5–10分钟。
注意：如果部分类器官仍保持完整，使用经胎牛血清包被的预冷移液枪头，上下吹打数次以机械性破坏类器官。用胎牛血清包被移液枪头可防止类器官黏附于枪头。 - 加入 300 µL hOSE 类器官基础培养基，240 x g 离心 g 5 分钟。
- 将沉淀重悬于适量未稀释的BME溶液中，按适当比例重新接种（将1滴液体内容分配至1-4滴），并按前述条件进行培养。
注意：类器官未被解离为单细胞，因此无法准确计数细胞以进行后续传代。
5. 三维人卵巢表面细胞类器官的全装免疫荧光染色
注意：如果使用适用于显微镜技术的多孔板载玻片，全 mount 免疫荧光染色可在同一培养孔（液滴内）中进行。
- 在室温下，用 4% 多聚甲醛（PFA）固定液滴中的 hOSE 类器官，孵育 20 分钟。
- 在旋转/摇动平台上，用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟，室温操作。
- 在液滴中加入 100 µL 通透缓冲液（表 1），室温孵育 15 分钟，对 hOSE 类器官进行通透处理。
- 用 100 µL 封闭缓冲液（表 1）在旋转/摇动平台上室温洗涤三次，每次 15 分钟，并在 4 °C 下封闭过夜（o/n）。
- 加入 100 µL 用封闭缓冲液稀释的一抗混合液，在 4 °C 下于旋转/摇动平台上孵育过夜（o/n）。
注意：一抗的种类、所标记的细胞类型以及用于验证表达的动物模型详见材料表12,19,20,21,22,23,24,25。 - 将培养板恢复至室温，在旋转/摇动平台上用 100 µL 封闭缓冲液洗涤三次，每次 15 分钟，室温操作。
- 加入 100 µL 用封闭缓冲液稀释的二抗混合液，在旋转/摇动平台上室温避光孵育 2 小时。
注意：所使用的二抗列表详见材料表。为避免光照，可将培养板置于暗盒中或用铝箔包裹。 - 在旋转/摇动平台上用 100 µL PBS 洗涤三次，每次 15 分钟，室温操作。
- 将培养板用铝箔包裹后，于 4 °C 保存，直至成像（图 4）。
6. hOSE 类器官大小的定量分析
- 在显微镜下拍摄10倍明场图像（TIFF格式图像）。
- 下载并安装Fiji软件（https://imagej.net/software/fiji/）26。
- 使用ImageJ软件Fiji测量hOSE类器官图像面积：
- 在Fiji中加载TIFF图像文件。
- 通过点击图像 > 调整 > 阈值，为软件设置识别上传明场图像中hOSE类器官（较暗区域）的阈值。调节上下限数值，直至大部分背景被去除，同时保留单个类器官。
- 通过点击分析 > 工具 > ROI，打开ROI工具。
- 选择魔棒工具，点击含有hOSE类器官的区域，直到看到黄色线条环绕整个类器官边缘。在ROI面板中，点击添加和测量，以获得该OSE类器官的面积值。
- 对每一个需要测量的hOSE类器官重复步骤6.3.4。
结果
2D hOSE 培养
新鲜分离的人卵巢表面上皮细胞（hOSE细胞）接种于12孔板中，培养3周。在此期间，细胞传代3次（图 2A）。原代培养的hOSE细胞在传代至第3代（P3）之前呈现铺路石样形态，此后开始出现衰老迹象，这与既往报道中hOSE细胞可传代时间有限的结果一致27此外，已发现小鼠OSE可发生上皮-间质转化（EMT） 体外，表现出成纤维细胞样的特征，例如肌动蛋白细胞骨架的重排和I型胶原的沉积19. 与此一致，ACTA2+CD44+ hOSE 在 P2 至 P3 期间表现出 COL1A1 的显著上调图2B），表明hOSE细胞在培养过程中发生了EMT。
TGF-β 信号通路是 EMT 的主要调控因子28，能够在多种上皮细胞类型中诱导 EMT29。尽管在 OSE_2D 培养基中未添加 TGF-β，但所添加的 FBS 可能含有可检测水平的该细胞因子30,31。因此，我们检测了 TGF-β I 型受体抑制剂 SB-431542 是否能够阻止 EMT，从而实现长期的二维培养。令人意外的是，在 OSE_2D 培养基中补充 10 µM SB-43154232会抑制细胞增殖（图 2C）。我们得出结论：TGF-β 信号对 OSE 细胞增殖至关重要，后续的二维培养实验均未添加该抑制剂。
3D hOSE 类器官培养
根据已发表的人类OSE类器官培养条件12，我们将hOSE类器官包埋于BME液滴中，并在OSE_3D培养基（含有标准浓度100 nM雌二醇）中培养长达28天。在培养7天内，许多由新鲜分离的OSE细胞获得的hOSE类器官呈囊状结构，平均直径为130 mm（图3A、B）。该结果与Kopper及其同事报道的从剪碎并经酶消化的人卵巢组织中建立hOSE类器官的结果相似12。有趣的是，在培养14天后，由新鲜分离的OSE细胞衍生的hOSE类器官比来自2D扩增OSE细胞的类器官更大（前者平均直径为160 mm，后者为100 mm）（图3B），这可能是由于2D扩增的OSE细胞增殖能力下降所致。此外，尽管许多3D hOSE类器官由单层扁平上皮细胞构成（图3C左上图），但部分类器官表现为立方形单层细胞结构（图3C右上图），另一些则呈现多层结构（图3C右下图）或形成无管腔的细胞簇（图3C左下图）。
为了检测是否可以使用OSE_2D培养基获得hOSE类器官，将 freshly isolated hOSE细胞包埋于BME液滴中，并在OSE_2D培养基中培养12天。培养6天后可见纺锤形细胞，提示hOSE细胞在液滴中发生了EMT。重要的是，使用OSE_2D培养基未形成任何hOSE类器官（图3D）。
人卵巢表面上皮类器官的细胞特征
在成人卵巢中，角蛋白8（KRT8）特异性地标记卵巢表面上皮（OSE）细胞群体（图4A），因此，人卵巢表面上皮（hOSE）类器官保留了KRT8的表达，证实了其细胞身份（图4B）。在小鼠OSE细胞中，Yes1相关蛋白（YAP1）的核定位特异性地与具有增殖能力并可在排卵后修复损伤区域的OSE干细胞/前体细胞相关24,33。在hOSE类器官中，无论其大小如何，大多数细胞均表现出YAP的核定位（图4B）。此外，还检测了其他在小鼠OSE细胞中报道表达的标志物，如CD4420和LGR522。有趣的是，CD44和LGR5均在较小的hOSE类器官（直径<100 µm）中表达，而在较大的类器官中，CD44和LGR5的表达似乎下调（图4B）。
接下来，我们探究了hOSE类器官是否表现出在BME包埋类器官中通常观察到的顶-基底极性（顶面朝内）34。利用基底外侧蛋白整合素β1（ITGB1）和顶侧蛋白podocalyxin（PODXL）来显示hOSE类器官中的细胞极性，结果证实hOSE类器官具有清晰的顶面朝内极性，且该极性与hOSE类器官的大小无关（图4B）。
人类OSE已知表达间充质标志物N-钙黏蛋白（CDH2），而上皮标志物E-钙黏蛋白（CDH1）仅限于柱状OSE细胞表达图4A)2有趣的是，本研究中获得的hOSE类器官表达了间充质标志物CDH2和波形蛋白（VIM），而具有立方/柱状上皮的大囊状hOSE类器官则同时为CDH1阳性以及CDH2和VIM阳性。图4C目前尚不清楚CDH1+ hOSE类器官是来源于初级的CDH1+ OSE细胞，还是来源于经历了上皮分化或（肿瘤性）转化的CDH1- OSE细胞。 体外25,35.
展示 hOSE 类器官的应用：排卵信号对 hOSE 类器官的影响
促卵泡激素和人绒毛膜促性腺激素可用于诱导卵泡生长和排卵；而排卵后，卵巢分泌的激素（如孕酮和雌二醇）浓度会显著升高36。为了展示 hOSE 类器官作为筛选平台的可用性，我们检测了这些激素对 hOSE 类器官的影响，并以类器官的数量和大小作为量化指标（使用 Fiji 软件进行分析）。为此，我们在不含雌二醇的 OSE_3D 培养基（无激素条件）以及分别含有不同浓度 FSH、hCG、雌二醇或孕酮的 OSE_3D 培养基中培养 hOSE 类器官（图 5A）。
在培养7天后，对来自3个不同供体（n=3）的冷冻-解冻（未扩增）人卵巢上皮细胞（hOSE细胞）所形成的hOSE类器官数量进行了每液滴定量分析（图5A，B）。每3天更换一次培养基。在含有激素的培养基与不含激素的培养基中，每液滴形成的hOSE类器官总数之间未观察到显著差异（图5A，B）。为了量化激素对类器官大小的影响，在培养14天后，对每种条件下的每个液滴进行成像，并使用Fiji软件测量其中最大的4个hOSE类器官的面积。有趣的是，在添加孕酮（1000 nM）或雌二醇（200 nM）的条件下，利用两个不同供体（n = 2）的细胞生成hOSE类器官时，每个液滴中均出现至少一个非常大的类器官（直径约700 µm）（图5C，D）。
图1：从完整卵巢中分离人卵巢表面上皮细胞（hOSE）的示意图。将卵巢在消化液中于37 °C孵育30分钟。通过轻柔刮取使hOSE细胞从卵巢表面脱落，随后可直接进行二维单层OSE培养，或包埋于基底膜提取物（BME）中进行三维hOSE类器官培养，亦可进行冷冻保存。冻存-复苏后的hOSE细胞可用于二维培养或三维类器官形成，而经二维扩增的hOSE细胞也可用于生成三维hOSE类器官。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：hOSE细胞的二维原代培养。（A）hOSE细胞在第0代（P0）、第2代（P2）和第3代（P3）的明场图像，显示典型的上皮细胞铺路石样形态。上方图中的比例尺为750 µm，下方图中的比例尺为125 µm。（B）P2和P3代hOSE细胞的ACTA2、CD44、COL1A1免疫荧光染色。比例尺为50 µm。（C）在P0、P2和P3代使用10 µM SB-431542培养的hOSE细胞的明场图像。细胞从P2代开始出现衰老迹象，在培养过程中未达到高融合度。上方图中的比例尺为750 µm，下方图中的比例尺为125 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：人卵巢表面上皮（hOSE）类器官的形态学表征。（A）来自三位不同供体（tOVA86、tOVA87、tOVA88）的三个独立hOSE类器官培养的明场图像。图像分别在细胞包埋后（D0）、培养第7天（D7）、第14天（D14）和第28天（D28）拍摄。D0时比例尺为750 µm，其余为50 µm。（B）由新鲜分离的hOSE细胞（虚线）和二维扩增的hOSE细胞（实线）衍生的hOSE类器官直径。图中显示了在D0、D7和D14测量的平均尺寸±标准差。结果来自两位不同供体（tOVA88和tOVA89）。（C）显示不同形态的hOSE类器官明场图像：单层扁平结构（左上）、单层柱状结构（右上）、多层结构（右下）以及无腔结构的细胞聚集体（左下）。比例尺为100 µm。（D）将hOSE细胞包埋于BME中，并使用OSE_2D培养基培养12天后的明场图像。图像分别在细胞包埋后（D0）、第6天（D6）、第9天（D9）和第12天（D12）拍摄。培养物被成纤维细胞样细胞占据，未形成类器官样结构。比例尺为750 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：hOSE 类器官的细胞特征分析。（A）人卵巢组织切片中 KRT8 和 CDH1 的免疫荧光染色。左图比例尺为 500 µm，中间和右图比例尺为 50 µm。（B）不同大小（<50 µm、50–75 µm、75–100 µm、>100 µm）的 hOSE 类器官中 KRT8 与 YAP、LGR5 与 CD44、ITGB1 与 PODXL 的免疫荧光染色。比例尺均为 50 µm。（C）hOSE 类器官中 VIM、CDH1 和 CDH2 的免疫荧光染色。比例尺均为 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：排卵信号对人卵巢表面上皮（hOSE）类器官形成的影响。 （A）在不同培养基中培养第7天时每液滴形成的hOSE类器官总数。hOSE类器官来源于三位不同的供体（tOVA77、tOVA79、tOVA83）。加粗标注的是用于类器官分离培养的OSE_3D培养基。（B）相对于无激素培养基的类器官形成率。数据汇总自三位不同供体（tOVA77、tOVA79、tOVA83）来源的hOSE类器官。（C）图示两位不同供体（tOVA77、tOVA83）在各实验条件下第14天时体积最大的4个hOSE类器官的图像面积。（D）明场图像显示两位不同供体（tOVA77、tOVA83）在无激素、含200 nM E2或1000 nM P4的培养基中培养第14天的hOSE类器官。比例尺为750 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：本研究中使用的工作溶液的组成。 请点击此处下载该表格。
讨论
三维类器官技术正成为医学研究中不可或缺的工具。一方面，这种体外平台为研究组织再生、伤口愈合和发育等基本机制问题提供了可能18；另一方面，源自患者样本的三维类器官可用于个体化医学研究，包括疾病诊断、药物测试和细胞治疗12,13,14,37,38。在卵巢研究领域，人卵巢表面上皮（hOSE）因其被认为是上皮性卵巢癌的起源而受到广泛关注39。尽管目前认为最常见的上皮性卵巢癌之一——高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）——大多起源于输卵管40，但现有的小鼠三维卵巢类器官研究表明，HGSOC可能同时起源于卵巢表面上皮（OSE）和输卵管15,16。
本文介绍了一种人卵巢表面上皮（hOSE）三维类器官的培养方案，并概述了其在卵巢组织再生研究中获取新机制性认识的应用。该方案包含从人卵巢组织中分离原代hOSE细胞并生成三维hOSE类器官的逐步操作方法。为确保高效地获得hOSE类器官，关键在于尽量减少对卵巢组织的操作。由于hOSE位于卵巢表面且呈单层结构，在卵巢切除及组织操作过程中极易受到损伤或丢失。因此，我们优先采用针对完整卵巢组织的酶消化结合刮取法来分离hOSE2,8。在本方案中，首先使用温和的酶处理以破坏hOSE细胞间的连接，随后轻柔刮取卵巢表面以获取细胞。
与2D hOSE培养相比，在3D hOSE培养中需注意，尽管hOSE细胞在2D培养中初始增殖速率较高，但由于发生上皮-间质转化（EMT），其细胞特性发生改变，表明所采用的2D培养条件不适合维持上皮形态。相比之下，3D hOSE类器官可连续传代至少4次而无衰老迹象。所使用的OSE_3D类器官培养基基于Kopper等人为建立卵巢癌（OC）及正常hOSE类器官所用的培养基12，并参考了Kessler等人建立人类输卵管（FT）类器官所用的培养基17。主要区别在于，将人源Wnt3a和R-Spondin-1条件培养基替换为 commercially available 重组蛋白，以提高实验的可重复性。
免疫荧光技术通常需要将组织样本从培养板中取出，并进行石蜡包埋或冷冻切片处理。在处理非常微小结构时，样本在加工过程中容易丢失的风险较高。在本方案中，人卵巢表面外胚层类器官（hOSE organoids）的培养在可直接用于显微成像的细胞培养板中进行，无需将hOSE类器官从BME基质中移出。此外，本研究所采用的全 mount 免疫荧光方法由Rezanejad及其同事在胰管类器官研究中首次描述41，启用 原位 在形态完整的类器官中观察蛋白质定位。我们证明，在多孔板载玻片上培养的hOSE类器官进行该免疫荧光实验时，抗体渗透效率高，背景信号极低。
尽管使用该方法获得的大多数hOSE类器官缺乏CDH1表达，但仍有一些表达CDH1的hOSE类器官形成，其尺寸较CDH1阴性hOSE类器官更大。CDH1的表达已被关联于肿瘤性hOSE表型2,35。用于分离hOSE的卵巢来自健康的育龄跨性别男性捐赠者（27.1 ± 5岁）。这些捐赠者在卵巢切除术前曾接受睾酮治疗，持续时间为38 ± 15个月。我们不能排除卵巢表面出现CDH1阳性hOSE细胞的可能性与睾酮治疗有关。尽管雄激素治疗已被证实与卵巢的多种变化相关，例如无排卵42、皮质区增生43以及皮质硬度增加44，但在使用睾酮期间，总体卵巢病理仍保持良性45。
总之，本方案强调了利用人卵巢表面上皮（hOSE）三维类器官来解析卵巢组织再生机制问题的潜力。重要的是，该方法还可用于检测有癌变风险患者卵巢活检组织中可能存在的恶性细胞。总体而言，该方法支持此类创新技术在潜在应用中的进一步探索 体外 卵巢基础功能研究和个体化医疗临床应用的平台。
致谢
我们感谢所有为本研究捐献组织的患者，感谢Chuva de Sousa Lopes课题组成员提供的有益讨论，以及I. De Poorter为图1所设计的示意图。本研究由欧洲研究理事会资助，资助编号为ERC-CoG-2016-725722（OVOGROWTH），受资助人为J.S.D.V.和S.M.C.d.S.L.；同时由诺和诺德基金会（reNEW）资助，资助编号为NNF21CC0073729，受资助人为J.S.D.V.和S.M.C.d.S.L.。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| 12孔培养板 | Corning | 3336 | 无菌 |
| 15 mL 离心管 | Greiner | 188271 | 无菌 |
| 28 cm 细胞刮刀 | Greiner Bio-One | 541070 | |
| 50 mL 离心管 | Greiner | 227261 | 无菌 |
| 60 mm 培养皿 | Greiner Bio-One | 628160 | |
| A83-01 | Stem Cell Technologies | 72024 | |
| Advanced DMEM/F12 培养基 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 添加剂（50倍浓缩） | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | |
| 珠浴器 | M714 | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich | 10735086001 | |
| 细胞解离缓冲液 | ThermoFisher Scientific | 13151014 | |
| 冻存容器 "Mr. Frosty" | BD Falcom | 479-3200 | |
| DMEM 培养基 | ThermoFisher Scientific | 41966-029 | |
| 驴抗山羊 IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21447 | |
| 驴抗小鼠 IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21202 | |
| 驴抗小鼠 IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | |
| 驴抗兔 IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | |
| 驴抗兔 IgG Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21207 | |
| 驴抗绵羊 IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21448 | |
| 胎牛血清（FBS） | ThermoFisher Scientific | A4736401 | |
| 卵泡刺激素（FSH） | Sigma Aldrich | F4021 | |
| Forskolin | Peprotech | 6652995 | |
| Glutamax（100倍浓缩） | Gibco | 35050-038 | |
| 山羊抗 CDH2（N/R-钙黏蛋白） | Santa Cruz | SC-1502 | 间充质细胞；Wong 等，1999（人）25 |
| 山羊抗 PODXL（GP135 足细胞蛋白） | R&D Systems | AF1658 | 顶端极性；Bryant 等，2014（犬）21 |
| 驴抗大鼠 IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | |
| 人表皮生长因子（hEGF） | R&D Systems | 263-EG | |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | |
| 氢化可的松 | Sigma Aldrich | H0888 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS-X；100倍浓缩） | ThermoFisher Scientific | 51500-056 | |
| Liberase DH 研究级 | Sigma Aldrich | A4736401 | |
| Luna-II 细胞计数仪 | Logos Biosystems | L40001 | |
| Matrigel | Sigma Aldrich | 354277 | |
| McCoy’s 5A 培养基 | ThermoFisher Scientific | 26600-023 | |
| 小鼠抗 ITGB1（整合素 β1） | Santa Cruz | SC-53711 | 基底外侧极性；Bryant 等，2014（犬）21 |
| 小鼠抗 KRT8（细胞角蛋白 8） | Santa Cruz | SC-101459 | 卵巢上皮细胞（OSE）；Kopper 等，2019（人）12 |
| 小鼠抗 VIM（波形蛋白） | Abcam | AB0809 | 间充质细胞；Abedini 等，2020（小鼠）19 |
| Mycozap Plus-CL | Lonza | V2A-2011 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma Aldrich | A9165 | |
| 烟酰胺 | Sigma Aldrich | N0636-100G | |
| OVITRELLE-绒毛膜促性腺激素 α（hCG） | Merk | G03GA08 | |
| 孕酮 （P4） | Sigma Aldrich | P8783 | |
| 兔抗 ACTA2（α-平滑肌肌动蛋白） | Abcam | AB5694 | 间充质细胞；Abedini 等，2020（小鼠）19 |
| 兔抗 CDH1（E-钙黏蛋白） | Cell Signaling | CST 3195S | 上皮细胞；Wong 等，1999（人）25 |
| 兔抗 LGR5 | Abcam | AB75850 | 卵巢上皮祖细胞；Flesken-Nikitin 等，2013（小鼠）22 |
| 兔抗 YAP | Cell Signaling | 14074S | 增殖性卵巢上皮细胞；Wang 等，2022（小鼠）24 |
| 大鼠抗 CD44 PE 标记 | eBioscience | 12-0441-81 | 卵巢上皮祖细胞；Bowen 等，2009（人）20 |
| 重组人 Heregulinβ-1 | Peprotech | 100-03 | |
| 重组人 Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| 重组人 Wnt3a | R&D Systems | 5036-WN-010 | |
| 重组 Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | eBiosciences | 00-4333-57 | |
| Revitacell 添加剂（100倍浓缩） | ThermoFisher Scientific | A26445-01 | |
| 无 RNase 的 DNase | Qiagen | 79254 | |
| SB-431542 | Tocris Bioscience | 1624/10 | |
| 绵羊抗 COL1A1（前胶原 1 α1） | R&D Systems | AF6220 | 间充质细胞；Hosper 等，2013（人）23 |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| β-雌二醇（E2） | Sigma-Aldrich | E8875 | |
| μ-Slide 18孔培养板 | Ibidi | 8181 | 无菌 |
参考文献
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