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卵巢皮质组织玻璃化以实现聚集的玻璃态

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DOI：

10.3791/66801

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2024年8月9日

 ,  ,  , 
1Department of Gynecological Endocrinology and Reproductive Medicine, University Hospital of Bonn

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

介绍了一种用于卵巢组织玻璃化冷冻的方案，该方案可作为广泛使用的慢速冷冻法的一种替代性冷冻保存方法。

摘要

卵巢组织冷冻保存（OTC）是生育力保存的重要选择。对于无法推迟性腺毒性治疗的患者或青春期前女孩而言，这通常是唯一可行的生育保护手段。冷冻保存可通过玻璃化冷冻或慢速冷冻方法进行。目前，慢速冷冻是标准方法。越来越多的研究表明，玻璃化冷冻在先进技术条件下可取代慢速冷冻。 体外 体外受精（IVF）实验室中，显著提高了解冻后的存活率，并简化了冷冻保存的技术操作。本文描述了一种基于金属网格的高通量快速玻璃化冷冻方案，适用于临床常规应用。通过对金属网格和液氮进行灭菌处理，确保了操作过程的高质量，符合药品生产质量管理规范（GMP）标准。采用该方法可实现超快速冷却速率的玻璃化冷冻。样品未采用缓慢解冻方式，而是进行快速复温。为评估卵泡的存活能力，在冷冻保存前及快速复温后均进行了钙黄绿素（calcein）染色检测。研究报道了利用金属网格进行玻璃化冷冻与快速复温的成功应用。冷冻前与快速复温后，卵泡存活率未见显著差异。这些结果证实，组织玻璃化冷冻具有较高的临床常规应用潜力，可作为目前广泛使用的慢速冷冻法的一种潜在替代方案。

引言

卵巢组织冷冻保存是生育力保存的重要选择。含有卵泡（其中嵌有卵母细胞）的卵巢组织被取出后进行冷冻保存。保存后的卵巢组织可经解冻、复温，再重新移植回患者体内。对于有活力的细胞或组织，目前有两种冷冻保存方法：慢速冷冻和玻璃化冷冻1。

玻璃化冷冻技术用于保存胚胎和卵母细胞等生物材料，其存活率优于慢速冷冻方案1,2,3,4。慢速冷冻存在一些局限性，例如冰晶的形成可能对细胞和组织结构造成损伤。然而，慢速冷冻是一种重要的低温保存方法，可实现生物样本的长期储存，其有效性已得到广泛验证5。玻璃化冷冻可诱导形成玻璃态聚集，从而防止冰晶生成6,7。从技术层面而言，玻璃化冷冻通过减少设备维护、降低操作失误风险以及缩短冷冻过程所需时间，显著简化了低温保存的操作流程8,9。在女性生育力保存中，卵巢组织冷冻保存是在癌症治疗前采取的关键措施10。多个研究团队已成功验证基于慢速冷冻方案的组织冷冻、解冻与移植概念11,12,13,14，该方法目前被视为标准方案15。

在节约资源22、卵泡存活率、DNA片段化水平以及血管生成潜能平衡等方面23,24,25,26,27，卵巢组织玻璃化冷冻被认为是一种颇具前景的替代方法16,17,18,19,20,21。日本28、美国29和德国30已成功实现临床分娩，进一步证实了该技术的可行性。

比较卵巢组织冷冻保存（OTC）的两种方案——玻璃化冷冻与标准的慢速冷冻程序——目前的荟萃分析结果部分存在冲突16。造成这一现象的原因可能有多种，因为现有的玻璃化冷冻方案差异较大。这些差异包括冷冻保护剂的选择或保护剂组合、其浓度、OTC 培养基的成分、组织碎片的大小以及用作组织载体的装置。因此，目前尚无标准化的复温程序。

由于作者发现了一种在组织处理、细胞活性、凋亡起始、促血管生成因子释放，甚至在移植后成功妊娠报告等方面均能获得令人信服结果的方法9,27，因此本文提供了该实验方案的极为详尽的描述。所述方法提供了一种有效且可靠的方案，有望推动卵巢组织玻璃化冷冻技术的标准化进程。

方案

本研究经波恩大学医院伦理委员会批准（批准号：007/09）。所有患者均签署书面知情同意书。研究组包括50名患者在冷冻保存前的人卵巢组织，平均年龄为27.4岁，详见图1。本研究所用试剂与仪器列于材料表中。

1. 加载装置的制备

  1. 准备手术剪刀和用于定制的金属网。按照图2A所示，将金属网裁剪成25 mm × 8 mm的条状。
  2. 将定制好的金属网放入灭菌容器中，高压蒸汽灭菌2小时（图2B）。灭菌后，将灭菌容器和1.8 mL离心管置于超净工作台内。
  3. 开启超净工作台的紫外（UV）照射功能，在254 nm波长下照射30分钟，以实现额外灭菌。
  4. 打开灭菌容器，取出金属网，并将其安装到1.8 mL离心管的管盖中，如图2C所示。盖紧1.8 mL离心管。
    注意：上述所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。操作时应佩戴一次性实验手套（建议使用无粉手套），并用表面消毒剂清洁超净工作台台面。

2. 玻璃化冷冻液的制备

  1. 准备一支10 mL血清移液管、一支电子移液器辅助装置，以及三个50 mL离心管，分别用于配制玻璃化冷冻溶液1（VS1）、玻璃化冷冻溶液2（VS2）和玻璃化冷冻溶液3（VS3），并记录配制日期。开启超净工作台的紫外线（UV）辐射以进行额外灭菌。
  2. 配制VS1（15 mL）：向一个50 mL离心管中加入12 mL卵母细胞操作培养基（厂家已添加人血清白蛋白）、1.5 mL血清替代补充物（SSS）和1.5 mL乙二醇。
  3. 配制VS2（15 mL）：向一个50 mL离心管中加入10.5 mL卵母细胞操作培养基（厂家已添加人血清白蛋白）、3 mL乙二醇和1.5 mL SSS。
  4. 配制VS3：向一个50 mL离心管中加入8.5 mL卵母细胞操作培养基（厂家已添加人血清白蛋白）、5.25 mL乙二醇，并加入2.57 g蔗糖和0.75 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。具体操作详见图3。将所有溶液在3,000 rpm条件下涡旋振荡混合。
    注意：上述所有组织培养操作均应在II级超净工作台内进行。操作时佩戴一次性实验手套（建议使用无粉手套），并用消毒剂清洁超净工作台表面。

3. 玻璃化冷冻准备

  1. 佩戴一次性实验手套，使用表面消毒剂清洁超净工作台；建议使用无粉手套。
  2. 准备一个6孔板、一个细胞筛、一把手术刀、镊子、一个2 mm活检打孔器以及两个90 mm圆底培养皿。同时准备培养基：组织移植保存液和VS1-3。将每种预冷的溶液（VS1-3）各5 mL分别移入不同的孔中，并静置30分钟，使溶液升至室温。
  3. 使用自动紫外照射系统对液氮进行灭菌；或者，可将超净工作台的紫外照射时间设为120分钟以实现灭菌。

4. 组织玻璃化

  1. 通过去除髓质来制备卵巢皮质组织。由于皮质通常比髓质更硬，因此两者容易区分并分离。
    1. 将卵巢皮质组织切成所需的形状（移植用10 mm x 5 mm；玻璃化冷冻前后用于活卵泡计数的为2 mm x 2 mm的组织块），如图4A所示。
      注意：避免因用力过猛而损伤组织，操作时应小心谨慎。不同患者的组织样本可能存在差异。
  2. 将细胞筛置于含VS1的6孔板的第一个孔中。将卵巢皮质组织放入6孔板第1孔的5 mL VS1溶液中，使用细胞筛平衡5分钟。
    1. 随后，将带有皮质组织的细胞筛转移至含有5 mL VS2的第2孔中，平衡5分钟。最后，在5 mL VS3中平衡6分钟，如图3和表1所示。
  3. 打开已准备好的冻存管。用灭菌的液氮填充冻存管，并将其放入装有液氮的冷冻杜瓦瓶中。在1分钟内将组织样本加载到玻璃化冷冻装置的金属网格上（图4B、C）。
    1. 将加载在金属网格上的组织样本插入已准备好的基于网格的冻存管液氮中（图4D）。
      注意：加载在金属网格上的组织快速冷冻对该方法的成功至关重要。上述所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。操作时应佩戴一次性实验手套（建议使用无粉手套），并用表面消毒剂清洁生物安全柜工作台面。

5. 快速复温培养基的制备

  1. 按照图5和表2中的说明配制溶液。称取快速复温液（RWS）和平衡液（ES）所需的蔗糖，并转移至离心管中。使用刻度移液管和移液器加入卵母细胞操作培养基（由生产商添加人血清白蛋白）。根据表2列出的成分加入SSS和蔗糖。
  2. 盖紧管盖，置于滚动摇床中振荡至完全溶解。
    注意：上述所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。操作时佩戴一次性实验手套，使用表面消毒剂清洁生物安全柜工作台面；建议使用无粉手套。

6. 快速升温准备

  1. 快速复温前一天，在超净工作台中用紫外灯对耗材进行准备和去污染：准备用于快速复温系统的样本杯、用于ES、RS1和RS2的6孔板，以及快速复温后组织转运用的样本杯。将无菌一次性镊子、移液设备及其他耗材放入超净工作台中。
  2. 将加热板预热至 37.2 °C。将 RWS 在 37 °C 下孵育至少 1 小时。
  3. 准备一个无菌的6孔板，每孔分别加入6 mL ES和6 mL RS "RS1" 以及另外6 mL的RS用于 "RS2" 在层流工作台中。参考 图5 如需6孔板的示意图，请参见图示。在加热组织前，于室温孵育1小时。
  4. 在无菌条件下，将RWS转移至无菌样品杯中，并置于加热板上。RWS应保持在37 °C。
    注意：快速复温需要较高的复温速率。将复温系统（RWS）维持在 37 °C 对于确保第一步成功至关重要。

7. 卵巢组织的快速复温

  1. 将含有玻璃化冷冻卵巢皮质组织的冻存管置于液氮中运输至超净工作台。在冻存管部分浸没于液氮中的状态下打开管盖。迅速将带有玻璃化组织的网格浸入RWS溶液中，并在37 °C条件下静置1分钟。
    注意：此步骤是快速复温过程中最关键的环节，必须立即完成，不得有任何延迟。
  2. 使用无菌镊子将组织转移至ES溶液中，在摇床中轻轻振荡孵育3分钟。
  3. 按照图5所示，在摇床上分别于室温下用RS1和RS2各冲洗组织10分钟。
  4. 将复温后的组织转移至含有5 mL组织移植保存液的无菌样品杯中，并在运输至移植部位期间保持在4 °C条件下。
    注意：上述所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。操作时应佩戴一次性实验手套（建议使用无粉手套），并用表面消毒剂清洁超净工作台。

8. 卵泡活力的测定

  1. 将二甲基亚砜（DMSO）于室温下放置过夜，使其呈液态。取100 µL DMSO加入一支钙黄绿素（calcein）小瓶中，混匀以溶解钙黄绿素。吸取3 µL已溶解的钙黄绿素溶液加入一支1.5 mL离心管底部，并将小瓶于-20 °C保存。
  2. 将 0.007 g 胶原酶置于一个 1.5 mL 离心管中，于 -20 °C 保存。
  3. 向一个1.5 mL离心管中加入997 µL DPBS至预先分装并冷冻的3 µL钙黄绿素中，重悬以溶解钙黄绿素。加入0.007 g胶原酶，配制成1000 µL工作液。
  4. 使用500 µL工作液在37 °C避光条件下消化两片2 mm卵巢皮质组织碎片，消化时间90 min，置于4孔板中。分别在60 min和70 min时反复重悬溶液。最后测定卵泡活力。 通过 荧光显微镜，如图所示 图6.

结果

本方案介绍了玻璃化冷冻保护剂的配制、装载装置的准备、玻璃化冷冻、快速复温保护剂的配制、快速复温以及卵泡活性的检测方法。已有研究对慢速冷冻与玻璃化冷冻在卵泡活性及血管生成因子方面的差异进行了直接比较，并已验证和发表31,32。

通过比较玻璃化冷冻/快速复温前后存活卵泡的数量，评估了所述玻璃化冷冻方案的整体成功率。实验设计如图1所示，结果见图6。在50名患者中，玻璃化冷冻前平均存活卵泡数为77.98个，冷冻/快速复温后为62.99个，卵泡存活率为80.8%。根据Wilcoxon检验，差异无统计学意义33。

使用锋利的剪刀将金属网格裁剪为25 mm × 8 mm的尺寸，可恰好放入1.8 mL冻存管的管盖中，如图2A、C所示。经高压蒸汽灭菌后，在超净工作台内将金属网格与1.8 mL冻存管的管盖进行组装，如图2B所示。该设计可牢固地固定在管盖中，无需额外操作，同时为不同大小的组织提供了足够的承载面积。通常用于移植的组织大小为5 mm × 10 mm，而用于快速复温后评估存活卵泡数量的组织则为直径2 mm的圆形组织块，上述两种尺寸均能完美适配该金属网格。

在层流台中，于室温下将组织置于6孔板内，在摇床上依次与玻璃化冷冻溶液（VS1、VS2和VS3）进行平衡，具体步骤如图3所示。该方案中的时间设置可确保冷冻保护剂乙二醇有效渗入组织。推荐使用6孔板而非单个容器，因为这有助于组织在不同溶液间的快速转移，并可避免混淆。

为了在液氮中快速进行垂直玻璃化冷冻，将卵巢皮质组织切成适当大小的片状（图4A）。将卵巢皮质样本置于装载装置上（图4B、C），并垂直浸入液氮中（图4D），通过玻璃化实现组织的玻璃态聚集。所选用的金属网格可实现组织的垂直操作，如图4D所示。此外，该金属网格具有很高的热导性，可确保温度从22 °C迅速降至-196 °C，这是玻璃化冷冻过程中的关键步骤。

对于快速复温，需在37 °C的无菌杯中制备RWS。ES、RS1和RS2在室温下于6孔板中置于摇床上制备，如图5所示。大量预热的RWS可防止在加入玻璃化组织后溶液温度过度下降，从而在整个快速复温过程中为组织提供持续温暖的环境。

为评估并确保高质量标准，可在玻璃化冷冻前及快速复温后，使用钙黄绿素对2 mm × 2 mm的活检穿孔组织进行染色，通过荧光显微镜检测卵泡活力（图6）34,35。活卵泡在摄取钙黄绿素后，于495 nm处发出绿色荧光。此外，也可使用中性红染料评估卵泡活力（表3）36。

通过遵循本方案中所述步骤，卵巢组织可转变为玻璃态聚集状态，这有助于在快速复温后实现高存活率，荧光显微镜检测结果已证实了这一点。

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图1：研究设计。 对来自50名患者的卵巢皮质样本在玻璃化冷冻及快速复温前后（新鲜状态）的存活卵泡数量进行检测。每组取两块直径为2 mm的组织样本，在评估卵泡数量前进行24小时培养。组织经胶原酶消化并用钙黄绿素染色以评估其存活率。使用显微镜确定存活卵泡的数量。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：加样装置的制备。将金属网格切割成8 mm × 25 mm的尺寸（A）。定制的金属网格通过高压灭菌进行灭菌处理（B）。灭菌后的金属网格随后插入1.8 mL小瓶的瓶盖中，即可使用（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：玻璃化冷冻溶液的制备。玻璃化冷冻溶液（VS）被配制后转移至6孔板中。各孔显示了玻璃化冷冻方案中所用每种溶液的体积及各自的孵育时间。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：卵巢皮质组织的处理与玻璃化冷冻。 卵巢皮质组织经处理后用于冷冻保存，处理过程包括去除髓质，并将组织切成5 mm × 10 mm的片状（A）。在图3所示的玻璃化冷冻溶液中孵育后，将组织装载至玻璃化冷冻载样装置上（B,C）。为实现卵巢皮质样本的快速垂直玻璃化冷冻，将载有组织的帽状装置迅速插入无菌液氮中（D）。请点击此处查看该图的高清版本。

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图5：快速复温溶液的制备。制备快速复温溶液（RWS）、平衡溶液（ES）以及洗涤溶液（RS）1 和 2，并将其转移至6孔板中。图中容器和孔所示为每种溶液的体积及相应的孵育时间。注意，RWS 需在加热板上保持 37.2 °C。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：存活率计数。 为评估存活卵泡的数量，将直径为2 mm的组织块用胶原酶消化并用钙黄绿素染色。代表性图像显示：（A）玻璃化冷冻前回收的3个卵泡的钙黄绿素染色结果；（B）玻璃化冷冻及快速复温后回收的存活卵泡；（C）慢速冷冻前回收的存活卵泡；（D）慢速冷冻及解冻后回收的存活卵泡。卵泡的存活状态由钙黄绿素指示，这是一种绿色荧光染料，在495 nm处被活细胞内的酶转化为可发出绿色荧光的产物。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

VS 1 (15 mL)乙二醇10%1.5 mL
SSS10%1.5 mL
G-MOPS+12 mL
VS 2 (15 mL)乙二醇20%3 mL
SSS10%1.5 mL
G-MOPS+10.5 mL
VS 3 (15 mL)乙二醇35%5.25 mL
SSS10%1.5 mL
蔗糖0.5 mol/L2.57 g
PVP5 % (w/v)0.75 g
G-MOPS+加至 15 mL

表1：玻璃化冷冻溶液（VS）的组成。

RWS (30 mL)蔗糖0.8 mol/L
8.22 g
SSS10%3 mL
G-MOPS+加至 30 mL
ES (15 mL)蔗糖0.4 mol/L2.05 g
SSS10%1.5 mL
G-MOPS+加至 15 mL
RS 1&2 (15 mL)SSS10%1.5 mL
G-MOPS+加至 15 mL

表2：快速复温液（RWS）、平衡液（ES）和洗涤液（RS）的成分。 本表格列出了玻璃化冷冻后处理过程中所使用的快速复温液（RWS）、平衡液（ES）和洗涤液（RS）的组分及其浓度。

参数新鲜区间玻璃化冷冻后快速复温区间n*P值
标准差标准差
卵泡存活数 [n]77.980-38662.990.5-349500.130
77.9580.02
*Wilcoxon 检验

表3：卵泡活力的代表性结果。 本表展示了在冷冻保存前及快速复温后的卵泡活力评估结果。每位患者取两份直径为2 mm的组织样本，用于计数玻璃化冷冻/快速复温前后存活卵泡的数量。采用Wilcoxon检验对50位患者的配对组织样本进行分析。

讨论

本文介绍了一种适用于临床常规的高通量人类卵巢皮质组织玻璃化冷冻方案。与卵母细胞或胚胎的玻璃化冷冻类似，该操作的成功实施需要严格遵循方案中关于玻璃化冷冻液和复温液的温度以及平衡时间的具体要求。同时，还必须符合欧盟组织指令37对空气质量和无菌性的相关规定。

玻璃化过程可形成非晶态、无定形或玻璃状状态。总体而言，玻璃化是一种多功能的技术，在多个科学与技术领域具有重要意义。玻璃化的主要优势在于其能够将组织转化为玻璃态，从而防止冰晶形成38,39,40，而冰晶的形成可能对组织完整性及其组分产生不利影响。

在冷冻保护剂（CPAs）中添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可在不影响玻璃化溶液质量的前提下降低CPA的浓度41,42。此外，与基于塑料的载体系统相比，金属网格具有更高的热导率。网格结构还有助于样品表面附着，从而确保组织样本和小块皮质钻孔样本在质量控制措施下的安全、稳定冷冻保存。若使用其他厂商的冷冻管，需预先测试金属网格的尺寸，以确保其在冷冻管盖内具有足够的稳定性与牢固抓握性，并能良好地嵌入管体中。

确保成功玻璃化冷冻的关键步骤包括将组织浸入无菌液氮中实现快速玻璃化，以及立即进行快速复温，以避免产生不良结果。在成本效益方面，与慢速冷冻程序相比，组织玻璃化冷冻的要求较低，这可能影响人员配置规划。此外，玻璃化冷冻无需购买和维护慢速冷冻所需的设备。

生物学指标和荟萃分析已证明，与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻具有相当甚至更优的效果43。然而，玻璃化冷冻后结果的差异可能源于冷冻装置和操作方案缺乏标准化，包括所用溶液在不同研究间的差异。未来的研究应探索从玻璃化冷冻/快速复温组织中进行卵泡培养的潜力，以实现在体外监测其生长情况，这一点已在多个研究团队对小鼠卵巢组织的研究中成功实现44,45,46,47,48,49,50。

总之，卵巢组织玻璃化冷冻是一种重要的替代方法，可取代目前广泛使用的慢速冷冻方案，已有日本Suzuki51、美国Silber52和德国Sänger53报道的五例成功分娩案例支持。与市面上已有的用于细胞的玻璃化冷冻培养基和试剂盒相比，目前获得FDA/CE认证的卵巢组织冷冻系统较少，这可能限制其在临床环境中的应用。因此，建议开发获得FDA/CE认证的卵巢组织玻璃化冷冻及快速复温试剂盒和培养基30。

致谢

感谢 Cara Färber 提供校对帮助；感谢 Katharina Wollersheim、Martin Mahlberg、Lea Korte 和 Jasmin Rebholz 提供技术协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.8 mL 小瓶VWR International GmbH479-6837
10 mL 血清移液管Sarstedt86.1254.001
4 孔板GynemedGYOOPW-FW04
50 mL 管Sarstedt62.559.001
6 孔板Sarstedt83.3920
Bacillol AFHartmann973385
Calcein AMMerck17783
胶原酶 I 型 AMerckC2674
Cryosure DMSOWAK ChemieWAK-DMSO-10
CustodiolDr. Franz Köhler Chemie00867288
DPBS CTSGibco Life technologiesA12856-01
ErgoOne 移液器辅助器StarlabS7166-0010
乙二醇Sigma Aldrich102466
Euronda 灭菌容器euronda282021
G-MOPS+Vitrolife10130
金属筛网Sigma AldrichS0770
Metzenbaum 剪刀world precision instruments501262102
N-Bath 系统NterilizerN-Bath 3.0
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)SAGEART-4005
血清替代补充剂 (SSS)Fujifilm Irvine scientific99193
无菌杯Sarstedt75.562.105
无菌镊子Carl RothKL05.1
蔗糖MerckS0389

参考文献

  1. Rezazadeh Valojerdi, M., Eftekhari-Yazdi, P., Karimian, L., Hassani, F., Movaghar, B. Vitrification versus slow freezing gives excellent survival, post-warming embryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos. J Assist Reprod Genet. 26 (6), 347-354 (2009).
  2. Levi-Setti, P. E., Patrizio, P., Scaravelli, G. Evolution of human oocyte cryopreservation: Slow freezing versus vitrification. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2 (6), 445-450 (2016).
  3. Glujovsky, D., et al. Vitrification versus slow freezing for women undergoing oocyte cryopreservation. Cochrane Database Syst Rev. 9, CD010047(2014).
  4. AbdelHafez, F. F., Desai, N., Abou-Setta, A. M., Falcone, T., Goldfarb, J. Slow freezing, vitrification and ultra-rapid freezing of human embryos: A systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online. 20 (2), 209-222 (2010).
  5. Amorim, C. A., Curaba, M., Van Langendonckt, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Vitrification as an alternative means of cryo-preserving ovarian tissue. Reprod Biomed Online. 23, 160-186 (2011).
  6. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21, 407-426 (1984).
  7. Liebermann, J., et al. Potential importance of vitrification in reproductive medicine. Biol Reprod. 67 (6), 1671-1680 (2002).
  8. Schallmoser, A., et al. Comparison of angiogenic potential in vitrified vs. slow frozen human ovarian tissue. Sci Rep. 13 (1), 12885(2023).
  9. Schallmoser, A., et al. The effect of high-throughput vitrification of human ovarian cortex tissue on follicular viability: A promising alternative to conventional slow freezing. Arch Gynecol Obstet. 307 (2), 591-599 (2023).
  10. Jadoul, P., et al. Efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation: Lessons learned from 545 cases. Hum Reprod. 32 (5), 1046-1054 (2017).
  11. Meirow, D., et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. N Engl J Med. 353, 318-321 (2005).
  12. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106, 467-474 (2016).
  13. Hoekman, E. J., et al. Ovarian tissue cryopreservation: Low usage rates and high live-birth rate after transplantation. Acta Obstet Gynecol Scand. 00, 1-9 (2019).
  14. Rodriguez-Wallberg, K. A., et al. 86 Successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: Focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet. 34, 325-336 (2017).
  15. Anderson, R. A., et al. The ESHRE guideline group on female fertility preservation, ESHRE guideline: Female fertility preservation. Hum Reprod Open. 2020 (4), hoaa052(2020).
  16. Shi, Q., Xie, Y., Wang, Y., Li, S. Vitrification versus slow freezing for human ovarian tissue cryopreservation: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 8538(2017).
  17. Keros, V., et al. Vitrification versus controlled rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue. Hum Reprod. 24, 1670-1683 (2009).
  18. Xiao, Z., Wang, Y., Li, L., Luo, S., Li, S. W. Needle immersed vitrification can lower the concentration of cryoprotectant in human ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 94, 2323-2328 (2010).
  19. Fabbri, R., et al. Good preservation of stromal cells and no apoptosis in human ovarian tissue after vitrification. Biomed Res Int. 2014, 673537(2014).
  20. Chang, H. J., et al. Optimal condition of vitrification method for cryopreservation of human ovarian cortical tissues. J Obstet Gynaecol Res. 37 (8), 1092-1101 (2011).
  21. Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2020).
  22. Fabbri, R., et al. Morphological, ultrastructural and functional imaging of frozen/thawed and vitrified/warmed human ovarian tissue retrieved from oncological patients. Hum Reprod. 31 (8), 1838-1849 (2023).
  23. Xiao, Z., Wang, Y., Li, L. L., Li, S. W. In vitro culture thawed human ovarian tissue: NIV versus slow freezing method. Cryo Letters. 34 (5), 520-526 (2013).
  24. Locatelli, Y., et al. In vitro survival of follicles in prepubertal ewe ovarian cortex cryopreserved by slow freezing or non-equilibrium vitrification. J Assist Reprod Genet. 36 (9), 1823-1835 (2017).
  25. Nikiforov, D., et al. Innovative multi-protectoral approach increases survival rate after vitrification of ovarian tissue and isolated follicles with improved results in comparison with conventional method. J Ovarian Res. 11 (1), 65(2018).
  26. Wang, T., et al. Human single follicle growth in vitro from cryopreserved ovarian tissue after slow freezing or vitrification. Human Reprod. 31 (4), 763-773 (2016).
  27. Lee, S., et al. Comparison between slow freezing and vitrification for human ovarian tissue cryopreservation and xenotransplantation. Int JMol Sci. 20 (13), 3346(2019).
  28. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  29. Silber, S. J., et al. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue: Results from one center in the USA. J Assist Reprod Genet. 35 (12), 2205-2213 (2018).
  30. Sänger, N., John, J., Einenkel, R., Schallmoser, A. First report on successful delivery after retransplantation of vitrified, rapid warmed ovarian tissue in Europe. Reprod Biomed Online. 49 (1), 103940(2024).
  31. Sugishita, Y., et al. Quantification of residual cryoprotectants and cytotoxicity in thawed bovine ovarian tissues after slow freezing or vitrification. Hum Reprod. 37 (3), 522-533 (2022).
  32. Abir, R., et al. Attempts to improve human ovarian transplantation outcomes of needle-immersed vitrification and slow-freezing by host and graft treatments. J Assist Reprod Genet. 34 (5), 633-644 (2017).
  33. Sänger, N., John, J., Einenkel, R., Schallmoser, A. First report on successful delivery after retransplantation of vitrified, rapid warmed ovarian tissue in Europe. Reprod Biomed. 49 (1), 103940(2024).
  34. Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Arch Gynecol Obstet. 306 (4), 1299-1311 (2022).
  35. Kristensen, S. G., et al. A simple method to quantify follicle survival in cryopreserved human ovarian tissue. Hum Reprod. 33 (12), 2276-2284 (2018).
  36. Mortimer, D. A critical assessment of the impact of the European Union Tissues and Cells Directive (2004) on laboratory practices in assisted conception. Reprod Biomed. 11 (2), 162-176 (2005).
  37. Amorim, C. A., Curaba, M., Van Langendonckt, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue. Reprod Biomed. 23 (2), 160-186 (2011).
  38. Fahy, G. M. Vitrification: A new approach to organ cryopreservation. Transplantation: Approaches to Graft Rejection. Meryman, H. T. , Alan R. Liss. New York, USA. 305-335 (1986).
  39. Kattera, S., Chen, C. Cryopreservation of embryos by vitrification: Current development. Int Surg. 91 (5 Suppl), S55-S62 (2006).
  40. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reprod Biomed. 9, 680-691 (2004).
  41. Liebermann, J., et al. Potential importance of vitrification in reproductive medicine. Biol Reprod. 67, 1671-1680 (2002).
  42. Shi, Q., Xie, Y., Wang, Y., Li, S. Vitrification versus slow freezing for human ovarian tissue cryopreservation: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 8538(2017).
  43. Hasegawa, A., Hamada, Y., Mehandjiev, T., Koyama, K. In vitro growth and maturation as well as fertilization of mouse preantral oocytes from vitrified ovaries. Fertil Steril. 81 (Suppl 1), 824-830 (2004).
  44. Segino, M., et al. In vitro culture of mouse GV oocytes and preantral follicles isolated from ovarian tissues cryopreserved by vitrification. Hum Cell. 16 (3), 109-116 (2003).
  45. Kagawa, N., et al. Production of the first offspring from oocytes derived from fresh and cryopreserved pre-antral follicles of adult mice. Reprod Biomed. 14 (6), 693-699 (2007).
  46. Haidari, K., et al. The effects of different concentrations of leukemia inhibitory factor on the development of isolated preantral follicles from fresh and vitrified mouse ovaries. Iran Biomed J. 10, 4(2006).
  47. Haidari, K., Salehnia, M., Rezazadeh Valojerdi, M. The effect of leukemia inhibitory factor and coculture on the in vitro maturation and ultrastructure of vitrified and nonvitrified isolated mouse preantral follicles. Fertil Steril. 90 (6), 2389-2397 (2008).
  48. Lin, T. C., et al. Comparison of the developmental potential of 2-week-old preantral follicles derived from vitrified ovarian tissue slices, vitrified whole ovaries and vitrified/transplanted newborn mouse ovaries using the metal surface method. BMC Biotechnol. 8, 38(2008).
  49. Wang, X., Catt, S., Pangestu, M., Temple-Smith, P. Live offspring from vitrified blastocysts derived from fresh and cryopreserved ovarian tissue grafts of adult mice. Reproduction. 138 (3), 527-535 (2009).
  50. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  51. Silber, S. J., et al. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue: Results from one center in the USA. J Assist Reprodu Genet. 35 (12), 2205-2213 (2018).
  52. Sänger, N., John, J., Einenkel, R., Schallmoser, A. First report on successful delivery after retransplantation of vitrified, rapid warmed ovarian tissue in Europe. Reprod Biomed. 49 (1), 103940(2024).
  53. Parmegiani, L., et al. Testing the efficacy and efficiency of a single "universal warming protocol" for vitrified human embryos: prospective randomized controlled trial and retrospective longitudinal cohort study. J Assist Reprod Gen. 35 (10), 1887-1895 (2018).

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