研究吸入性环境污染物对小鼠嗅觉功能的影响

摘要

本文详细描述了埋藏食物测试和社会气味辨别实验，以评估吸入性环境污染物暴露对小鼠嗅觉功能的影响。

摘要

嗅觉功能障碍是一个重要的公共卫生问题，且可独立预测神经退行性疾病的风险。吸入性环境污染物暴露可能损害嗅觉功能，因此迫切需要建立评估吸入性环境污染物暴露对嗅觉影响的方法。由于小鼠具有高度发达的嗅觉系统和典型的行为特征，是进行嗅觉实验的理想模型。为评估吸入性环境污染物暴露对小鼠嗅觉功能的影响，本文提供了详细的埋藏食物测试和社会气味辨别实验方法，包括实验准备、实验装置的选择与构建、测试流程以及时间指标。同时，讨论了计时设备、操作细节和实验环境，以确保实验的成功实施。实验中采用硫酸锌处理以验证该方法的可行性。本方案为评估吸入性环境污染物对小鼠嗅觉功能的影响提供了简单且清晰的操作流程。

引言

嗅觉功能障碍已成为一个显著的公共卫生问题，且独立地与神经退行性疾病风险增加相关。该状况可能对整体健康产生不利影响，促进抑郁症状的发生，并导致生活质量下降。其影响突出表现为对食物感知的改变、社交沟通受阻以及负面情绪增强¹。多种因素被认为可导致人类嗅觉功能障碍，包括鼻窦疾病、上呼吸道感染和创伤性脑损伤²。值得注意的是，可吸入环境污染物（如PM2.5）估计有2%至16%通过吸入空气进入体内，穿过鼻腔并到达特定的嗅觉专一区域并在此沉积^3,4,5,6,7。最新研究发现，包括PM2.5和氨在内的可吸入环境污染物确实可能损害嗅觉感觉神经元^8,9,10。然而，仍需进一步验证此类损伤是否直接导致嗅觉功能障碍。因此，对可吸入环境污染物对嗅觉功能影响的细致评估具有重要意义。

目前，许多研究实验室采用小鼠作为行为实验的替代脊椎动物模型，以理解嗅觉功能的变化^11,12,13,14。小鼠被选为研究脊椎动物化学通讯的首选模型系统，其具有显著的嗅觉敏感性，对觅食和社会交流至关重要¹⁵。此外，不断发展的用于观察和干预小鼠行为的工具，使该物种在嗅觉功能研究中具有极高的吸引力¹⁶。

在本研究中，我们采用埋藏食物试验和社会性气味辨别实验，评估暴露于可吸入环境污染物的小鼠模型中的嗅觉功能障碍。为了提高评估的精确性，我们选择了最具代表性的方法来评价嗅觉功能。我们对该方法进行了系统性优化，以确保其操作简便、步骤清晰，从而能够有效检测可吸入环境污染物所诱导的嗅觉功能障碍程度。

方案

所有行为学实验均使用雄性 C57BL/6J 小鼠（年龄：6–8 周；体重：20–22 g）。小鼠饲养于稳定环境条件下（即温度 23 ± 1 °C，湿度 55% ± 5%，光照-黑暗周期为 12/12 小时，光照开启时间为 7:00）。所有行为学实验均在 10:00 至 17:00 之间进行。所有动物实验均经青岛大学动物实验专业委员会伦理委员会批准。在经过 1 周的适应期后，所有小鼠均暴露于可吸入环境污染物中。

1. 污染物暴露

1. 通过滴注进行鼻内给药
   1. 将可吸入环境污染物溶解于0.9%生理盐水中。使用一次5%硫酸锌溶液，该浓度已被证明可导致嗅觉功能障碍¹⁷。对于对照组小鼠，给予0.9%生理盐水溶液。
   2. 通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（57 mg/kg）麻醉小鼠¹⁸，并通过脚趾夹捏反射评估麻醉深度。在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。将小鼠仰卧置于倾斜表面，头部朝下。
   3. 使用移液枪向小鼠一侧鼻孔给予10 µL溶液。 将移液枪尖悬于小鼠鼻部上方，使液体滴落在鼻部表面， 让小鼠自然将溶液吸入鼻腔。
   4. 为确保小鼠的健康并防止可能的不适，在间隔10分钟后对另一侧鼻孔重复上述吸入操作。
   5. 在小鼠鼻内滴注给药后第3天，进行埋藏食物测试。

2. 埋藏食物测试

1. 实验前 18–24 小时进行禁食处理，将小鼠饲养笼中所有饲料颗粒完全移除，并更换垫料。不要移除饮水瓶。
2. 按以下步骤准备操作台：
   1. 在测试开始前 1 小时，将装有小鼠的笼子转移至操作室，使其静置适应环境。
   2. 在此期间准备操作室。使用透明聚氯乙烯（PVC）标准小鼠笼并标记为 A，以提供熟悉环境；使用另一透明 PVC 标准松鼠笼并标记为 B 作为测试笼；将实验后用于放置小鼠的共用笼标记为 C。
   3. 在 A 和 B 笼中均铺入 3 cm 厚的垫料，并用尺子测量确认。将笼子并排摆放，两笼之间相距 0.5 m（图 1）。
   4. 以笼子中心为圆心，划定半径为 2 m 的区域作为实验区；将 2 m 范围以外的区域定义为观察区。
   5. 将笼子 C 及未测试小鼠的笼子尽可能远离实验区放置。
3. 按以下步骤记录寻找食物的时间：
   1. 在笼 B 中随机选择一个位置，将食物埋入垫料表面以下 1 cm 处，并抚平垫料表面。
   2. 将小鼠放入笼 A 中适应 4 分钟。计时结束后，将小鼠转移至笼 B，立即启动视频记录设备，随后返回观察区。
   3. 当小鼠用前爪抓起食物块时，停止视频记录。在某些情况下，小鼠可能低头进食而未用前爪抓握食物，此行为同样视为试验成功。
   4. 记录数据。记录每只小鼠从接触笼 B 底部垫料至发现食物的时间。若小鼠在 4 分钟内未找到食物，则记录其发现时间为 240 秒的延迟时间。
   5. 测试结束后，将小鼠放入笼 C。
   6. 从笼 B 中取出剩余饲料并装入密封袋中。更换笼 B 中的垫料，并重新放入饲料，准备测试下一只小鼠，具体操作如下：
      1. 对于同笼饲养的小鼠，使用同一份垫料进行测试；对于不同笼饲养的小鼠，需先用酒精清洁笼子，再更换新的垫料。
   7. 实验结束后为小鼠补充饲料和饮水。于 1 天后进行社交气味辨别实验。
      注意：整个过程中需佩戴口罩，每只小鼠实验结束后应更换透明手套，以最大程度避免气味交叉。操作动作幅度应尽量小，以减少小鼠应激反应。

3. 社会性气味辨别实验

1. 尿液采集
   1. 分别采集性成熟雄性小鼠和雌性小鼠的尿液，并以相等体积分装至离心管中¹⁹。每管加入300 µL尿液，分装于2 mL微量离心管中。
   2. 将样品储存于-80 °C直至使用。使用前解冻后轻轻振荡混匀。避免反复冻融样品。
2. 按以下方式准备操作台。
   1. 在实验开始前1小时，将饲养小鼠的笼子移至操作室静置休息。使尿液 样品恢复至室温。
   2. 在此期间，按照步骤2.2.2–2.2.5所述布置操作室。
3. 按以下方式记录寻找尿液的时间。
   1. 用胶带在笼子B的两个宽边外侧各制作一个凹槽，大小足以固定装有300 µL雄性或雌性尿液的微量离心管。将离心管放入凹槽中，并暂时保持两个管盖关闭。
   2. 将小鼠放入笼子A中，并启动4分钟倒计时。倒计时结束时打开笼子B中的两个离心管。
   3. 将小鼠转移至笼子B的中央位置，使其距离两个离心管的距离相等，随后开启视频记录设备，并轻缓缓慢地退至观察区域。
   4. 当小鼠嗅探离心管壁/管口甚至管内时，视为成功嗅闻该管。此时按下秒表，记录时间为嗅探该管的时间（M s），然后继续记录停留时间（X s），直至小鼠离开该管。
   5. 继续计时并观察小鼠对另一管的嗅探行为。当小鼠嗅探另一管的管壁/管口甚至管内时，视为成功嗅闻。按下秒表，记录嗅探另一管所需时间（N s），然后继续记录停留时间（Y s），直至小鼠离开该管。
   6. 实验结束后，将小鼠转移至笼子C中。
   7. 每次小鼠测试后更换笼子B中的尿液管和垫料。按性别将使用过的尿液收集至洁净袋中。
   8. 更换手套，按上述步骤测试下一只小鼠。
4. 实验应在无特殊气味（如强烈香味或食物气味）的实验室中进行；如有此类气味，需在实验前彻底通风。避免使用具有强烈气味的个人用品。整个操作过程中应佩戴手套和口罩，尽可能防止气味交叉。动作幅度应尽量小，以避免引起小鼠应激反应。

结果

可吸入环境污染物会损害小鼠的嗅觉功能。来自焚烧炉和机动车排放的大气锌已被证实是一种可吸入污染物，可导致过敏性肺部炎症²⁰。硫酸锌被认为是导致嗅觉功能障碍的典型化合物之一²¹。因此，我们采用硫酸锌通过鼻腔滴注的方式处理小鼠，并利用埋藏食物试验和社会气味辨别实验进行检测。在埋藏食物试验中，经硫酸锌暴露的小鼠找到食物所需时间超过240秒，而对照组小鼠则用时更短（图2）。正常嗅觉功能的禁食小鼠通常可在1分钟内找到埋藏的食物。当小鼠出现嗅觉功能障碍时，其寻找食物的时间延长，甚至无法找到食物。与对照组相比，暴露组小鼠寻找食物所需时间更长，部分个体在240秒内未能找到食物，表明其嗅觉功能已受到损伤。

在社交气味辨别实验中也观察到了类似的结果。在暴露于硫酸锌的小鼠中，在设定的观察时间内，无论是雄性还是雌性尿液均未被嗅闻（图3A）。超过设定时间后，暴露组小鼠仅短暂地嗅闻了雌性和雄性尿液，但其嗅闻时间显著短于对照组小鼠（图3B）。当同时呈现等体积的雌性和雄性尿液时，雄性小鼠通常更偏好雌性尿液²²。暴露组小鼠需要更长时间才能区分雌性和雄性尿液，甚至无法完成区分。具体而言，与对照组相比，暴露组小鼠花费更长时间嗅闻尿液，而在尿液周围停留的时间则更短。

图1：实验台布局。 笼具A与笼具B之间的距离保持为0.5 m。通过手机支架将视频录制设备固定在笼具B上方，并调整摄像视野以记录笼内环境。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：埋藏食物实验结果。 对照组小鼠与暴露于硫酸锌的小鼠在觅食行为上的统计分析。对照组小鼠在30秒内找到食物，而暴露于硫酸锌的小鼠找到食物的时间超过240秒，该时间被计为240秒。采用独立样本t检验比较两组之间的差异。数据以均值±标准差表示（每组n = 3只小鼠）；** p < 0.01。若任何动物在240秒后仍未找到食物，则记录其觅食时间为240秒，所有处理组动物均属此情况。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：社会性气味辨别实验。（A）对照组小鼠与暴露于硫酸锌后寻找尿液的小鼠的统计学分析。对照组小鼠在30秒内找到尿液，而暴露于硫酸锌的小鼠寻找雌性或雄性尿液的时间均超过240秒，统一记为240秒。若任何动物在240秒后仍未找到尿液瓶，则记录其找瓶时间为240秒，所有处理组动物均如此记录。（B）对对照组小鼠与暴露于硫酸锌的小鼠接触尿液的停留时间进行统计学分析。采用独立样本t检验比较两组之间的差异。数据以均值±标准差表示（每组n = 3只小鼠）；** p < 0.01，* p < 0.5。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了两种用于快速评估小鼠嗅觉功能障碍的基本实验方案。不同的可吸入环境污染物会导致小鼠出现不同程度的嗅觉功能障碍。埋藏食物实验用于评估小鼠对挥发性气味的探测能力，而社会性气味辨别实验则用于评价动物识别和区分不同社会性气味的能力。本实验方案旨在评估环境污染物对嗅觉功能的毒性作用。

吸入的环境污染物（包括臭氧、氨和柴油机尾气）具有气味，可能影响小鼠在样品嗅探过程中的嗅觉感知^23,24。需要注意的是，在暴露结束后立即对小鼠进行行为学实验，可能会导致假阴性结果²²。为解决这一问题，我们采取了措施以提高实验的可靠性。具体而言，在暴露期结束后，对笼具进行了彻底清洁，并更换了垫料。随后，在暴露后24小时的时间间隔进行行为学实验²²。这一操作调整旨在确保获得准确且有意义的实验结果。

在食物掩埋实验中，一个关键参数是小鼠找到隐藏食物所需的时间。值得注意的是，处于应激状态的小鼠在测试过程中往往表现出活动性增强和注意力下降，这可能导致假阳性结果^25,26,27,28。因此，必须确保小鼠在测试期间保持安静，不受过度应激的影响。为避免任何潜在干扰，小鼠在实验开始前1小时即从饲养环境转移至测试区域，以便其适应新环境并降低应激水平。为准确记录时间，当小鼠被放入实验笼B时即启动录像设备，随后观察者立即退至观察区。观察者与笼子保持2米的适当距离，以确保清晰观察又不造成干扰。判断成功发现食物的标准包括小鼠使用前爪或低头靠近食物的行为，这两种行为均被视为找到食物的标志，符合广泛接受的标准¹⁹。当同一剂量组内有多只小鼠需要测试时，确保它们在测试后不立即返回原饲养笼，而是暂时安置于普通笼C中，待同笼所有小鼠完成测试后，再统一送回原饲养环境。鉴于测试用食物可能存在气味残留，需提前将其储存于密封袋中，并在使用后重新密封或放入密闭容器中保存。采取这些措施旨在维持实验条件的完整性，确保结果的可靠性。

在社会性气味辨别实验中，必须使用来自性成熟小鼠的尿液样本¹⁹。性成熟的判断依据是小鼠的年龄，而这一参数因小鼠品系不同而有所差异。采集后，建议将雄性和雌性尿液分别储存在-80 °C的冰箱中。以往的研究采用秒表进行计时，但这种方法存在局限性，例如观察者距离实验笼具较远，可能导致观察不清晰和计时不准确^19,22,29。为解决这些问题，我们改进了计时流程，采用视频设备替代秒表。这一改进不仅有助于获取更精确的数据，还能实现对多个实验组数据的同步采集。

在这些实验中，使用视频设备记录小鼠的行为，其优点是能够降低视频的帧率，使观察者更准确地记录小鼠各种行为活动的时间，弥补了观察者无法在观察区域内实时观察小鼠行为的不足。然而，使用视频记录设备的缺点是会增加分析时间。实验结束后，我们需要重新观看视频，以记录每只小鼠各种行为活动的时间。当小鼠数量较多时，必须对每只小鼠的视频进行分析，这将增加实验室的工作负担。

研究结果表明，多种可吸入环境污染物可能对嗅觉功能产生负面影响。本文介绍了一种快速、简便且相对精确的评估可吸入环境污染物相关嗅觉毒性的方法。该方法对于开展针对环境污染物所致人类嗅觉功能障碍的风险评估至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5-10 μL  可调移液器	Eppendorf, Germany	3123000225	鼻内滴注
0.9% 生理盐水溶液	Solarbio	7647-14-5	溶解污染物
无水硫酸锌	Macklin	7733-02-0	暴露小鼠
离心管（2 mL）	Biosharp Incorporated	BS-20-M	盛放尿液
电子天平	常州奥豪斯公司	EX125DZH	称量麻醉剂和污染物
GraphPad Prism	GraphPad Software	8.0.1	统计分析
手持式粉尘检测仪	TSI Incorporated	DuatTrak 8532	吸入暴露小鼠
视频记录设备	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	记录小鼠活动时间
涡旋混合器	海门麒麟-贝尔实验室仪器有限公司	Vortex-5	混合溶液