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利用纵向微正电子发射断层扫描/微计算机断层扫描图像评估心血管钙化进展的新型定量方法

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DOI：

10.3791/66805

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2024年11月15日

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1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 4Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 5Department of Orthopaedic Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 6Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 7Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

本新方法涉及利用小动物连续微小正电子发射断层扫描（PET）/微小计算机断层扫描（CT）图像，对心血管钙化进展进行定量分析。

摘要

微型正电子发射断层扫描（PET）和微型计算机断层扫描（CT）成像是追踪心血管钙化进展的强有力且理想的研究工具。由于其具有非侵入性特点，可在多个时间点对小型实验动物进行成像。挑战在于对心血管钙化进行精确量化。本文提供了一种利用疾病晚期图像作为模板的方法，以在纵向研究中准确量化心血管钙化的进展。该方案包括：1）在纵向研究过程中，对同一动物的多幅图像中的胸部区域进行配准，作为第一步；2）在心脏和主动脉中定义感兴趣区域（ROI），该区域位于后期图像中明显出现较大钙沉积的部位；3）对纵向研究期间获取的所有图像中的钙沉积进行同步分割与量化。这种简化的分析方法通过提高感兴趣区域定义的精确性，并减少以往独立分析各次扫描图像所带来的变异性，从而提升了追踪心血管钙化进展过程中影像分析的准确性。

引言

心血管疾病是全球发病率和死亡率的主要原因，需要深入研究以揭示其机制，并制定有效的预防和治疗策略。冠状动脉钙化（CAC）被该领域专家广泛认为是心血管疾病的一个预测因子，显著增加心血管死亡风险1,2,3,4,5。显微钙化被认为是钙化性动脉粥样硬化的最早阶段，“微钙化”一词用于描述直径在0.5至50 µm之间的钙沉积物6,7,8,9。这些微小钙化灶被认为会聚集成更大的钙沉积，推动钙化斑块的进展6,7。

正电子发射断层扫描（PET）和计算机断层扫描（CT）是重要的研究工具，常用于体内无创评估心血管钙化in vivo5,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。这些成像技术在纵向研究中尤其具有优势，可用于追踪小型实验动物血管钙化的进展11,12,13,19。显微CT（microCT）成像已被证明在提供较大钙沉积物的解剖图像方面具有有效性11,12,13,19,20。然而，由于其空间分辨率约为100 µm8,14，在活体动物中小钙沉积物的成像应用受到限制，因而难以研究钙化早期阶段的病变过程。

一项显著进展是采用微正电子发射断层扫描/微计算机断层扫描（microPET/microCT）成像结合氟-18标记的氟化钠（18F-NaF）作为检测钙化的标准方法，该方法基于其与矿物表面积的结合特性。该技术利用放射性标记的18F-NaF，研究表明氟离子可共价结合于羟基磷灰石中的钙，取代羟基形成氟磷灰石，从而识别钙矿物表面10,1321。由于氟离子与羟基的交换速率较慢，且相对于18F的放射性衰变（半衰期约110分钟）以及示踪剂经肾脏清除的速度而言更为迟缓22，Irkle及其同事13发现，在检测时18F-NaF对钙化颈动脉标本的结合仅限于表面。因此，示踪剂的摄取应直接与矿物表面积相关；当等量矿物以多个微小病灶或疏松多孔形式存在时，其表面积大于少量、大块、致密沉积物的情况。由于18F-NaF PET成像对矿化早期阶段具有高灵敏度，能够突出显示初始矿化过程，因而可为疾病早期阶段提供重要信息，在研究预防性和治疗性策略方面具有重要价值13,14,15。

尽管近期在微小正电子发射断层扫描/微小计算机断层扫描（microPET/microCT）成像用于血管钙化研究方面取得了进展，但在纵向心血管钙化研究中，图像分析的准确性仍有提升空间。传统方法需要在纵向研究的每个时间点，对每只小鼠每个可见钙化区域周围进行耗时费力的手动勾画感兴趣区域（ROI）。该方法会降低精确度，尤其是在疾病早期阶段，钙沉积物的尺寸接近扫描仪检测极限，可能导致一些低密度分布的微小沉积区域无法被检测到。

在成像领域，配准通常指一系列图像之间的空间对齐。我们将配准作为一种应对现有挑战的创新解决方案，所提出的方法使研究人员能够在纵向研究过程中，对个体受试者的系列图像中钙化进展情况进行持续跟踪时，使用一致的解剖位置。鉴于已知组织钙化起源于纳米级基质小泡（50–150 nm），这些小泡逐渐融合形成显微尺度、进而发展为肉眼可见的羟基磷灰石矿物23，因此可以在微钙化尚不可见的早期图像中，回溯性地确定其可能出现的位置。

通过图像配准实现对同一位置的长期追踪，是本方法的基础。该方法无需直接识别最早的钙化阶段，因为感兴趣区域（ROI）的划定是基于矿化已可明确识别的后期阶段。在本方案中，我们介绍了一种改进的、简化的数据分析方法，将一系列时间图像的配准作为关键步骤，从而提高在纵向联合微正电子发射断层扫描/微计算机断层扫描（microPET/microCT）成像研究中钙沉积定量分析的准确性（图1）。尽管我们以PET/CT数据分析为例进行说明，但该方法同样适用于其他纵向成像数据的分析，包括单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、磁共振成像（MRI）和光学成像24。

纵向成像过程；图像配准与分割；定量示意图，动物研究。
图1：实验流程概览图。 该流程图总结了一种用于定量心血管钙化的新方法。主要步骤包括纵向成像、不同时点获取图像的配准、钙化区域的分割与定量。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

代表性图像显示了一只载脂蛋白E缺陷型（Apoe-/-）雌性小鼠。实验方案已通过加州大学洛杉矶分校机构动物照护与使用委员会的审查和批准。

1. 动物扫描

  1. 在两次图像采集之间，给予小鼠标准饮食，不进行任何干预。但在15月龄第一次成像之前，从12至14月龄期间改用西方饮食（21%脂肪，0.2%胆固醇），以诱导基础主动脉钙化。
  2. 确保microPET/CT扫描仪定期校准，以获得最佳的PET数据采集和CT图像配准效果。校准操作应按照制造商的说明进行。
  3. 成像前，在麻醉舱中使用2%异氟烷气体麻醉小鼠10分钟。通过夹捏动物脚趾无反应来确认麻醉状态。
  4. 在静脉注射3.7 MBq 18F-NaF后60分钟，使用一体化microPET/CT扫描仪采集microPET（350–650 keV，扫描时间10分钟）和100 µm microCT（80 kVp，150 µA，720个投影，扫描时间1分钟）图像。microCT扫描紧随microPET扫描之后进行。
    注意：扫描床在动物保持麻醉状态且体位不变的情况下，将其从PET模块移至CT模块。
  5. 采用三维有序子集最大期望值算法（24个子集，3次迭代）重建microPET图像，并进行随机、衰减和衰变校正。使用改进的Feldkamp算法重建CT图像。
    注意：成像结束后，对小鼠进行监测，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。纵向研究结束时，所有小鼠均被实施安乐死。

2. 在 DICOM 查看软件中导入 DICOM 文件

注意：虽然本代表性方案使用了非商业许可的 ORS Dragonfly 软件，但其灵活性也适用于其他 DICOM 查看器软件选项。

  1. 通过双击应用程序启动 DICOM 查看器软件。
  2. 在左上角导航至 文件。在下拉菜单中选择 导入 DICOM 图像…，以弹出 管理 DICOM 图像 窗口（补充文件 1- 补充图 S1A）。
  3. 在 管理 DICOM 图像 窗口中，点击 文件夹内容 选项卡。在右侧选择 打开文件夹…，以选择纵向研究中感兴趣的 DICOM 文件所在文件夹（补充文件 1- 补充图 S1B）。
  4. 确认包含 DICOM 文件的文件夹。点击 选择文件夹，将第一个文件夹导入到 管理 DICOM 图像 窗口中（补充文件 1- 补充图 S1C）。
  5. 在 管理 DICOM 图像 窗口中选择 PET（“PT”）和 CT（“CT”）的 DICOM 文件。随后点击右侧的 查看研究，以打开所有已导入的 DICOM 图像（补充文件 1- 补充图 S1D）。
  6. 对纵向研究中同一受试者的每个包含 DICOM 图像的文件夹，重复步骤 2.4 和 2.5。

3. 调整 DICOM 查看器设置以优化图像显示

  1. 更改布局以显示四个视图（3D、横断面、冠状面、矢状面），如补充文件1-补充图S2所示。在左侧的布局 下拉菜单中，找到视图（在选定场景中），并选择一个可显示四个视图的布局。
  2. 重命名图像以标明时间点以及其为PET或CT图像。选择图像名称并双击以重命名每个图像。
  3. 通过访问右侧的数据属性和设置 下拉菜单来开启图像。点击每个图像名称左侧的眼睛图标以切换可见性（补充文件1-补充图S2）。
  4. 分别调整每幅CT图像的亮度和对比度。
    注意：最佳的CT亮度和对比度范围可能因受试者、成像方案、扫描仪和重建参数25,26而异；但在纵向研究中，同一受试者的全部调整应保持一致。
    1. 通过点击数据属性和设置下的图像名称，选择并开启一幅CT图像（补充文件1-补充图S2）。
    2. 在显示屏幕左侧的主 选项卡中，找到窗宽窗位下拉菜单内的直方图。激活直方图上方的LogY 选项；然后点击并拖动黄色范围指示器，使其完全覆盖直方图中的第二个峰（补充文件1-补充图S3A）。进行微调直至达到最佳亮度/对比度；可参考图2B以了解经亮度/对比度调整后的CT图像示例。
    3. 在窗宽窗位直方图下方找到选定范围 框（补充文件1-补充图S3B）。记录该选定范围的数值，供后续步骤使用。
    4. 选择并开启第二幅CT图像（补充文件1-补充图S3C）。将第一幅CT图像的选定范围值输入到第二幅CT图像的选定范围框中（补充文件1-补充图S3B-S3D）。对所有后续图像重复此操作。
  5. 分别通过调整查找表滤波器来优化每幅PET图像。
    注意：最佳的PET颜色标尺范围可能因受试者、成像方案、扫描仪和重建参数27而异；但在纵向研究中，同一受试者的全部调整应保持一致。
    1. 通过点击数据属性和设置 下的图像名称，选择并开启一幅PET图像（补充文件1-补充图S2）。
    2. 在主 选项卡的窗宽窗位下拉菜单中，找到查找表（LUT），滚动并在LUT下拉菜单中找到PET ，然后选择PET滤波器（补充文件1-补充图S4A）。
    3. 使用窗宽窗位下拉菜单中的直方图微调选定范围，以实现最佳可视化效果。激活直方图上方的LogY选项；然后点击并拖动黄色范围指示器至补充图S4B（补充文件1）所示位置。进行微调直至PET图像可视化的选定范围达到最佳；可参考图2D以了解经选定范围优化的PET/CT图像示例。
    4. 在窗宽窗位 直方图下方找到选定范围 下拉菜单（补充文件1-补充图S4B）。记录选定范围的数值，供后续步骤使用。
    5. 选择并开启第二幅PET图像（补充文件1-图S4C）。对第二幅图像重复步骤3.5.2。
    6. 将第一幅PET图像的选定范围值输入到第二幅PET图像的选定范围框中（补充文件1-图S4B-S4D）。对所有后续图像重复此操作。

PET/CT 扫描图，显示比较成像结果的示意图，突出区域代谢活性。
图 2：调整 DICOM 查看器设置以优化图像可视化。（A,B）CT 图像的冠状面视图，（A）为对比度/亮度调整前，（B）为调整后。（C,D）PET/CT 图像的冠状面视图，（C）为查找表调整前，（D）为调整后。缩写：CT = 计算机断层扫描；PET = 正电子发射断层扫描。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 在CT图像中对齐胸部区域

注意：为简化操作，选择一幅CT图像作为“基准”图像，该图像不会进行平移或旋转。第二幅CT图像（以及后续的连续图像）将通过平移和/或旋转与基准图像对齐；在本演示中，此图像称为“叠加”图像。在整个对齐过程中，必须明确区分基准图像与所有其他叠加图像。

  1. 在 数据属性和设置 下拉菜单中，通过点击每个图像名称左侧的 眼睛图标，关闭所有 PET 图像，并开启基础 CT 图像。
  2. 将 CT 图像的不透明度更改为约 50%。点击其中一个 2D 视图。在 窗位调节 框中，找到 不透明度映射 下拉菜单，并将 不透明度 滑块移至中间位置（补充文件 1- 图 S5）。
  3. 开启叠加 CT 图像，并重复步骤 4.2。
  4. 更改叠加 CT 图像的滤镜，以区分基础 CT 图像与叠加 CT 图像。在 主 选项卡中的 窗位调节 下拉菜单中，找到 查找表 (LUT)。在 LUT 下拉菜单中，滚动并点击 红色 滤镜。
    注意：此时每个视图中应显示两个 CT 图像，如 补充图 S5（补充文件 1）所示。
  5. 在 2D 视图中使用 平移/旋转 工具，尽可能将叠加图像中的胸部区域与基础图像对齐。参考胸廓、上段脊柱和胸骨作为 CT 图像中胸部对齐的指示标志。
    注意：以下操作只能在 2D 视图（横断面、冠状面或矢状面）中执行（补充文件 1- 补充图 S1）。为获得最佳效果，请在全部三个 2D 视图之间切换，并使用平移/旋转工具在每个视图中对齐胸部区域。
    1. 在 数据属性和设置 下拉菜单中选择叠加图像，并点击一次以选中其中一个 2D 视图。
    2. 在 主 选项卡下找到 平移/旋转 下拉菜单，然后点击 位移 图标（补充文件 1- 图 S6A）。
    3. 点击并拖动左下角的 平移框，并旋转所选 2D 视图中心的 旋转支点，以移动叠加图像，使其大致与基础图像对齐（补充文件 1 - 补充图 S6B）。参考骨骼结构进行对齐。
    4. 在 操作 下拉菜单中找到 跟踪 工具，通过点击并拖动轴的中心，将轴移动至胸部区域。通过点击计算机鼠标中间的 滚轮按钮 并将鼠标 向远离屏幕方向拖动，放大胸部区域（补充文件 1 - 补充图 S6C）。
  6. 通过进一步的平移和旋转调整，精细调节对齐，使胸部结构（如胸廓、上段脊柱和胸骨）精确定位。在不同 2D 视图之间切换，并重复步骤 4.5.3–4.5.4，直至两个图像对齐，呈现与 图 3 相似的图像。
  7. 当基础图像与第一个叠加 CT 图像对齐后，在 LUT 下拉菜单中将叠加 CT 图像的滤镜恢复为 灰度 。对同一只动物的所有其他叠加 CT 图像重复第 4 节操作，始终使用相同的基底图像。

脊柱排列的CT扫描分析；标注图突出显示椎体位置及偏差。
图3：所有CT图像的配准。（A,B）基线（灰色）与叠加（红色）CT图像的冠状面视图，（A）配准前和（B）配准后。（C,D）CT图像的矢状面视图，（C）配准前和（D）配准后。蓝色箭头指示小鼠的（1）胸腔、（2）脊柱和（3）胸骨。缩写：CT = 计算机断层扫描。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 将 PET 图像与相应的 CT 图像进行配准

注意：叠加的CT图像与基础CT图像的对齐最初会导致叠加的CT图像与其相应的PET图像之间出现错位，如图4所示。需要再次将PET图像与其对应的CT图像进行配准。

  1. 点击每个图像名称左侧的眼睛图标，打开叠加的CT图像及其对应的PET图像。
  2. 将PET和CT图像的不透明度调整至约50%。在窗位调节下拉菜单中，找到不透明度映射下拉选项，并将不透明度滑块移至中间位置（补充文件1 - 补充图S5）。
  3. 在2D视图中使用平移/旋转工具，根据CT图像中的骨骼结构和PET图像中的18F-NaF骨表面信号，对齐PET图像与对应的CT图像。
    1. 在数据属性和设置下拉菜单中选择与叠加CT图像对应的PET图像，并单击以选中其中一个2D视图。
    2. 在主选项卡下找到平移/旋转下拉菜单，点击位移图标（补充文件1 - 补充图S6A）。
    3. 点击并拖动左下角的平移框，同时旋转所选2D视图中心的旋转中心点（补充文件1 - 补充图S6B），以移动PET图像，实现与CT图像的配准。
  4. 对所有尚未与CT图像配准的叠加PET和CT图像重复第5节操作。
    ​注：若配准完成，相应的PET/CT图像应在整个身体长度范围内对齐，如图4所示。

显示静态平衡的PET扫描图像；用于肿瘤可视化分析的彩色编码示意图。
图4：PET图像与相应CT图像的配准对齐。 一幅代表性PET图像及其对应的CT图像在共配准前（A, C）和共配准后（B, D）的结果。完成共配准后，PET图像与CT图像应如图B所示实现对齐。缩写：CT = computed tomography；PET = positron emission tomography。 请点击此处查看该图的高清版本。

6. 鉴定心血管钙化

  1. 在纵向研究中确定预测钙化区域最大的时间点（即晚期钙化时间点或预处理受试者）。选择对应于此时间点的图像作为“参考”图像，以突出显示最清晰可见的钙化区域。该选定图像将作为模板，用于与在其他不同时间点获取的、钙化区域较小的所有图像进行比较。
  2. 通过点击图像左侧的眼睛图标来启用参考CT图像。在操作下拉菜单中选择追踪工具，并将轴心移动至心脏区域周围。
  3. 放大图像以寻找叠加在胸廓、胸骨和脊柱之间的心脏轮廓上的钙化区域（微小的高密度亮点）（图5）。如果钙化区域未立即显现，可通过选择二维视图并使用鼠标滚轮滚动各层图像来查看。
  4. 移动追踪轴心，使其悬停在钙化区域上方，确保该区域在所有二维视图中均可见。有关小鼠CT图像中钙化区域的视觉参考，请参见图5。
  5. 启用对应的PET图像以验证钙化区域的存在。
    ​注意：如果PET图像设置及配准已适当调整，则PET图像应在钙化区域周围显示放射性信号，如图5D所示。

CT扫描分析，脊柱和胸廓检查，医学影像结果，解剖结构识别。
图5：心脏中钙化区域的识别。 代表性图像中显示的钙化区域，包括（A）矢状面、（B）横断面和（C）冠状面CT图像，以及（D）冠状面PET/CT图像。黄色箭头指示钙沉积部位。蓝色箭头标识用于确定钙化位置的参考结构。缩写：CT = 计算机断层扫描；PET = 正电子发射断层扫描。 请点击此处查看该图的放大版本。

7. 在钙化区域周围绘制感兴趣区域

  1. 关闭 PET 参考图像。通过点击图像左侧的 眼睛图标 ，仅开启 CT 参考图像。
  2. 找到 形状 下拉菜单，并选择 球体 形状（补充文件 1 - 补充图 S7）。通过点击并拖动球体边缘来调整其尺寸，通过点击并拖动中心方块来重新定位球体。
    1. 浏览各个 2D 视图，仔细放置球体。球体应完全包含已识别的钙化区域及其周围部分区域，但需避免包含任何邻近骨骼。有关球体绘制的最佳示意图，请参见 补充图 S7（补充文件 1），以了解球体的正确放置方式。
  3. 在 数据属性和设置 下拉菜单中，右键点击球体名称，选择 添加到 ROI… （补充文件 1 - 补充图 S8A），然后选择 新建 ROI（补充文件 1 - 补充图 S8B）。
    1. 为新创建的 ROI 指定一个合适的名称。在 几何结构 下，选择需要生成 ROI 的 CT 图像（补充文件 1 - 补充图 S8C）。
    2. 通过点击 ROI 名称左侧的 眼睛图标 启用该 ROI，并观察与先前绘制球体大小相对应的彩色 ROI，如 补充图 S8D（补充文件 1）所示。
  4. 在显示屏幕左侧、主标签旁找到 分割 标签（图 6A）。分割 标签用于创建和编辑 ROI。
    注意：以下三个步骤旨在创建一个高精度的 ROI，仅突出显示指定球体内钙化的区域。
    1. 在 数据属性和设置 中选择参考 ROI，并在 分割 标签下找到 范围 下拉菜单。点击勾选 定义范围（图 6A）。
    2. 使用 选定范围 框调整定义的范围（图 6A）。确保所定义的范围包含所有 Hounsfield 单位（HU）值低于钙化阈值的非钙化像素。本示例中钙化的阈值设为 300 HU，图像中最低密度像素为 -2,626，因此选定范围为 -2,626 至 300 HU。
    3. 配置好选定范围后，点击 移除 （图 6A），以从球体 ROI 中删除所有低于指定阈值的像素。
      注意：此操作将生成一个新的 ROI，仅突出显示球体内的钙化区域，从而简化后续分析的重点。完成的 ROI 应类似于 图 6B 中所示的 ROI。
  5. 对所有连续的 CT 图像重复步骤 7.3–7.4，使用同一个参考球体创建各自独立的新 ROI。将每个 ROI 命名为与其对应的特定 CT 图像一致，以确保分析简洁且有条理。
    ​注意：在对每幅图像进行 ROI 分析时，无需为每幅图像创建新的球体，因为参考球体应已包含所有图像中最大的钙化区域（假设图像对齐准确）。

显示血管成像的CT重建分析；软件界面截图；灰度与彩色图像。
图6：使用分割功能将感兴趣区域（ROI）限定为钙化区域。（A）箭头指示了从感兴趣区域中去除不需要的密度数据所需的步骤。蓝色箭头指向分割选项卡；黄色箭头突出显示定义范围功能；绿色箭头指示所选的范围输入；红色箭头指向移除按钮。（B）完成步骤7.4–7.4.3后，感兴趣区域应特异性地勾画出钙化区域，如本图所示。缩写：ROI = 感兴趣区域。请点击此处查看此图的放大版本。

8. 对每张图像的 ROI 进行定量分析

  1. 在数据属性和设置下拉菜单中选择要量化的感兴趣区域（ROI）。
  2. 在基本属性下拉菜单下方右侧找到统计属性下拉菜单（图7）。
  3. 在统计属性下找到数据集表格。使用右侧的下拉菜单，选择与待量化ROI相对应的适当成像数据集（图7）。
    1. 当量化ROI内的CT数据时，选择与该ROI对应的CT图像名称。
    2. 当量化ROI内的PET数据时，选择与该ROI对应的PET图像名称。
  4. 点击刷新以获取所选钙化区域的量化值。根据数据集表格查看最小值、最大值和平均值，并使用平均值进行量化（图7）。
  5. 在统计属性框顶部找到体积计算结果，并将其用于量化分析（图7）。
  6. 对于CT数据集，数值以HU表示。通过将ROI的平均值（HU）与ROI的体积（mm3）相乘，计算容积性钙含量（vHU）12。
  7. 对于PET数据集，数值以贝可勒尔（Bq）表示，对应每秒衰变数。将ROI的平均值（Bq）除以ROI的体积（mm3），换算为Bq/mm3，以表示示踪剂摄取浓度。

显示体素体积和均值计算的统计属性面板；分析软件界面。
图7：感兴趣区域（ROI）定量分析。 针对选定感兴趣区域（ROI）的统计属性选项卡。红色箭头指示基于该ROI获取数据集统计信息所需的操作步骤。红色框标出体积和平均Hounsfield单位值，这两项参数对后续分析计算至关重要。缩写：ROI = 感兴趣区域（region of interest）。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

分析方法
本节通过代表性结果展示该方法的成功应用。此处展示了单只小鼠在12至14月龄期间接受西方饮食（21%脂肪，0.2%胆固醇）后，在15月龄和18月龄时扫描获得的microPET/microCT融合图像。根据第2-8步的钙化定量操作流程，四名独立的研究人员分别对15月龄和18月龄时间点获取的相同代表性microPET/microCT图像进行体积钙含量和18F-NaF PET活性的测量。采用统计分析方法（包括均值、标准差、组内相关系数（ICC）28,29）评估该操作流程的评分者间可靠性和可重复性。使用IBM SPSS统计软件包，基于平均值评定（k = 4）、一致性、双向随机效应模型（ICC(C,1)），计算ICC估计值及其95%置信区间（补充文件1-补充表S1）。

结果
该小鼠在15个月（平均值 = 876.08 vHU，标准差 = 27.18 vHU）与18个月（平均值 = 1253.13 vHU，标准差 = 7.61 vHU）的时间点之间，基于钙化区域的体积和密度计算得到的体积钙含量有所增加（图8）。相比之下，用于测量钙化区域表面积的18F-NaF PET信号活性在同一小鼠中从15个月（平均值 = 24173.90 Bq/mm3，标准差 = 1426.60 Bq/mm3）到18个月（平均值 = 13849.94 Bq/mm3，标准差 = 1524.67 Bq/mm3）的时间点之间有所下降（图8）。

这些结果与先前的研究发现一致，即18F-NaF PET 与 CT 成像提供的关于动脉粥样硬化斑块的信息似乎存在差异12,13,14。一项关于钙化过程的纵向研究也显示出类似趋势，提示18F-NaF 信号的降低可能是由于微小钙沉积物的融合，尽管钙含量增加，但其表面积最终减少12。

比较15个月和18个月时代谢活性的PET扫描；诊断影像分析。
图8：代表性的小动物微正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（microPET/CT）图像。 横断面（左）、冠状面（中）和矢状面（右）图像，显示15个月与18个月代表性小动物微PET图像中氟-18（F-18）的摄取情况。白色箭头指示钙化区域。缩写：CT = 计算机断层扫描；PET = 正电子发射断层扫描。 请点击此处查看该图的放大版本。

我们的结果中观察到较小的标准差，表明不同研究人员所获得的测量值之间具有高度的一致性和重复性。此外，本研究中获得的组内相关系数（ICC(C,1)）值为0.997，95%置信区间为0.983–1.000（补充文件1–补充表S1），表明不同研究人员之间的测量结果具有极好的一致性。这种程度的一致性说明该测量方法在不同研究人员之间具有良好的可靠性和可重复性，表明这一新型定量方案具有很高的可重复性。

讨论

本项新方案是对心血管钙化定量分析的改进方法。由于成像具有非侵入性，可对小型动物进行纵向微计算机断层扫描（microCT），以追踪心血管钙化的进展过程。尽管仅使用microCT图像即可显示钙含量的变化，但在条件允许时，微正电子发射断层扫描（microPET）图像可提供额外信息层次，尤其因其示踪剂可结合于钙沉积物表面，从而增强对微小钙化灶的检测能力。为进一步提高本方法的准确性与可重复性，建议结合使用对比剂增强的心脏门控CT成像。对比剂增强CT成像有助于将本方案更顺畅地应用于大型动物及临床研究中，在这些研究中，通常采用低分辨率对比剂增强CT联合18F-NaF PET成像作为心血管钙化定量的标准方法30,31。此外，心脏门控PET与心脏门控CT利用心电图（ECG）数据减少运动伪影，从而获得更清晰、更高品质的心脏图像32,33。我们的图像分析方法可应用于纵向研究中的心脏门控PET和心脏门控CT数据。

DICOM 浏览器普遍提供本方案所需的基本功能。大多数 DICOM 图像浏览软件均具备二维和三维图像查看、直方图、窗宽窗位调节、查找表、平移、旋转、图像叠加和导航工具等基本功能34,35，可实现图像的精确定位以及钙化灶的准确定位。分割等更高级的功能在大多数 DICOM 浏览软件中也较为常见34,35,36，能够实现感兴趣区域（ROI）的精确勾画和选定 ROI 的准确量化。总体而言，该灵活的方案确保了在不同 DICOM 浏览平台间的兼容性，使研究人员能够使用其偏好的软件，而不会影响方法学的一致性。

尽管该实验方案总体上较为简单，但其成功实施和获得可靠结果取决于若干关键因素。在进行图像重建与分析之前，必须将经衰变校正的18F-NaF PET示踪剂注射剂量及其单位纳入DICOM文件中，以确保定量结果的准确性。此外，在扫描过程中保持小鼠在扫描孔道内的位置一致且稳定，将极大有助于图像的数字化对齐——这对于纵向研究中系列图像之间保持分析一致性至关重要。

其他关键步骤已嵌入实验方案中。应谨慎选择感兴趣区域（ROI），以排除上胸部的骨骼和其他钙化结构（如甲状软骨）。在开始绘制感兴趣区域之前，一个关键步骤是仔细选择显示最大可见钙化的时间点，作为"参考"图像（参见方案步骤6.1）。为进一步提高感兴趣区域的准确性，最佳做法是将球形范围扩展至可见钙化边界的外侧，同时排除任何邻近的骨骼，如补充图S7（补充文件1）所示。这些策略性选择可确保在后续所有扫描中，感兴趣区域的边界全面涵盖钙化区域。另一个同等重要的步骤是选择能够识别钙盐矿物的体素密度阈值（参见方案步骤7.4）；该阈值可能因具体研究条件而异，例如所使用的成像设备和DICOM查看软件。在本示例中，基于我们的microPET/microCT经验，感兴趣区域的microCT密度最低阈值设定为300 HU。

本实验方案的故障排除主要涉及验证每一步骤中是否正确选择或恰当开启/关闭了相应的图像、对象和感兴趣区域（ROI）。在ROI定量分析中的常见错误包括用户误选图像而非ROI，或在统计属性下拉菜单中选择的数据显示集与所选ROI不匹配。图像可视化可能带来另一项挑战。例如，若未使用合适的颜色标尺，图像可能过暗或过亮，从而掩盖钙化沉积物。精细调整可视化设置至关重要，因为最佳配置可能因具体情况而异，未必与本方案中所用设置相同。另一项可能有益的方案优化是在绘制ROI步骤中尝试不同形状，以最准确地包围钙化区域。根据研究需求，某些替代形状（如圆柱体或胶囊形）可能比示例方案中使用的标准球形更为有效。如需针对DICOM图像查看软件相关错误的更详细帮助，建议咨询该软件的技术支持部门。

尽管该方案简化了啮齿类动物心血管钙化的分析，但仍存在某些局限性。虽然18F-NaF PET成像是一种检测心血管钙化的优良方法，但由于分辨率限制和部分容积效应，可能难以捕捉到最小的钙沉积，从而可能导致PET信号被低估8,27。在CT图像中，噪声的存在可能影响检测效果37。尽管通过设定更高的HU阈值可减轻噪声影响，但其代价是会排除最小的低密度沉积物。当常规密度的钙盐沉积物小于体素尺寸时，部分容积效应会导致其表现为比实际更低的密度和更大的体积38,39。因此，在设定研究中的最低密度阈值时需谨慎权衡，需在因噪声导致的潜在高估与因排除小沉积物导致的潜在低估之间取得平衡。

许多已建立的方法通过CT成像对钙化进行定量分析11,12,20,40,41,42。这通常包括根据Agatston评分方案43，确定研究对象和患者的冠状动脉钙化（CAC）评分。然而，由于数据在采集后存在截断、重分配和阈值设定等问题，Agatston评分存在严重局限性，导致其可靠性极低39。此外，Agatston评分方案仅能识别高于扫描仪检测限（100–200 µm）的钙化区域8。鉴于钙化作为心血管疾病风险因素的重要性日益凸显，开发能够准确量化钙化的方法势在必行。近年来，18F-NaF PET/CT成像技术的进步提高了心血管钙化的可视化效果；然而，在纵向研究中，准确的数据分析方法仍面临挑战。目前用于钙化定量的方法需要在纵向研究的每个时间点上，针对每位受试者中每个可见的钙化区域手动绘制感兴趣区域（ROI）11,12,15。这些现有方法可能影响定量的准确性，尤其是当钙化沉积物接近扫描仪检测限时。若未与显示最大钙化程度的时间点对齐，则在钙化较小的图像中定义ROI将变得困难。在我们提出的新颖方案中，介绍了一种改进的数据分析方法，通过整合图像对齐和ROI一致性，提高连续图像中数据分析的一致性，从而提升纵向PET/CT研究中钙化评估的有效性。该方法不仅解决了数据分析中的挑战，还可能为心血管钙化进展过程提供新的研究视角。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）克兰普临床前影像技术中心所有成员在数据采集与处理以及设备和基础设施维护方面提供的帮助。感谢 Jeffrey Collins 在回旋加速器操作和 18F-NaF 合成方面的协助。感谢加州大学洛杉矶分校统计咨询小组在统计分析方面提供的支持。本研究由美国国家卫生研究院（NIH）癌症中心支持基金（2 P30 CA016042-44，授予 MT）以及美国国立卫生研究院心肺血液研究所（HL137647 和 HL151391，授予 YT 和 LLD）资助。GNEXT PET/CT 扫描仪由 NIH S10 动物研究共享仪器基金（1S10OD026917-01A1，授予 Arion Chatziioannou）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 cc 无菌胰岛素注射器Exel International#26028用于静脉注射 18F-NaF PET 示踪剂
18F-NaF PET 示踪剂CNSI 回旋加速器
BiorenderBiorender用于图1
雌性 Apoe-/- 小鼠Jackson Laboratories#002052B6.129P2-Apoetm1Unc/J
GNEXT PET/CTSofie Biosciences, Dulles, Virginia
异氟烷Piramal Critical Care用作小鼠成像的麻醉剂
ORS DragonflyComet Technologies Canada Inc.
SPSS StatisticsIBM
小鼠西方饮食Envigo#TD8813921% 脂肪，0.2% 胆固醇

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