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人类心脏多尺度三维解剖研究流程

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DOI：

10.3791/66817

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2024年6月28日

 ,  ,  , 
1University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, UCLA Health System, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Neurocardiology Program of Excellence, UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, David Geffen School of Medicine at UCLA

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种综合性的分析流程，用于分析来自人类心脏的样本，涵盖微观和宏观尺度。

摘要

对因不适合移植而被弃用的非衰竭人类心脏进行详细研究，为在微观和宏观尺度上开展结构分析提供了独特的机会。这些技术包括组织透明化处理（改良的免疫标记辅助溶剂清除器官三维（3D）成像）和免疫组织化学染色。介观层面的检测方法包括立体解剖和显微计算机断层扫描（micro-CT）。宏观层面的检测方法包括大体解剖、摄影（包括立体图像和摄影测量法）、CT扫描，以及对实际或虚拟解剖后的心脏或完整心脏进行3D打印。在进行宏观检测之前，可实施压力灌注固定，以维持心脏的三维结构及其生理相关的形态。将上述技术联合应用于人类心脏研究具有独特性，对于理解冠状血管系统与心肌神经支配等解剖特征在心脏三维结构背景下的相互关系至关重要。本实验方案详细描述了相关方法，并包含代表性结果 ，以展示人类心脏解剖学研究的进展。

引言

结构决定功能，因此理解心脏的结构是认识其生理功能的基础。尽管大量研究已从微观到宏观尺度揭示了心脏的解剖结构1,2,3，但许多问题仍未解决，尤其是与人类心脏解剖相关的问题。部分原因在于，专注于功能解剖的基础研究通常采用动物心脏4,5,6，而动物心脏往往与人类心脏存在显著差异1,7,8。此外，即使使用人类心脏样本的研究，也往往集中于非常特定的结构，导致其研究结果难以在整体心脏的背景下加以应用。若所关注的结构处于微观或介观尺度，例如闰盘周围区域（perinexus）9和节状神经丛（ganglionated plexuses）10，这一问题尤为突出。

在此背景下，对因不适合移植而被弃用的人类心脏进行系统性结构研究，为获取涵盖微观与宏观尺度的心脏结构综合图谱提供了独特且罕见的机会11。微观检测方案包括组织透明化处理（改良的免疫标记辅助溶剂清除器官三维成像技术，iDISCO+）12,13,以及免疫组织化学染色。介观检测方案包括立体解剖、大体摄影和显微计算机断层扫描（micro-CT）。宏观检测方案包括大体解剖14、摄影（包括立体图像和摄影测量）15,16,17、CT扫描、虚拟解剖18，以及对实体或虚拟解剖后的心脏或完整心脏进行三维打印17。为准备宏观检测，需进行压力灌注固定 ，以维持心脏的三维结构及其生理相关的形态特征14,19,20,21 。 综合应用这些技术具有独特性和关键性，可实现对人体心脏三维结构背景下不同解剖特征的相互关联分析。

由于获取非病理性人类心脏样本的机会极为有限，本文所述的多尺度方法可最大化利用样本。通过应用下述各种方法，代表性结果将向读者展示这些发现如何可用于多种用途，包括科学研究中的探索11（心脏神经支配的全面分析、神经节丛分布）、临床操作的改进（外科及介入治疗方案的模拟）以及解剖学教育（心脏解剖结构的真实三维演示）。

方案

本研究使用了来自非衰竭供体人心脏的去标识组织样本，该研究已获得加州大学洛杉矶分校（UCLA）机构审查委员会的批准。样本来源于因不适合移植而被弃用的非衰竭心脏。心脏经压力灌注后，用4%多聚甲醛（PFA）固定，并在组织处理前进行成像，具体方法如下。图1总结了本研究的流程图。研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 微观尺度检测

  1. 使用改良的免疫标记辅助溶剂清除器官三维成像技术进行组织透明化 (iDISCO+) 方案
    1. 用手术刀将4%多聚甲醛固定的组织切成适合共聚焦显微镜3 mm × 16 mm × 25 mm样品室的大小。 为了成像较厚的组织，可在载玻片上叠加额外的腔室和/或间隔片。
    2. 使用梯度甲醇（MeOH）系列（去离子水中含20%、40%、60%、80%和100% MeOH）对样品进行脱水2O [体积/体积]）中，室温（RT）振荡孵育，每次1小时。
    3. 用……洗涤 100% 在室温下用甲醇孵育1小时，然后在室温下用66%二氯甲烷/33% MeOH振荡浸泡过夜。
    4. 第二天，在室温下用甲醇（100%）洗涤两次，每次1小时，4 °C冷藏，然后用5% H2O2 在4 °C下于甲醇（体积比）中过夜。
    5. 用梯度甲醇溶液（80%、60%、40% 和 20% MeOH）复水，并在室温下用 0.01 mol/L PBS 振荡洗涤，每次 1 小时。
    6. 洗涤组织 在含0.2% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中，室温下振荡洗涤两次，每次1小时。
    7. 在37 °C下，使用含0.01 mol/L PBS、20%二甲基亚砜（DMSO）、0.2% Triton X-100和0.3 mol/L甘氨酸的溶液振荡孵育2天，进行通透化处理以准备免疫标记。
    8. 在37 °C下，用含10% DMSO、0.2% Triton X-100和5%正常驴血清的0.01 mol/L PBS避光振荡孵育2天。
    9. 使用与甲醇偶联的荧光染料相容的一抗，在含10 mg/mL肝素（PTwH）、0.2% Tween-20、5% DMSO和3%正常驴血清的0.01 mol/L PBS中稀释，孵育3–4天 在37 °C下振荡培养。
    10. 补充抗体溶液，于37 °C振荡孵育另外3-4天。
    11. 在一次抗体溶液中孵育1周后，于室温下在PTwH中洗涤4至5次，每次过夜。
    12. 在含3%正常驴血清的PTwH中，加入与荧光染料偶联的二抗，37 °C振荡孵育3天。
    13. 补充二抗溶液，继续孵育3分钟 37 °C 摇床培养数天。
    14. 6天后 在二抗溶液中孵育，于室温下用PTwH洗涤4-5次，过夜。
    15. 使用梯度甲醇溶液脱水（20%、40%、60%、80%、100% 和 100% MeOH）。样品可在室温下保存过夜。
    16. 在66%二氯甲烷/33%甲醇中室温振荡孵育3小时。
    17. 在室温下用100%二氯甲烷振荡洗涤两次，每次15分钟。
    18. 在苯甲醚中孵育并储存样本。装满试管以尽量减少空气对样本的氧化。
  2. 成像透明化组织样本
    1. 将含有粘合剂的腔室固定到载玻片上，并在腔室周围涂抹指甲油。 对于较厚的组织，可在载玻片上叠加额外的腔室和/或间隔器。
    2. 将清除组织置于腔室中，加满 用苄基醚封片，盖上盖玻片。
    3. 在盖玻片周围涂抹指甲油以形成密封 密封。
    4. 使用正置激光扫描共聚焦显微镜，配备5倍或10倍物镜，获取平铺扫描（tilescan）和Z轴层扫（Z stack）图像，成像深度可达物镜的工作距离。
    5. 使用适用于所用荧光染料发射光谱的激光线，以 1024 x 1024 分辨率成像。采用 488 nm 激光线可观察到肌肉的自发荧光。
    6. 确保 z 轴步长根据指定物镜的数值孔径，符合奈奎斯特采样标准11.
    7. 拼接图像并使用软件进行三维可视化。
    8. 使用Z轴层叠图像的最大强度投影（MIP）生成单个通道及合并通道的图示图2).
  3. 免疫组织化学
    注意：组织经石蜡包埋后22，以下步骤用于制备免疫组织化学研究用切片。
    1. 折射率匹配溶液（RIMS）的制备
      1. 通过加入10.9 g Na2HPO4 （无水）和 3.1 克 NaH2PO4 （一水合物）加入去离子 H2加水至总体积为1 L（pH 7.4）。过滤除菌后，室温保存。
      2. 将磷酸盐缓冲液稀释至 0.02 mol/L。
      3. 将Histodenz溶于30 mL的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液中，使用磁力搅拌子在最终储存瓶中搅拌10分钟，储存瓶应密封以减少蒸发和污染。
      4. 加入叠氮化钠至终浓度为0.01%（w/v），并用NaOH调节pH至7.5。
      5. 通过调整Histodenz的终浓度来调节折射率。
      6. 将RIMS在室温下保存数月。若发现微生物污染，则弃用。
        注意：含有叠氮化钠的溶液切勿进行高压灭菌。
    2. 免疫组织化学研究用切片的制备
      1. 使用切片机制作5 µm厚度的切片。将组织切片贴附于带电荷的载玻片上。
      2. 通过将载玻片在二甲苯中孵育以去除石蜡 >75% 二甲苯中孵育 10 分钟。将切片转移至另一含有二甲苯的容器中，继续孵育 10 分钟。
      3. 将切片浸入100% EtOH中10分钟，然后浸入95% EtOH中5分钟，再浸入70% EtOH中5分钟，以去除二甲苯。
      4. 用去离子水冲洗载玻片2O 培养 5 分钟。
      5. 将切片浸入抗原修复缓冲液中，在90-95℃下孵育25分钟°C
      6. 将容器在搅拌条件下静置，冷却至室温，持续1小时。
      7. 将切片浸入浸泡缓冲液（0.01 mol/L PBS + 0.4% Triton X-100）中，4 ℃孵育 30 分钟°C
      8. 用PAP笔围绕组织画圈。向每张载玻片加入PBS，并将其置于湿盒中以防止干燥。
      9. 室温下用 PBS 振荡洗涤载玻片 5 分钟。
      10. 用封闭液（0.01 mol/L PBS + 10% 驴血清 + 0.1% TX-100）在摇床上封闭1小时。
      11. 在封闭缓冲液中稀释一抗，4℃孵育过夜°C.
      12. 第二天，将载玻片置于室温下静置15分钟。
      13. 用含0.2% TritonX-100的0.01 mol/L PBS洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤3次。
      14. 在室温下，用封闭缓冲液稀释的二抗孵育1小时，同时轻轻振荡。
      15. 用含 0.2% TritonX-100 的 0.01 mol/L PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。
      16. 用 0.01 mol/L PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
      17. 用滴管取一滴 RIMS，加盖盖玻片。
      18. 在盖玻片周围涂抹指甲油以形成密封。
      19. 作为阴性对照，运行一个不加一抗的样本，以证明无特异性染色。
    3. 成像免疫染色切片
      1. 使用激光扫描共聚焦显微镜，分别以10x、20x和40x物镜对载玻片进行成像。
      2. 使用适合所用二抗发射光谱的激光线，以1024 x 1024分辨率进行成像。
      3. 使用Z轴层叠图像的最大强度投影（MIP）生成单个通道及合并通道的图示图3).

2. 中尺度观测

  1. 立体解剖
    1. 进行精细解剖，重点关注微小或薄层结构，例如房室结、房室结动脉和心脏神经丛（尺度为亚毫米至毫米级），可使用带夹持装置的放大台灯、手术望远镜或体视显微镜。
  2. 显微CT扫描
    注意：在压力灌注和固定后，可在解剖的任何阶段使用微型正电子发射断层扫描（PET）/CT扫描仪进行CT成像（图4）。
    1. 在样品成像前，预热CT X射线源25分钟。
    2. 将心脏样品放置在扫描仪载物床上。
    3. 将扫描仪载物床移至水平位置544 mm、垂直位置14 mm，以使心脏位于CT视野（FOV）中心。
    4. 以80 kVp、150 µA的参数，在1分钟扫描时间内采集720个投影图像，空间分辨率为200 µm。
    5. 对CT数据进行重建，重建视野为12 cm × 12 cm × 10 cm，矩阵为600 × 600 × 500体素，并保存为DICOM文件。

3. 宏观尺度检测

  1. 压力灌注与固定
    注意：作者对先前描述的压力灌注和固定技术进行了改进，并将其应用于因不适合移植而被弃用的非衰竭人类心脏14,19,20,21。
    1. 使用高流量泵进行灌注固定。固定液可选用100%乙醇14、4%多聚甲醛（PFA）或10%福尔马林。
      注意：心脏获取时应保留升主动脉、肺动脉干、上下腔静脉及肺静脉 ，尽可能远端切除，并置于 威斯康星大学溶液中运送23。
    2. 使用两根20–24 Fr的外科插管分别用于右心和左心的灌注。右心灌注时，插管插入上腔静脉，并在肺动脉干或肺动脉处放置排气装置，该装置由半切的12–30 mL塑料注射器（带鲁尔锁接头）连接三通阀构成。
    3. 在下腔静脉和其他肺动脉处用细绳结扎，结扎前插入适当大小并已锁定的半切塑料注射器或1.5–5.0 mL离心管。
      1. 对于左心的顺行灌注，将插管插入其中一根肺静脉，并在主动脉远端切口处放置排气装置，排气装置由半切的12–30 mL塑料注射器（带鲁尔锁接头）连接三通阀构成。
      2. 对于左心的逆行灌注，将插管插入主动脉弓的一个分支，并在另一分支放置排气装置。将插管尖端置于两个心室内部。
    4. 在插入适当大小并已锁定的半切塑料注射器或1.5–5.0 mL微型离心管后，用细绳封闭其他血管开口。使用薄纱布包裹注射器/管/插管的插入部分，以防止泄漏和滑脱。使用缝线、绑带或结扎方式固定较大的漏点；允许存在少量渗漏。
    5. 将心脏悬挂在塑料容器中。
    6. 将22–24 Fr的软塑料管连接至各插管，并将管子的另一端插入盛有固定液的容器中。
    7. 使用高流量泵分别以约100–300 mL/min（右心）和200–400 mL/min（左心）的流速，在右心和左心循环通路中循环固定液，使右心室压力达到约20 mmHg，左心室压力达到约80 mmHg。
    8. 在4 °C条件下持续灌注24小时。
    9. 用0.01 mol/L PBS溶液振荡洗涤心脏，每次30分钟，共洗涤四次。
    10. 将心脏储存在含0.02%叠氮化钠的0.01 mol/L PBS溶液中，4 °C保存。
      注意：压力灌注固定仅适用于新鲜心脏，不适用于从经防腐处理的尸体中获取的心脏。
  2. 大体解剖
    1. 在解剖的每个阶段进行逐步解剖，并同步拍摄记录。
    2. 为保持临床相关性，需特别注意避免任何结构的扭曲或变形，以维持心脏的生理形态。
    3. 采用具有临床相关性的方位（如右前斜位）对目标结构进行成像。
  3. 摄影
    1. 将经压力灌注并固定的心脏放置在带有平台的三脚架上，平台配备多个固定叉且可360o旋转。
    2. 使用数码单反相机 （图5）24进行拍摄，同时使用安装在C型支架上的多个LED灯板，并以宽幅黑色丝绒布作为背景。
    3. 使用长焦镜头（200 mm）进行拍摄，工作距离为4–6英尺，以最小化被摄物体的畸变14。
  4. 立体图像（anaglyphs）
    1. 为显示立体图像，需重建一对来自CT数据集的摄影图像或容积渲染图像，两幅图像在水平面上的旋转角度相差10°。
    2. 使用免费软件16将这一对二维（2D）图像（称为立体图）转换为立体图像（anaglyphs）。
    3. 观看立体图像时需佩戴红/青色眼镜。
  5. 摄影测量法
    注意：摄影测量法是一门应用科学，通过从不同角度拍摄的多张二维照片生成三维表面重建模型17。
    1. 将样本悬挂在C型支架上或置于旋转台上，使用智能手机拍摄数百张多方向照片。
    2. 使用商业软件生成FBX格式的三维模型。
  6. CT扫描
    注意：CT扫描可在压力灌注固定后进行，也可在解剖过程中的任何阶段进行。
    1. 将心脏样本悬挂在容器顶部横杆上。为防止扫描过程中心脏摆动，用固定在容器底部的塑料叉支撑心脏基底部。这样空气可作为负对比剂。
    2. 使用商用多排探测器CT扫描仪进行扫描，参数如下：管电压120 kV，管电流800–900 mA，机架旋转时间280 ms。剂量长度积通常为500–1200 mGy·cm。
    3. 使用以下参数重建轴向图像数据：层厚0.6 mm，重建间隔0.3 mm，视野尽可能小（通常为100–200 mm），矩阵512 × 512。
  7. 虚拟解剖
    1. 使用商业软件分析CT扫描图像，生成虚拟解剖图像。
      注意：虚拟解剖是容积渲染技术的一种改进，其重点在于突出显示心腔和血管的管壁18。在此过程中，通过手动设定阈值，可从原始数据集中虚拟去除增强的心腔部分。
    2. 通过虚拟解剖可视化未增强的心壁、室间隔和瓣膜，生成与大体解剖相似的图像。与心脏标本的大体解剖不同，虚拟解剖中的切割平面几乎不受限制，可根据需要重建几乎任何视角以观察目标结构。
  8. 3D打印
    1. 在3D打印机软件中打开心脏样本的兼容文件。
    2. 在3D打印机中设置打印参数，选择0.10 mm Fast DETAIL配置，并将打印速度降低至20 mm/s。启用生成支撑材料选项。
    3. 在3D打印机中，为"耗材设置"选择TPU耗材配置文件。
    4. 在打印机中，为"打印机设置"选择Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4喷嘴配置文件。
    5. 切片完成后，将BGCODE文件保存至U盘，用于3D打印。
    6. 使用1.75 mm TPU耗材打印人类心脏样本。打印前，使用 耗材干燥器对TPU耗材干燥6小时。
    7. 为减少3D打印过程中的耗材张力，将耗材线轴放置在带内置轴承的线轴架上，以促进线轴顺畅旋转。使用配备纹理粉末涂层钢制平台的商用3D打印机进行打印。
    8. 3D打印完成后，小心移除支撑材料。

结果

微尺度检测
应用组织透明化技术可利用共聚焦显微镜对较大体积的组织进行三维成像。在心脏中，可观察到包含心肌神经元的神经节以及心肌支配的神经分布模式（图2）。图3展示了对人左心室心肌组织进行神经和血管平滑肌细胞免疫染色后的共聚焦显微图像。可见血管贯穿心肌组织，同时可识别出大量神经纤维，这些神经纤维既与血管相关联，也独立于血管分布。

中观与宏观尺度检测
当使用无水乙醇进行24小时加压灌注和固定时，样品的天然颜色会被漂白，组织发生脱水25，且弹性显著降低。而使用PFA和福尔马林固定后，样品的天然颜色和弹性则得到显著保留。因此，PFA或福尔马林主要被用作首选固定剂。

图6展示了大体解剖、虚拟解剖、STL多边形模型以及三维打印的代表性图像。图7展示了由大体解剖和虚拟解剖图像生成的立体对像（anaglyph）的代表性图像，佩戴立体眼镜后可获得深度感知。通过商用软件，可从几乎所有方向观察所获取的单一摄影测量模型，并展示与常规经导管心脏手术相关的复杂解剖特征。将这些技术应用于经压力灌注和固定处理的心脏样本后，心脏的三维信息可被近乎永久地以数字或物理形式保存，并实现无边界共享。图8展示了从因不适合移植而被弃用的心脏样本中复制出的50%比例三维打印模型。

组织成像与解剖流程；显微镜、CT扫描、摄影测量、3D打印分析。
图1：实验方案流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。

心脏组织分析：A. 心脏解剖结构；B. 透明化处理前/后的组织切片；C. 神经元染色。
图2：人右心房组织透明化切片。（A）人右心房的右后斜视图，显示已分离出右心房神经节丛（RAGP）用于组织透明化处理。（B）RAGP样本在透明化处理前与处理后的状态。（C）经iDISCO+法透明化的人RAGP部分的最大强度投影图像，显示用泛神经元标记物蛋白基因产物9.5（PGP9.5）免疫染色的神经节（箭头所示）。标尺分别为1 cm（A）、5 mm（B）和500 µm（C）。本图改编自Hanna等人的研究11。请点击此处查看该图的放大版本。

显示组织中PGP9.5和αSMA绿色与红色表达的共聚焦显微镜图像。
图3：人心脏左心室的免疫染色切片。 人心脏左心室心肌切片经泛神经元标志物蛋白基因产物9.5（PGP9.5）和平滑肌细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）免疫染色后的共聚焦图像。使用488 nm激光线可观察到肌肉的自发荧光（绿色）。比例尺为50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

小型动物PET扫描仪设置与界面；正在进行的成像会话及扫描结果显示。
图4：心脏样本的显微计算机断层扫描成像。 （A）用于心脏样本成像的显微计算机断层扫描系统设置。（B）显微计算机断层扫描成像的用户界面。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于产品成像的摄影设置，包括三脚架上的相机、照明和背景布。
图 5：加州大学洛杉矶分校心脏心律失常中心的摄影工作室环境。请点击此处查看此图的放大版本。

椎骨的三维重建；容积渲染分析；解剖建模研究。
图6：主动脉瓣和二尖瓣复合体的大体解剖（左上）、虚拟解剖（右上）、STL多边形模型（左下）以及三维打印（右下）图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

三维渲染解剖结构、立体成像、可视化技术、教学示意图。
图7：主动脉瓣和二尖瓣复合体的大体解剖（左）与虚拟解剖（右）的立体成像图。 需佩戴红/青色立体眼镜以获得深度感知。 请点击此处查看该图的放大版本。

3D打印过程、3D打印机设置、打印的解剖模型、增材制造结果。
图8：心脏样本的三维打印。（A）使用热塑性聚氨酯（TPU）丝材进行心脏样本三维打印的三维（3D）打印机设置。（B）本研究所述方法制备的代表性心脏三维打印样品。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究展示了分析来自完整人类心脏样本的全面流程。 代表性结果呈现了针对单个心脏常规开展的从微观到宏观尺度的解剖学检查。 由于人类心脏样本极为珍贵，采用多尺度研究方法最为理想且高效，可通过多种协议实现不同目的，充分利用样本的各个部分，避免浪费，包括推动科学研究发现、改进临床操作流程，以及在保持完整心脏解剖关联性的基础上开展解剖学教学。  

在微尺度观察方面，免疫染色与显微镜技术可用于研究人类心脏标本的细胞结构。本文展示了组织透明化与免疫组织化学技术在细胞水平上研究心脏神经解剖学的应用。这些技术有助于表征心脏神经系统及心肌神经支配模式，并关联特定结构（如心脏传导系统和心腔）进行分析。尽管共聚焦显微镜可实现优异的空间分辨率，但尤其对于透明化组织样本而言，成像过程耗时较长。光片显微镜则可用于缩短图像采集时间，但会牺牲部分空间分辨率。

关于中观到宏观尺度的检测，作者所在机构的显微CT扫描仪空间分辨率范围为10–200 µm。对于10 µm的扫描，样本尺寸限制在20 mm以内；对于100–200 µm的扫描，样本尺寸限制在120 mm以内。作者所在机构的显微CT扫描仪无法容纳完整的心脏。因此，在该机构进行全心脏扫描需使用临床CT扫描仪，其空间分辨率为600 µm，尽管技术进步已使得能够成像完整心脏的显微CT扫描仪得以开发2。诸如光子计数CT之类的技术发展必将进一步拓展成像可能性。提高STL文件的空间分辨率应是进一步提升3D打印质量的首要步骤。3D打印较高的成本限制了该技术在常规临床实践中的应用。通过任何智能手机应用程序生成的摄影测量图像易于获取且质量可接受，但若需提高分辨率，则需进一步采用更复杂、昂贵且耗时的系统26。为了实现3D可视化，专用头戴设备的扩展现实技术27,28和全息显示器29是额外可用的工具，但同样受限于较高的成本。

总之，通过 在微观和宏观尺度上进行全面的结构分析，可以结合整个心脏的背景来理解每个结构的微解剖学特征及其功能作用。随着高分辨率成像技术的发展，微观解剖学与宏观解剖学之间的差距正在显著扩大。从事心肌细胞电子显微镜分析的专家可能并不熟悉二尖瓣叶的数量 反之亦然为了全面理解心脏形态，科学家必须在持续探索每棵树的更多细节的同时，保持对整片森林的宏观把握。

致谢

我们感谢为教育和科研事业捐献遗体的各位人士。我们感谢OneLegacy基金会，该基金会为获取用于研究的供体心脏奠定了基础。我们还感谢加州大学洛杉矶分校转化研究影像中心（放射科）的Anthony A. Smithson和Arvin Roque-Verdeflor在CT数据采集方面提供的支持。本项目得到了加州大学洛杉矶分校Amara Yad项目的资助。我们感谢Kalyanam Shivkumar博士和Olujimi A. Ajijola博士建立并维护了用于研究的人类心脏研究流程。我们感谢我们的研究运营经理Amiksha S. Gandhi为支持我们的项目所付出的奉献。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金OT2OD023848 ＆ P01 HL164311、Leducq基金会基金23CVD04（授予Kalyanam Shivkumar）、美国心脏协会职业发展奖23CDA1039446（授予PH）以及加州大学洛杉矶分校Amara-Yad项目（https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project）的支持。本研究所使用的GNEXT microPET/CT扫描仪由美国国立卫生研究院动物研究共享仪器基金（1 S10 OD026917-01A1）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1×磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP3813
3D 查看器微软
647 AffiniPure 驴抗兔 IgG杰克逊免疫研究实验室711-605-152
647 AffiniPure 驴抗羊 IgG杰克逊免疫研究实验室713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED 镜头尼康
抗肌动蛋白， α-平滑肌 - Cy3抗体Sigma-AldrichC6198
抗原修复缓冲液（100倍浓缩 EDTA 缓冲液，pH 8.0）Abcamab93680
抗PGP9.5（蛋白基因产物9.5）Abcamab108986
抗-TH（酪氨酸羟化酶）Abcamab1542
抗VAChT（囊泡乙酰胆碱转运体）Synaptic Systems139 103
苄基醚Sigma-Aldrich108014
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA4503-10G
Cheetah 3D 打印机线材（95A），1.75 mmNinjaTek
盖玻片，22 mm × 30 mm，1.5号VWR48393 151
Cy3 AffiniPure 驴抗兔IgG杰克逊免疫研究实验室711-165-152
二氯甲烷Sigma-Aldrich270997-100ML
二甲基亚砜Sigma-AldrichD8418-500ML
乙醇，100%Decon 实验室2701
甘氨酸Sigma-AldrichG7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences
猪肠黏膜来源肝素钠盐Sigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
过氧化氢溶液Sigma-AldrichH1009-500ML
成像软件ZeissZEN（黑版）
成像软件Oxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3毫米
KIRI EngineKIRI 创新
激光扫描共聚焦显微镜ZeissLSM 880
LEAD-2 - 垂直位 &和多通道蠕动泵较长的
Lightview XL Brightech
甲醇（符合美国化学学会标准）Fischer ScientificA412-4
Nikon D850尼康
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
正常驴血清杰克逊免疫研究实验室017-000-121
Original Prusa MK4 3D 打印机Prusa Research
PAP笔Abcamab2601
32% 多聚甲醛电子显微镜科学公司15714-S
PolycamPolycam
一抗
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic
二抗
SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenS36936
叠氮化钠，5%（w/v）Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definition AS西门子医疗
标准视野外科手术望远镜 视觉设计
体视显微镜系统 SZ61OLYMPUS
StereoPhoto Maker由Masuji Suto开发的免费软件
Superfrost Plus 显微镜载玻片，预清洁Fisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
二甲苯Sigma-Aldrich534056-4L
Ziostation2Ziosoft, AMIN

参考文献

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