使用 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基对组织样结构进行嵌入式生物打印

摘要

本研究介绍了一种新型 κ-角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴，显示出显着的可逆干扰-非干扰过渡特性。这些属性有助于在嵌入式 3D 生物打印中构建仿生组织和器官。成功打印具有高分辨率和细胞生长的心脏/食管样组织，展示了高质量的生物打印和组织工程应用。

摘要

利用颗粒水凝胶支撑浴的嵌入式三维 （3D） 生物打印已成为创建仿生支架的关键技术。然而，设计一种合适的凝胶悬浮培养基来平衡精确的生物墨水沉积与细胞活力和功能存在多重挑战，尤其是在实现所需的粘弹性方面。在这里，通过易于操作的机械研磨工艺制造了一种新型 κ-角叉菜胶凝胶支撑浴，产生均匀的亚微米级颗粒。这些亚微凝胶表现出典型的 Bingham 流动行为，具有较小的屈服应力和快速剪切稀化特性，有助于生物墨水的顺利沉积。此外， κ-卡拉胶微凝胶网络的可逆凝胶-溶胶转变和自愈能力确保了打印结构的结构完整性，从而能够创建具有明确结构特征的复杂、多层组织结构。打印后， κ-角叉菜胶亚微凝胶可以通过简单的磷酸盐缓冲盐水洗涤轻松去除。使用载细胞生物墨水的进一步生物打印表明，仿生构建体内的细胞具有 92% 的高活力，可快速扩展伪足，并保持稳健的增殖，表明这种生物打印策略在组织和器官制造方面的潜力。总之，这种新型 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基成为一种有前途的高质量嵌入式生物打印途径，对工程组织和器官的 体外 发育具有深远的影响。

引言

组织工程支架，包括静电纺丝纤维、多孔海绵和聚合物水凝胶，通过提供支持细胞生长、组织再生和器官功能恢复的结构框架，在受损组织和器官的修复和重建中发挥关键作用 ^1,2,3.然而，传统支架在准确复制天然组织结构方面遇到了挑战，导致工程组织和天然组织不匹配。这种限制阻碍了缺陷组织的有效愈合，强调了支架设计进步以实现更准确的仿生学的迫切需求。三维 （3D） 生物打印是一种创新的制造技术，它使用生物材料墨水和细胞逐层精确构建复杂的生物组织结构⁴。在各种生物材料中，聚合物水凝胶成为理想的生物墨水，其独特的网络有助于细胞的原位封装，并关键地支持其生长 ^5,6。然而，当用作生物墨水时，许多柔软且高度水合的水凝胶在打印过程中往往会诱导打印的支架结构模糊或快速塌陷。为了应对这一挑战，嵌入式 3D 生物打印技术采用微凝胶浴作为支撑材料，可实现精确的软生物墨水沉积。水凝胶生物墨水凝胶化后，通过去除微凝胶浴获得具有复杂结构的精制仿生支架。明胶 ^7,8、琼脂糖⁹ 和结冷胶^10,11 等材料已被用于制造用于嵌入式 3D 生物打印的微凝胶浴，显着推动了软水凝胶在组织工程中的应用。然而，这些颗粒凝胶的微米级和不均匀粒径会对 3D 打印的分辨率和保真度产生不利影响 12,13,14。迫切需要制造一种具有小而均匀分散颗粒的凝胶状悬浮浮子，为实现高保真生物打印提供优势。

在该协议中，提出了一种具有均匀亚微米级的新型牺牲颗粒 κ-卡拉胶悬浮浴，用于嵌入式 3D 打印。这种快速干扰-去干扰过渡的创新亚微凝胶浴行为有助于精确制造具有高结构保真度的仿生水凝胶支架¹⁵。利用这种新的悬浮培养基，采用由甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸丝纤维组成的复合生物墨水，成功打印了一系列具有多层组织结构的仿生组织和器官构建体。在这项研究中，我们选择食管作为 3D 生物打印仿生对象，主要是因为食管不仅具有多层组织结构，而且其肌肉层表现出内部圆形和外部纵向复杂的分层结构。确保这些层的正确对齐和组织对于功能性组织再生至关重要。因此，我们非常希望复制食道的多层结构。更重要的是，我们利用 κ-角叉菜胶亚微凝胶作为悬浮浴，使用 GelMA/SFMA 作为生物墨水来设计和构建用于组织工程的仿生支架。打印的食管可以通过反复磷酸盐缓冲盐水清洗轻松释放。此外， κ-角叉菜胶亚微凝胶浴不含细胞毒性物质，可确保高细胞相容性¹⁵。加载在各向异性支架内的平滑肌细胞表现出显着的扩散活性。这种均匀的亚微凝胶悬浮培养基为通过嵌入式 3D 生物打印制造复杂组织和器官提供了一条新途径。

方案

1. κ -角叉菜胶亚微凝胶混悬浴的制备

1. 通过将 1.75 g κ-卡拉胶粉末添加到 1,000 mL 玻璃瓶中的 500 mL 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）溶液中，制备 500 mL κ-卡拉胶悬浮浴（0.35% wt/vol）。
2. 将 70 mm 磁力搅拌棒引入玻璃瓶中以搅拌水性混合物。拧紧玻璃瓶盖，然后松开半圈。
3. 将玻璃瓶置于 70 °C 水浴中并加热。以 300 rpm 的速度打开磁力搅拌器，放置瓶子，搅拌至聚合物完全溶解。
4. 取另一个玻璃瓶，将其放入高压灭菌器中进行灭菌，在 121 °C 下运行 30 分钟。
5. 高压灭菌器冷却至 80 °C 后，从灭菌器中取出瓶子，将其转移到超净工作台上进行进一步处理。
6. 使用 0.22 μm 过滤器将完全溶解的 κ-角叉菜胶溶液过滤到灭菌的玻璃瓶中。
   注:当溶液很热时，应迅速进行过滤，以防止 κ-角叉菜胶冷却并阻塞过滤器。
7. 将 κ-角叉菜胶溶液储存在 4 °C 以诱导阳离子交联凝胶 12 小时。
8. 在 25 °C 下，使用 60 mm 磁力搅拌器以 1200 rpm 的搅拌速度机械研磨 κ-角叉菜胶水凝胶，直至其成功转变为液态，大约需要 60 分钟。
   注意:将 κ-卡拉胶水凝胶储存在 25-37 °C 之间，以避免在低温下凝胶化或在高温下溶解。

2. 甲基丙烯酸明胶/丝素蛋白甲基丙烯酸酯复合生物墨水的制备

1. 通过在 PBS 溶液 （pH 7.4） 中混合 10% （wt/vol） 甲基丙烯酸明胶 （GelMA） 和 6% （wt/vol） 丝素蛋白甲基丙烯酸酯 （SFMA） 来制备复合生物墨水。分别称取 2.0 g GelMA 和 1.2 g SFMA 粉末。
2. 将粉末缓慢加入两个 50 mL 离心管中。将 10 mL PBS 溶液分别添加到 50 mL 离心管中。
3. 向每个容器中加入 10 mm 磁力搅拌器，并在 45 °C 的水浴中不断搅拌和加热。 让 GelMA 和 SFMA 粉末完全溶解，大约需要 30 分钟。
4. 在 45 °C 下连续搅拌，将 GelMA 和 SFMA 溶液以等体积混合。 使用 100 μm 孔径过滤器过滤复合生物墨水。
5. 在生物安全柜中通过紫外线照射对复合 GelMA/SFMA 生物墨水消毒 12 小时。
   注意:立即准备并使用生物墨水，以防止 SFMA 因自组装而过早凝胶化。

3. κ -角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴的流变学特性

1. 启动并准备流变学相关设备。
   1. 打开空气压缩机 30 分钟，确保压力达到 30 psi。逆时针转动拉杆，拆下轴承夹。固定下面的黑色盖子，然后顺时针旋转仪器顶部的旋钮轴。
   2. 打开流变仪电源并使其初始化。打开循环水开关，让温度达到 15 °C。
   3. 打开流变仪控制软件以建立在线连接。
2. 校准流变仪并安装平行板几何形状。
   1. 在控制软件中进行仪器校准，主要涉及调整校准仪器惯量路径。将直径为 40 mm 的平行板几何形状安装到拉杆的末端。按住 Lock 按钮 3 秒，将电机轴移动到初始位置，以实现一致的几何图形放置。
   2. 在控制软件中选择 校准管理器 ，然后单击 惯性、摩擦校准 和 旋转映射 以校准平行板几何结构。
3. 通过执行标准间隙归零程序将流变仪间隙高度归零，以确保精确测量。
4. 设置实验步骤，包括 0.01 至 1000 1/s 剪切速率的流梯度、10 rad/s 时 0.1% 至 100% 应变的振幅扫描、持续 60 s 的多级振荡时间扫描，在 10 rad/s 时交替应变为 1% 和 100%，以及持续 120 s 的多级峰值保持扫描，交替剪切速率为 0.1 1/s 和 10 1/s。
5. 将 2 mL 0.35% κ-卡拉胶悬浮液滴到流变仪的 Peltier 板上。
6. 将几何间隙定位到 510 μm，并去除夹紧装置边缘的任何多余溢流。将样品间隙设置为 500 μm，以允许样品略微超出夹具边缘。
7. 通过从实验设计选项中选择 Flow Ramp 来执行流动实验。
   1. 在试验设计中选择 Flow Ramp 检验。在 25 °C 的温度下，将剪切速率设置为 0.001 至 10 1/s。
   2. 对添加的样品执行步骤 3.5 和 Flow Ramp 实验。
8. 执行循环峰值保持测试以评估材料的回收性能。
   1. 在实验设计中选择 Peak Hold sweep 并在 25 °C 下设置 5 个连续实验，时间为 120 s。
   2. 将第一、第三和第五步的剪切速率设置为 0.01 1/s，将第二和第四步的剪切速率设置为 10 1/s。
   3. 添加 2 mL 的新样品。执行步骤 3.5 和循环恢复测试。
9. 进行粘弹性分析以评估 κ-角叉菜胶悬浮浴的潜在凝胶-溶胶转变。
   1. 在实验设计中选择 Amplitude Sweep 检验。在 25 °C 的温度下将振荡应变设置为 0.1% 至 100%。 单击 Start 对添加的样品执行 Amplitude Sweep 实验。
10. 执行替代应变分析以评估材料的弹性恢复性能。
    1. 在实验设计中选择 Oscillation Time Sweep 并在 25 °C 下设置 5 个连续实验，时间为 60 s。
    2. 将第一、第三和第五步的应变设置为 1%，第二步和第四步的应变设置为 100%。
    3. 添加 2 mL 的新样品。执行步骤 3.5 和连续循环恢复测试。
       注:每次实验测试后清洁几何板和 Peltier 板，并添加 2 mL 的新样品。

4. 使用定制设计的微挤压生物打印机打印仿生水凝胶支架

1. 使用 3D 图形软件设计 STL 格式的立方体，并从 3D 数据库下载组织状模型 （www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.）。
   1. 将 STL 格式模型导入 PANGO 软件并输入打印参数。设置模型在 3D 空间中的具体 X、Y、Z 坐标，输入模型期望的缩放尺寸（以毫米 （mm） 为单位），调整物体在 X、Y、Z 轴上的尺寸和缩放比例，根据需要调整模型在空间中的旋转角度。
   2. 将估计的细丝直径（大多数生物墨水通常约为 200-500 μm）输入到层厚字段中，以确定每层的 Z 轴厚度。根据预期的线条粗细（约 10-90 mm/s）设置打印速度，并将填充密度设置为 30%-80%。
   3. 将最终参数作为 G 代码导出到 SD 卡上。
2. 运行生物打印机和微挤出泵。
   1. 打开微挤出泵控制器，选择相应体积的注射器 （5 mL），并将挤出速率设置为 0.08 mL/min，并将挤出持续时间设置为与通过将水凝胶体积除以挤出速率获得的所需打印时间相协调。
   2. 将内径为 210 μm 的针头注射器安装到生物打印机的注射器槽中。
   3. 调整注射器控制器，确保注射器的柱塞与螺钉紧密接触。
   4. 将 3 mL 悬浮浴放入 35 mm 细胞培养皿中。根据代码设置将培养皿放置在平台上，并确认打印头高于培养皿底部 1 毫米。
      注意:进行预测试以确保打印过程中打印平台上培养皿位置的准确性。
   5. 将包含代码的 SD 卡插入 3D 生物打印机，激活代码文件，启动生物打印机，然后单击控制器上的 "开始 "按钮。
3. 结构的加工
   1. 将打印的构建体暴露在 405 nm 蓝光下 1 分钟以引发光交联。
   2. 使用 1 mL 移液管去除 κ-角叉菜胶凝胶，然后加入 3 mL PBS （pH 7.4） 进行洗涤和随后去除。重复此过程以彻底清洗。
      注意:轻柔地执行洗涤过程，以避免损坏打印的结构。

5. 食管肌肉层类似物的嵌入式 3D 生物打印

1. 培养兔食管平滑肌细胞 （eSMC）。
   1. 使用 15 mL 补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基，在 2 x 10⁶ 个细胞的 T75 培养瓶中开始培养。
   2. 将 eSMC 保持在 37 °C，在 5% CO₂ 和 95% 空气的潮湿环境中，直到它们达到 80% 汇合。
2. 食管肌层生物墨水的制备
   1. 达到汇合后吸出培养基，并用 5 mL 的 1x PBS 洗涤 eSMC。
   2. 向培养瓶中加入 2 mL 0.2% 胰蛋白酶-EDTA，孵育 2 分钟以消化细胞。点击烧瓶以将细胞从墙上分离。
   3. 通过添加 2 mL DMEM 终止消化，并将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中。使用含有 10 μL 细胞悬液的细胞计数器测量细胞密度。
   4. 以 675 x g 离心 3 分钟，小心吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于复合 GelMA/SFMA 生物墨水中（如步骤 2.1 中制备）。调整最终细胞浓度，使生物墨水中的密度达到 10 x 10⁶ 个细胞/mL，从而为后续的 3D 生物打印应用优化条件。
3. 3D 生物打印机和相关材料的准备
   1. 在标准灭菌条件（121 °C 30 分钟）下高压灭菌必要的打印工具，包括注射器针头、镊子、磁力搅拌器和 1000 mL 硅酸盐玻璃瓶，以确保打印过程的无菌环境。
   2. 将生物打印机放入生物安全柜中，并用紫外线 （UV） 消毒 30 分钟以保持无菌。
   3. 准备 50 mL 无菌 κ-角叉菜胶和 5 mL 无菌 GelMA/SFMA 复合生物墨水，分别如步骤 1 和步骤 2 所述。
   4. 设计模型，设置所需参数，并按照步骤 4.1 中的概述准备生物打印机。
4. 生物打印过程的启动
   1. 执行步骤 4.2 和 4.3 中描述的程序以生物打印 3D 食管肌肉层，然后进行 PBS 洗涤和更换。
   2. 在整个打印过程中使用无菌技术进行细胞打印，以最大限度地降低打印结构中细胞污染的风险。
5. 打印后细胞培养基更换
   1. 小心吸出 PBS，并用 3 mL 补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 代替。确保打印的构建体完全浸没以提供最佳的细胞生长条件。
   2. 将含有打印构建体的细胞培养皿在设置为 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中孵育。每天用新鲜培养基更换细胞培养基，每次使用 3 mL，并使用光学显微镜监测构建体内细胞的状态。

6. 通过 Live/Dead 测定染色评估打印构建体中 eSMCs 的活力

1. 孵育 5 小时后取出细胞培养基，并用 PBS 洗涤载有细胞的构建体。
2. 将 2 mL 标准钙黄绿素-AM/碘化丙啶溶液 （1:1000） 添加到载有细胞的打印构建体中并孵育。
3. 孵育 45 分钟后，用 PBS 洗涤构建体 3 次，然后加入新鲜的细胞培养基。
4. 使用共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 观察活细胞和死细胞并捕获荧光图像。

7. 通过 FITC-鬼笔环肽/DAPI 染色观察打印构建体内的 eSMC

1. 使用异硫氰酸荧光素 （FITC） 标记的鬼笔环肽（绿色）对打印的构建体进行染色，用于 F-肌动蛋白和 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色），用于孵育 5 天后的核。
2. 固定液制备
   1. 将 4 mL 1x PBS 与 0.16 mL 多聚甲醛 （PFA） 混合在 5 mL 聚乙烯 （PE） 管中，达到 4% 的最终浓度。
   2. 将含有生物打印构建体的培养皿放在干净的表面上。去除培养基并用 PFA 溶液轻轻覆盖构建体，确保其完全浸入水中。在丢弃溶液之前，让固定在室温下进行 20 分钟。
      注:在添加和去除过程中小心处理液体，以保持生物打印结构的结构完整性。
   3. 将 2.5 mL 的 1x PBS 引入培养皿中，将构建体完全浸没以去除任何残留的染色试剂。
3. 细胞膜透化
   1. 通过在 5 mL PE 管中将 20 μL Triton X-100 添加到 4 mL 1x PBS 中，配制 0.5% Triton X-100 溶液。
   2. 在室温下将 Triton X-100 溶液施用到构建体中 30 分钟以渗透细胞膜，然后去除溶液。
   3. 将 2.5 mL 的 1x PBS 引入培养皿中，将构建体完全浸没以去除任何残留的染色试剂。
4. 阻断非特异性结合
   1. 通过将 0.12 mL BSA 添加到 4 mL 1x PBS 中，在 5 mL PE 管中制备 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 封闭溶液。
   2. 在室温下将 BSA 溶液引入构建体 30 分钟以阻断非特异性位点，然后丢弃溶液。
5. 用 FITC-鬼笔环肽进行肌动蛋白染色
   1. 在 5 mL PE 管中制备 0.2% FITC-鬼笔环肽溶液，加入 4 mL 1x PBS 和 8 μL 染色试剂。
   2. 将构建体在室温下避光浸入该溶液中 60 分钟，然后丢弃溶液。
   3. 向培养皿中加入 2.5 mL 的 1x PBS，将构建体完全浸没以去除残留的染色试剂。
6. 使用 DAPI 进行细胞核染色
   1. 将 4 mL DAPI 染色溶液涂在构建体上，确保完全覆盖。
   2. 在室温下避光孵育 20 分钟，然后去除 DAPI 溶液。
7. 最终洗涤和 PBS 浸没:向培养皿中加入 2.5 mL 的 1x PBS，完全浸没构建体以去除残留的染色试剂。
   注意:提前准备染色溶液并轻轻处理。细胞在任何时候都不应在培养容器内进行干燥。
8. 使用共聚焦显微镜观察:使用共聚焦显微镜检查染色的构建体并对其进行成像，以评估细胞生长，确保全面记录结果。

8. 使用 CCK-8 测定评估打印构建体内 eSMCs 增殖

1. 在第 7 天和第 14 天从构建体中取出培养基。用 PBS 洗涤构建体以去除残留培养基和分离的细胞。
2. 按照制造商的说明将 CCK-8 溶液添加到每个构建体中。确保 CCK-8 溶液的体积足以完全覆盖每个构建体。
3. 将构建体与 CCK-8 溶液在 37 °C 下孵育 2 小时。孵育后，小心地将上清液转移到新的 96 孔板中。
4. 使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

结果

颗粒状 κ-角叉菜胶凝胶浴是通过将块状水凝胶机械分解成颗粒状凝胶浆液而生成的。最近的研究表明，κ-角叉菜胶颗粒的平均直径约为 642 ± 65 nm，在 1000 rpm 的机械混合¹⁵ 下具有均匀的形态，明显小于先前文献中报道的微凝胶的尺寸 16,17,18.更长的破碎时间和更高的速度导致更小的微粒尺寸，在本研究中，在 1200 rpm 下混合时间为 60 分钟，产生平均直径为 565 ± 86 nm 的亚微粒（补充图 1）。预计如此小的粒径将提高打印过程的分辨率。这些颗粒通过形成氢键和阳离子相互作用组装成颗粒状凝胶（图 1A）。当受到压力时，κ-卡拉胶亚微凝胶培养基表现出屈服、剪切稀化和可逆的干扰-去干扰转变等特征行为，所有这些都是成功嵌入 3D 生物打印所必需的。图 1B 显示了流速斜坡测试后颗粒状 κ-角叉菜胶凝胶的代表性产量行为和剪切变薄。随着剪切速率从 0.001 增加到 10 ^s-1,0.35% （wt/vol） 颗粒 κ-角叉菜胶凝胶的剪切应力在剪切速率低于 0.3 ^s-1 时保持相对不变，表明 3.5 Pa 的低屈服应力。随后，观察到剪切应力随剪切速率线性增加，表明其流动行为类似于宾汉流体的流动行为。此外，κ-角叉菜胶亚微凝胶的应变扫描流变测量揭示了从凝胶到溶胶的独特转变。这些凝胶在超过 10% 的菌株下产生，并在 35% 的菌株下经历 gel-sol 转变（图 1C）。亚微粒凝胶的小产率应变归因于通过氢键和阳离子相互作用建立的物理网络。这种 gel-sol 转变行为是可逆的。如图 1D 所示，在 100% 的应变下，κ-角叉菜胶亚微凝胶的储能模量从 38 Pa 骤降至 6 Pa，低于损耗模量，表明处于溶胶状态。相反，当应变突然降低到 1% 时，储能模量迅速恢复到大约 38 Pa。它在 5 s 内超过了损耗模量，表明 κ-角叉菜胶亚微凝胶能够快速重新建立粒子之间的物理交联。

颗粒状 κ-角叉菜胶凝胶的特点是其小而均匀的形态，表现出剪切稀化特性、快速自我恢复和屈服应力行为，这有利于它们在嵌入式 3D 生物打印应用中的使用。为了评估 κ-卡拉胶亚微凝胶悬浮液作为嵌入式打印支撑浴的功效，一种广泛使用的生物墨水，由 10% （wt/vol） 甲基丙烯酸明胶和 6% （wt/vol） 丝素蛋白甲基丙烯酸酯复合材料 （GelMA/SFMA） 组成，用于 κ-卡拉胶培养基内的打印试验^19,20。用罗丹明标记 GelMA 以增强可视化²¹。如图 2A 所示，颗粒状 κ-卡拉胶凝胶浴高度透明，有助于实时监测打印过程。当喷嘴速度在 10-90 mm/s 范围内变化时，喷嘴产生的剪切速率范围为 0.66 至 6 ^s-1。κ-角叉菜胶亚微凝胶浴在 6 s ^-1 和 0.01 ^s-1 的交替速率连续循环剪切后 20 s 内仍表现出自愈行为（补充图 2）。在 κ-角叉菜胶亚微凝胶浴中维持尺寸为 15 x 15 x 2 mm³ 的网格结构，层厚为 150 μm。值得注意的是，网格表现出非凡的完整性和分辨率，单根细丝的宽度约为 200 μm，细丝间距约为 350 μm，共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 图像验证（图 2B、C）。此外，3D 网格结构具有具有互连孔隙的多孔网络。这些是影响适印性并最终影响细胞行为的重要属性，例如细胞存活、增殖和分化潜力。

为了进一步确认 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基适用于生成复杂的组织和器官结构，使用 GelMA/SFMA 墨水以 80% 的高填充密度制造了人类心脏模型和三叶心脏瓣膜。打印的心脏模型准确复制了 3D 解剖形状，包括主要静脉和动脉（图 2D），并在去除水后表现出机械稳定性（图 2E）。三瓣心脏瓣膜显示不同的瓣叶和支撑结构（图 2F）。此外，构建体内的细丝很容易剥落（图 2G）。此外，像食道这样的分层循环模型被准确地重建。如图 2H 和 2I 所示，打印的食管表现出清晰的分层，各个层之间有明显的分界线以复制相应的食管组织层，这表明 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基支持组织工程所需的结构复杂性。虽然目前的模型无法复制真实人体组织和器官的全部功能，但 κ-角叉菜胶亚微凝胶浴可能为复杂组织和器官的 体外 制造提供了一种可行且有前途的策略，在研究、治疗和诊断方面具有潜在应用。

具有纵向和横向各向异性的网格支架模拟食道的肌肉层（图 3A、B），由明显的内圆形肌肉层和外纵肌层组成。为了 在体外复制这种各向异性结构，将兔食管平滑肌细胞 （eSMC） 小心地嵌入 GelMA/SFMA 生物墨水中。通过使用 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基，成功实现了与食管双层肌肉结构非常相似的具有 eSMCs 的仿生支架。培养 5 小时后，用 Live/Dead 染色评估包埋在水凝胶中的细胞的活力。它显示水凝胶网络内存在大量活细胞（染成绿色）和极少比例的死细胞（染成红色），表明细胞活力高（图 3C）。定量分析显示存活率高达 92%（图 3D）。这些结果表明水凝胶材料的生物相容性，以及打印和交联方法在保持细胞完整性方面的有效性。为了进一步检查 GelMA/SFMA 构建体内的细胞形态，在细胞培养 3 天后捕获鬼笔环肽（绿色）/DAPI（蓝色）图像。如图 3E 所示，仿生构建体中的大量 eSMC 投射出大量的伪足，并表现出沿微纤维的排列，如培养 3 天后所示。3D 重建进一步证实了食管肌肉层的精确复制（补充 图3）。此外，使用 CCK-8 测定在第 1 天、第 7 天和第 14 天评估 eSMC 增殖。从第 1 天到第 7 天和第 14 天，450 nm 处的吸光度值显着增加，反映了强大的增殖行为（补充图 4）。这些结果表明 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基在促进高质量仿生生物打印方面具有巨大潜力。

图 1:自组装的 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基及其流变学分析。 （A） 通过氢键和阳离子相互作用形成的 κ-角叉菜胶亚微凝胶浮子的示意图，用于嵌入式 3D 生物打印。（B） 在 25 °C 下，0.35% （wt/vol） 卡住 的 κ-角叉菜胶亚微凝胶上的流速斜坡。（C） 在 25 °C 下通过 0.1% 至 100% 的振幅扫描测量 κ-角叉菜胶亚微凝胶中的凝胶-溶胶转变。（D） 在 25 °C 下以 1% 和 100% 交替应变连续循环剪切后，0.35% （wt/vol） κ-角叉菜胶亚微凝胶的自修复分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:使用 κ-卡拉胶亚微凝胶悬浮浴对罗丹明标记的 GelMA/SFMA 墨水进行高保真嵌入式 3D 生物打印。 （A） κ-卡拉胶亚微凝胶悬浮浴中嵌入式 3D 打印的实时观察。（二、 三）共聚焦激光扫描显微镜图像，说明了 （B） 3D 重建和 （C） 打印网格的内部结构。（D， E）3D 打印的心形模型在水溶液 （D） 和自然状态 （E） 下的照片。（F） 三叶心脏瓣膜的照片和 （G） 从结构体上剥离的细丝。（H） 顶部和 （I） 前视图照片捕获了使用 GelMA/SFMA 墨水打印的食管模型，展示了分层的四层结构。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:使用 κ-角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴的载细胞生物打印。 （A、 B） （A） 食管的内圆形和外纵向肌肉结构的示意图，以及 （B） 嵌入式 3D 生物打印产生的各向异性食管肌肉层仿生支架。（C） 5 小时时在 GelMA/SFMA 支架中生长的 eSMC 的活/死染色图像和 （D） 定量活力。（E） 第 3 天在 GelMA/SFMA 支架中生长的 eSMC 的投影图像。从左到右:细胞核、F-肌动蛋白和合并视图。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图 1: （A） 扫描电子显微镜图像显示 κ-角叉菜胶亚微凝胶的均匀形态。（B） 用激光纳米粒度分析仪测量 κ-角叉菜胶微粒的直径分布。 请点击此处下载此文件。

补充图 2:在 25 °C 下以交替的 0.01 ^s-1 和 6 ^s-1 速率连续循环剪切后，对 0.35% （wt/vol） 的 κ-角叉菜胶亚微凝胶进行自恢复分析。请单击此处下载此文件。

补充图 3: 打印网格的 3D 重建图像。 请点击此处下载此文件。

补充图 4:使用 CCK-8 测定 （n = 3） 评估 1 、 7 和 14 天后封装在 GelMA/SFMA 水凝胶中的 eSMC 的增殖活性。通过单因素方差分析分析统计显着性，然后对三组进行 Tukey 事后分析，**p<0.01，****p < 0.0001。数据显示为平均值±标准差。请点击此处下载此文件。

讨论

用于生物打印的 κ-角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴的制备是一个精心策划的过程，涉及几个关键步骤，以确保所得培养基表现出支持生物墨水所需的特性。最初，通过将 κ-卡拉胶粉末在高温下溶解在去离子水中，形成均匀的混合物来制备 κ-卡拉胶溶液。溶液的浓度是关键，必须针对后续的凝胶化进行优化。0.3-0.6% （wt/vol） κ-角叉菜胶在嵌入式 3D 生物打印中表现出优异的性能¹⁵。冷却后，该溶液转变为散装凝胶。

然后对块状凝胶进行机械研磨策略以产生亚微凝胶颗粒。这涉及将凝胶分解成大小均匀的颗粒的高剪切机械力。研磨工艺参数，包括剪切强度、时间和温度，都经过精确控制，以实现所需的粒度分布。研磨后，亚微凝胶颗粒储存在 25-37 °C 以防止聚集或溶解，这对于维持支持复杂生物打印任务的均匀悬浮液至关重要。建议准备好凝胶并立即使用。

κ-角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴的生产易于操作，确保与工业应用以及对大规模组织工程和再生医学工作不断增长的需求保持一致。此外，κ-角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴采用细胞相容性 PBS 或培养基作为溶剂，可确保出色的生物相容性，使其成为支持生物打印构建体中细胞的理想培养基。在无菌制备条件下，颗粒凝胶的保质期约为 1 个月。

κ-卡拉胶亚微凝胶浴的特点是其 Bingham 塑料流动行为（图 1B），表现出优异的剪切稀化特性和快速自愈能力（图 1C、D），这对于提高打印结构的精度至关重要。事实证明，这种亚微凝胶浴的应用在创建具有多层结构的组织方面是有效的（图 2），确保生产具有高保真度和分辨率的结构。值得注意的是，在嵌入载细胞生物墨水中的细胞中快速伪足延伸的能力（图 3），强调了浴与细胞过程的兼容性。因此，这种 κ-角叉菜胶亚微凝胶浴为体外组织和器官制造领域带来了变革性的前景。它通过促进更复杂、更可行和功能整合的组织结构的开发，对组织工程和再生医学产生深远影响。

尽管 κ-角叉菜胶亚微凝胶浴在生物打印和组织工程中的应用具有相当大的潜力，但仍然存在一些挑战和限制。主要问题是其成分应与细胞培养基非常相似，这对于在大器官的扩展打印过程中维持细胞活力至关重要。 κ-角叉菜胶亚微凝胶主要使用 PBS 作为溶剂生产，这需要掺入各种细胞培养基来溶解材料。除 PBS 外， κ-卡拉胶也使用氯化钙溶液进行糊化。然而，氯化钙溶液可能会对细胞造成毒性或造成渗透压失衡。因此，使用细胞培养基是 κ-角叉菜胶溶剂和交联剂的理想选择。此外，实现微凝胶的高通量无菌生产是一项重大挑战。 κ-卡拉胶溶液的灭菌需要在高温下通过 0.22 μm 过滤器进行过滤。然而，无菌 κ-卡拉胶的产量经常受到各种因素的阻碍，包括 PBS 溶液的质量和过滤过程中 κ-卡拉胶的冷却。每个过滤批次通常仅产生 20-50 mL 无菌 κ-角叉菜胶，这对 κ-角叉菜胶微凝胶的高通量生产构成了重大障碍。因此，未来的研究将侧重于优化生物制造过程，评估长期细胞活力和功能，以及探索打印组织与生命系统的整合。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D 生物打印机	定制设计的
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚	Solarbio 生命科学	C0065	即用
405 nm 紫外光	EFL	XY-WJ01
细胞计数器	康宁	Cyto smart 6749
共聚焦激光扫描显微镜	徕卡	STELLARIS 5
DMEM 高葡萄糖	VivaCell	C3113-0500	高葡萄糖，含丙酮酸钠和 L-谷氨酰胺
动态旋转流变仪	TA 仪器	发现 HR-20
食管平滑肌细胞	由宁波大学健康科学中心细胞生物学与再生医学系提供	兔食管的原代细胞
		F9070L
异硫氰酸荧光素 标记鬼笔环肽	Solarbio 生命科学	CA1610	300T
甲基丙烯酸明胶	EFL	EFL-GM-60	60% 取代
k-卡拉胶	阿拉丁	C121013-100g	试剂级
苯基锂（2,4,6-三甲基苯甲酰基）膦酸	阿	L157759-1g	365~405 nm
Live-Dead kit	beyotime	C2015M
微孔板读取器	Potenov	PT-3502B
多聚甲醛	Solarbio 生命科学	P1110	4%
青霉素/链霉素	Solarbio 生命科学	MA0110	100 &急性;
磷酸盐缓冲盐水	VivaCell	C3580-0500	pH 7.2-7.4
丝素蛋白甲基丙烯酸酯	EFL	EFL-SilMA-001	39% 替代
Triton X-100	Solarbio Life Science	T8200
胰蛋白酶-EDTA	VivaCell	C100C1	0.25%，不含酚红