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方法文章

利用κ-卡拉胶亚微凝胶介质嵌入式生物打印类组织结构

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DOI：

10.3791/66806

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2024年5月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了一种新型 κκ-卡拉胶亚微凝胶悬浮浴，展现出显著的可逆阻塞-解阻塞转变特性。这些特性有助于在嵌入式三维生物打印中构建仿生组织和器官。成功打印出具有高分辨率和细胞生长能力的心脏/食管样组织，展示了高质量的生物打印与组织工程应用。

摘要

利用颗粒水凝胶支撑浴进行嵌入式三维（3D）生物打印已成为构建仿生支架的关键技术。然而，设计一种能够在精确沉积生物墨水的同时维持细胞活性与功能的合适凝胶悬浮介质仍面临多重挑战，尤其是在实现理想黏弹性性能方面。本文提出一种新型 κ-卡拉胶凝胶支撑浴通过一种易于操作的机械研磨工艺制备，可生成均一的亚微米级颗粒。这些亚微凝胶表现出典型的宾汉流体行为，具有较低的屈服应力和快速的剪切稀化特性，有利于生物墨水的平滑沉积。此外，该凝胶还具备可逆的凝胶-溶胶相变特性和自愈合能力 κκ-卡拉胶微凝胶网络可确保打印结构的结构完整性，从而能够构建具有明确结构特征的复杂多层组织结构。打印完成后， κ-carrageenan亚微凝胶可通过简单的磷酸盐缓冲液冲洗轻松去除。进一步使用含细胞生物墨水进行生物打印表明，仿生结构内的细胞具有高达92%的高存活率，能够迅速伸出伪足，并保持旺盛的增殖能力，表明该生物打印策略在组织与器官构建方面具有潜在应用价值。总之，这种新型 κκ-卡拉胶亚微凝胶介质作为一种极具前景的嵌入式生物打印高质量材料，具有深远的意义 体外 工程化组织与器官的开发

引言

组织工程支架，包括电纺纤维、多孔海绵和聚合物水凝胶，在修复和重建受损组织与器官中发挥关键作用，其通过提供支持细胞生长、组织再生及器官功能恢复的结构框架来实现这一目标1,2,3然而，传统支架在精确复制天然组织结构方面面临挑战，导致工程化组织与天然组织之间存在不匹配。这一局限性阻碍了缺损组织的有效修复，凸显出迫切需要改进支架设计以实现更精确的生物模拟。三维（3D）生物打印是一种创新的制造技术，可利用生物材料墨水和细胞逐层精确构建复杂的生物组织结构。4在各种生物材料中，聚合物水凝胶因其独特的网络结构而成为理想的生物墨水，该结构有利于 原位 细胞的包封，并关键性地支持其生长5,6然而，许多柔软且高度水合的水凝胶在用作生物墨水时，往往会在打印过程中导致打印支架结构模糊或迅速坍塌。为解决这一难题，嵌入式3D生物打印技术采用微凝胶浴作为支撑材料，实现软性生物墨水的精确沉积。待水凝胶生物墨水凝胶化后，通过去除微凝胶浴，即可获得具有复杂结构的精细仿生支架。例如明胶等材料7,8琼脂糖9，和结冷胶10,11 已被用于制备嵌入式3D生物打印的微凝胶浴，显著推动了软水凝胶在组织工程中的应用。然而，这些颗粒凝胶的微米级且不均匀的粒径对3D打印的分辨率和保真度产生不利影响。12,13,14迫切需要制备一种具有小尺寸且均匀分散颗粒的凝胶状悬浮液，以实现高保真生物打印。

在此方案中，一种新型牺牲性颗粒 κ一种具有均匀亚微米级结构的κ-卡拉胶悬浮液浴被用于嵌入式3D打印。这种创新的亚微凝胶浴具备快速阻塞-解阻塞相变行为，可实现高结构保真度的仿生水凝胶支架的精确制备。15利用这种新型悬浮介质，成功打印出一系列具有多层组织结构的仿生组织和器官构建物，所用复合生物墨水由明胶甲基丙烯酰胺和丝素蛋白甲基丙烯酰胺组成。本研究选择食管作为三维生物打印的仿生对象，主要因为食管不仅具有多层组织结构，其肌层还呈现出内环形、外纵行的复杂分层结构。确保这些层次的正确排列与组织结构对于功能性组织再生至关重要。因此，我们迫切希望复制食管的多层结构。更重要的是，我们采用了 κ使用κ-卡拉胶亚微凝胶作为悬浮浴，GelMA/SFMA作为生物墨水，设计并构建用于组织工程的仿生支架。打印的食管结构可通过反复磷酸盐缓冲液洗涤轻松释放。此外，该 κκ-卡拉胶亚微凝胶浴不含细胞毒性物质，确保了高细胞相容性15各向异性支架中负载的平滑肌细胞表现出显著的铺展活性。这种均匀的亚微凝胶悬浮介质为通过嵌入式3D生物打印技术构建复杂组织与器官提供了新途径。

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方案

1. 准备 κ κ-卡拉胶亚微凝胶悬浮液浴

  1. 制备500 mL的 κ-卡拉胶悬浮液浴（0.35% 质量/体积），通过加入 1.75 g 的 κ 将κ-卡拉胶粉末加入1,000 mL玻璃瓶中的500 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶液中。
  2. 将一根70 mm的磁力搅拌子放入玻璃瓶中，以搅拌水相混合物。拧紧玻璃瓶盖，然后将其松开半圈。
  3. 将玻璃瓶置于70 °C水浴中加热。开启磁力搅拌器，转速调至300 rpm，放入玻璃瓶，持续搅拌直至聚合物完全溶解。
  4. 取另一个玻璃瓶，放入高压灭菌器中，在121 °C下灭菌30分钟。
  5. 当高压灭菌器冷却至80 °C后，将瓶子从灭菌器中取出，并转移至超净工作台进行后续操作。
  6. 过滤完全溶解的溶液 κ使用0.22 µm滤器将κ-卡拉胶溶液注入已灭菌的玻璃瓶中。
    注意：趁溶液未冷却时迅速进行过滤，以防止 κ-防止κ-卡拉胶在冷却过程中堵塞滤器。
  7. 储存 κ在4 °C下使用κ-卡拉胶溶液诱导阳离子交联凝胶化反应，持续12小时。
  8. 机械研磨 κ使用60 mm磁力搅拌器，在25 °C下以1200 rpm的搅拌速度搅拌-carrageenan水凝胶，直至其完全转变为液态，耗时约60分钟。
    注意：储存 κ在25–37 °C范围内使用κ-卡拉胶水凝胶，以避免在低温下发生凝胶化或在高温下溶解。

2. 明胶甲基丙烯酸酯/丝素蛋白甲基丙烯酸酯复合生物墨水的制备

  1. 通过将10% (wt/vol) 甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和6% (wt/vol) 甲基丙烯酰化丝素蛋白（SFMA）溶于PBS溶液（pH 7.4）中，制备复合生物墨水。分别称取2.0 g GelMA和1.2 g SFMA粉末。
  2. 将粉末缓慢加入两个50 mL离心管中，再分别向每个50 mL离心管中加入10 mL PBS溶液。
  3. 向每个离心管中放入一个10 mm磁力搅拌子，在45 °C水浴中持续搅拌并加热，使GelMA和SFMA粉末完全溶解，约需30分钟。
  4. 在45 °C下持续搅拌的同时，将GelMA和SFMA溶液等体积混合。使用孔径为100 µm的滤膜过滤复合生物墨水。
  5. 将复合GelMA/SFMA生物墨水置于生物安全柜中，通过紫外照射灭菌12小时。
    注意：应立即配制并使用生物墨水，以防止SFMA通过自组装发生过早凝胶化。

3. 流变学表征 κ κ-卡拉胶亚微凝胶悬浮液浴

  1. 启动并准备与流变学相关的设备。
    1. 打开空气压缩机并运行30分钟，确保压力达到30 psi。通过逆时针旋转拉杆松开轴承夹具。安装下方黑色盖板，并顺时针旋转仪器顶部的旋钮轴。
    2. 开启流变仪电源，使其完成初始化。打开循环水开关，使温度降至15 °C。
    3. 打开流变仪控制软件，建立在线连接。
  2. 校准流变仪并安装平行板几何夹具。
    1. 在控制软件中执行仪器校准，主要包括调整校准仪器的惯性路径。将直径为40 mm的平行板几何夹具安装至拉杆末端。按住“Lock”按钮3秒，使电机轴移动至初始位置，以确保几何夹具安装位置一致。
    2. 在控制软件中选择Calibrate Manager，随后依次点击Inertia, Friction Calibration和Rotational Mapping，以完成对平行板几何夹具的校准。
  3. 通过执行标准的间隙归零程序，将流变仪的间隙高度归零，以确保测量精度。
  4. 设置实验步骤，包括剪切速率范围为0.01至1000 1/s的流动扫描实验、在10 rad/s频率下应变范围为0.1%至100%的振幅扫描实验、持续60秒并在10 rad/s频率下交替施加1%和100%应变的多步振荡时间扫描实验，以及持续120秒并在0.1 1/s和10 1/s之间交替剪切速率的多步Peak Hold扫描实验。
  5. 将2 mL的0.35% κ-卡拉胶悬浮液滴加到流变仪的帕尔帖温控板上。 
  6. 将几何夹具间隙设定为510 μm，并清除夹具边缘多余的溢出样品。 将样品间隙设为500 µm，使样品略微超出夹具边缘。
  7. 在实验设计选项中选择Flow Ramp，进行流动实验。
    1. 在实验设计中选择Flow Ramp测试。设置剪切速率范围为0.001至10 1/s，温度为25 °C。
    2. 对新添加的样品执行步骤3.5及流动扫描实验。
  8. 执行循环Peak Hold测试，以评估材料的恢复性能。
    1. 在实验设计中选择Peak Hold扫描，设置5次连续实验，每次持续120秒，温度为25 °C。
    2. 将第一、第三和第五步的剪切速率设为0.01 1/s，第二和第四步设为10 1/s。
    3. 添加2 mL新样品。执行步骤3.5及循环恢复测试。
  9. 进行黏弹性分析，以评估κ-卡拉胶悬浮液体系可能发生的凝胶-溶胶转变。
    1. 在实验设计中选择Amplitude Sweep测试。设置振荡应变范围为0.1%至100%，温度为25 °C。点击Start，对新添加的样品执行振幅扫描实验。
  10. 进行交替应变分析，以评估材料的弹性恢复性能。
    1. 在实验设计中选择Oscillation Time Sweep，设置5次连续实验，每次持续60秒，温度为25 °C。
    2. 将第一、第三和第五步的应变设为1%，第二和第四步设为100%。
    3. 添加2 mL新样品。执行步骤3.5及连续循环恢复测试。
      注：每次实验测试后需清洁几何夹具板和帕尔帖温控板，并添加2 mL新样品。

4. 使用定制的微挤出式生物打印机打印仿生水凝胶支架

  1. 使用3D图形软件设计STL格式的立方体，并从3D数据库（www.thingiverse.com；https://3d.nih.gov/.）下载类组织模型。​
    1. 将STL格式的模型导入PANGO软件并输入打印参数。设置模型在三维空间中的具体X、Y、Z坐标，输入以毫米（mm）为单位的模型预期缩放尺寸，调整物体在X、Y、Z轴上的尺寸和缩放比例，并根据需要调整模型在空间中的旋转角度。
    2. 将估计的纤维直径（大多数生物墨水通常为200–500 µm）输入层厚参数栏，以确定每层在Z轴方向的厚度。根据预期的线条厚度设定打印速度（约为10–90 mm/s），并将填充密度设为30%–80%。
    3. 将最终参数导出为G代码并保存至SD卡。
  2. 运行生物打印机和微挤出泵。
    1. 打开微挤出泵控制器，选择相应容积的注射器（5 mL），并将挤出速率设置为0.08 mL/min，挤出时间根据所需打印时间确定，打印时间通过将水凝胶体积除以挤出速率计算得出。
    2. 将内径为210 µm的针头安装到注射器上，并插入生物打印设备的注射器插槽中。
    3. 调节注射器控制器，确保注射器的柱塞与螺杆紧密接触。
    4. 将3 mL悬浮液加入35 mm细胞培养皿中。根据编码设置将培养皿放置于平台，确认打印头位于培养皿底部上方1 mm处。
      注意：在打印过程中，需进行预测试以确保打印平台上各培养皿位置的准确性。
    5. 将包含代码的SD卡插入3D生物打印机，激活代码文件，启动生物打印机，然后点击 开始 控制器上的按钮。
  3. 构建体的处理
    1. 将打印好的结构暴露于405 nm蓝光下照射1分钟，以启动光交联。
    2. 移除 κ使用1 mL移液器加入-卡拉胶凝胶，随后加入3 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤并弃去。重复此步骤以实现充分洗涤。
      注意：清洗过程应轻柔操作，以避免损坏打印的结构。

5. 食管肌层类似物的嵌入式3D生物打印

  1. 培养兔食管平滑肌细胞（eSMCs）。
    1. 在T75培养瓶中以2 x 10⁶细胞接种启动培养6 使用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的15 mL DMEM培养基培养细胞。
    2. 将 eSMCs 置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中培养2 并置于95%空气环境中培养至80%汇合度。
  2. 食管肌层生物墨水的制备
    1. 细胞汇合后，吸除培养基，并用 5 mL 1x PBS 洗涤 eSMCs。
    2. 向培养瓶中加入 2 mL 0.2% 胰蛋白酶-EDTA，孵育 2 分钟以消化细胞。轻敲培养瓶使细胞从瓶壁脱落。
    3. 加入2 mL DMEM终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。取10 µL细胞悬液，使用细胞计数仪测定细胞密度。
    4. 以 675 x g 离心 g 3分钟，小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于复合GelMA/SFMA生物墨水（按步骤2.1制备）中。调整终浓度，使细胞密度达到10 × 106 细胞/mL，从而优化后续3D生物打印应用的条件。
  3. 3D 生物打印机及相关材料的准备
    1. 在标准灭菌条件下（121 °C，30 分钟）对关键打印仪器进行高压灭菌，包括注射器针头、镊子、磁力搅拌器和1000 mL硅酸盐玻璃瓶，以确保打印过程的无菌环境。
    2. 将生物打印机置于生物安全柜内，并使用紫外线（UV）照射30分钟进行灭菌，以维持无菌环境。
    3. 制备 50 mL 无菌的 κ-κ-角叉菜胶和5 mL无菌GelMA/SFMA复合生物墨水，分别如步骤1和步骤2所述。
    4. 设计模型，设定所需参数，并按照步骤4.1所述准备生物打印机。
  4. 生物打印过程的启动
    1. 执行步骤4.2和4.3中所述操作，以生物打印三维食管肌层，随后进行PBS洗涤并更换。
    2. 在整个打印过程中采用无菌技术进行细胞打印，以最大限度降低打印结构中细胞污染的风险。
  5. 打印后细胞培养基更换
    1. 小心吸除 PBS，替换为 3 mL 添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。确保打印的结构完全浸没在培养基中，以提供最佳的细胞生长条件。
    2. 将含有打印结构的细胞培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育2每天更换新鲜的细胞培养基，每次使用3 mL，并利用光学显微镜监测支架内细胞的状态。

6. 通过活/死细胞染色法评估打印结构中eSMCs的存活率

  1. 孵育5小时后移除细胞培养基，并用PBS洗涤载有细胞的构建物。
  2. 向打印的载细胞构建物中加入2 mL标准钙黄绿素-AM/碘化丙啶溶液（1:1000），并进行孵育。
  3. 孵育45分钟后用PBS洗涤构建物3次，然后加入新鲜的细胞培养基。
  4. 观察活细胞与死细胞，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）采集荧光图像。

7. 通过 FITC-Phalloidin/DAPI 染色观察打印结构中的 eSMCs

  1. 将打印的结构在孵育5天后，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鬼笔环肽（绿色）对F-肌动蛋白染色，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）对细胞核进行染色。
  2. 固定液的配制
    1. 在5 mL聚乙烯（PE）管中，将4 mL 1×PBS与0.16 mL多聚甲醛（PFA）混合，得到终浓度为4%的固定液。
    2. 将含有生物打印结构的培养皿置于洁净台面上，吸除培养基，然后轻轻加入PFA溶液，确保结构完全浸没。室温下固定20分钟后弃去溶液。
      注意：在添加和移除液体时应小心操作，以保持生物打印结构的完整性。
    3. 向培养皿中加入2.5 mL 1×PBS，完全浸没结构，以去除残留的染色试剂。
  3. 细胞膜通透化处理
    1. 在5 mL PE管中，将20 µL Triton X-100加入4 mL 1×PBS中，配制成0.5% Triton X-100溶液。
    2. 将Triton X-100溶液加入结构中，室温孵育30分钟以实现细胞膜通透，随后弃去溶液。
    3. 向培养皿中加入2.5 mL 1×PBS，完全浸没结构，以去除残留的染色试剂。
  4. 封闭非特异性结合位点
    1. 在5 mL PE管中，将0.12 mL牛血清白蛋白（BSA）加入4 mL 1×PBS中，配制成3% BSA封闭液。
    2. 将BSA溶液加入结构中，室温孵育30分钟以封闭非特异性结合位点，随后弃去溶液。
  5. 使用FITC-鬼笔环肽进行肌动蛋白染色
    1. 在5 mL PE管中，将8 µL染色试剂加入4 mL 1×PBS中，配制成0.2% FITC-鬼笔环肽溶液。
    2. 将结构浸入该溶液中，避光、室温孵育60分钟，随后弃去溶液。
    3. 向培养皿中加入2.5 mL 1×PBS，完全浸没结构，以去除残留的染色试剂。
  6. 使用DAPI进行细胞核染色
    1. 向结构中加入4 mL DAPI染色液，确保完全覆盖。
    2. 避光、室温孵育20分钟后，移除DAPI溶液。
  7. 最终洗涤及PBS浸没：向培养皿中加入2.5 mL 1×PBS，完全浸没结构，以去除残留的染色试剂。
    注意：染色液应提前配制，并轻柔操作。在整个过程中，培养容器内的细胞不得发生干燥。
  8. 使用共聚焦显微镜观察：通过共聚焦显微镜检查并成像染色后的结构，以评估细胞生长情况，并对结果进行完整记录。

8. 使用 CCK-8 法检测打印结构中 eSMCs 的增殖情况

  1. 在第7天和第14天从构建物中移除培养基，用PBS洗涤构建物以去除残留的培养基和脱落的细胞。
  2. 根据制造商说明书向每个构建物中加入CCK-8溶液，确保CCK-8溶液体积足以完全覆盖每个构建物。
  3. 将构建物在37 °C下与CCK-8溶液孵育2小时。孵育结束后，小心地将上清液转移至新的96孔板中。
  4. 使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。

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结果

通过机械破碎将块状水凝胶分解为颗粒状凝胶浆料，从而制备出颗粒状κ-卡拉胶凝胶浴。最近的一项研究表明，在1000 rpm的机械搅拌条件下，κ-卡拉胶颗粒的平均直径约为642 ± 65 nm，形态均匀15，显著小于文献中先前报道的微凝胶尺寸16,17,18。更长的破碎时间和更高的转速会导致更小的微粒尺寸；本研究中，在1200 rpm下搅拌60分钟可获得平均直径为565 ± 86 nm的亚微米级颗粒（补充图1）。如此小的粒径有望提高打印过程的分辨率。这些颗粒通过氢键和阳离子相互作用的形成组装成颗粒状凝胶（图1A）。当受到应力作用时，κ-卡拉胶亚微米凝胶介质表现出典型的特性行为，如屈服、剪切稀化以及可逆的阻塞-非阻塞转变，这些特性对于成功实现嵌入式3D生物打印至关重要...

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讨论

样品制备 κ-用于生物打印的卡拉胶亚微凝胶悬浮浴的制备是一个经过精密调控的过程，涉及多个关键步骤，以确保所得介质具备支持生物墨水所需的理想特性。首先， κ-κ-卡拉胶溶液通过溶解κ-卡拉胶制备 κ-将卡拉胶粉末溶于去离子水中并加热，形成均匀混合物。溶液浓度是关键参数，必须优化以利于后续凝胶化。浓度范围为0.3–0.6%（wt/vol） κ-κ-卡拉胶在嵌入式三维生物打印中表现出优异的性能15冷却后，该溶液转变为块状凝胶。

随后，将大块凝胶采用机械研磨策略处理，以制备亚微米凝胶颗粒。该过程利用高剪切力将凝胶破碎成尺寸均一的颗粒。研磨工艺参数，包括剪切强度、时间和温度，均需精确控制，以获得理想的粒径分布。研磨完成后，将亚微米凝胶颗粒储存在25–37 °C条件下，以防止颗粒聚集或溶解，这对于维持均匀悬浮状态以支持复杂的生物打印任务至关重...

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披露

作者对本文所述产品无任何经济利益关系。

致谢

本研究得到宁波市自然科学基金（2022J121，2023J159）、宁波市自然科学基金重点项目（2021J256）、聚合物分子工程国家重点实验室（复旦大学）开放基金（K2024-35）以及中国浙江省动脉粥样硬化疾病精准医学重点实验室（2022E10026）的资助。感谢宁波大学医学部核心设施提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D 生物打印机定制设计
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚索莱宝生命科学C0065即用型
405 nm 紫外光EFLXY-WJ01
细胞计数仪康宁Cyto smart 6749
共聚焦激光扫描显微镜徕卡STELLARIS 5
DMEM 高糖培养基VivaCellC3113-0500高糖，含丙酮酸钠和 L-谷氨酰胺
动态旋转流变仪TA InstrumentDiscovery HR-20
食管平滑肌细胞由宁波大学医学部细胞生物学与再生医学系提供来源于兔食管的原代细胞
胎牛血清UEF9070L
异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽索莱宝生命科学CA1610300T
甲基丙烯酰化明胶EFLEFL-GM-6060% 取代度
κ-卡拉胶阿拉丁C121013-100g试剂级
苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰)次磷酸锂阿拉丁L157759-1g365~405 nm
活/死细胞染色试剂盒碧云天C2015M
酶标仪普腾诺夫PT-3502B
多聚甲醛索莱宝生命科学P1110 4%
青霉素/链霉素索莱宝生命科学MA0110100 ´
磷酸盐缓冲液VivaCellC3580-0500pH 7.2-7.4
甲基丙烯酰化丝素蛋白EFLEFL-SilMA-00139% 取代度
吐温 X-100索莱宝生命科学T8200
胰蛋白酶-EDTAVivaCellC100C10.25%，不含酚红

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