小鼠腰交感神经切除术

摘要

本文提供了一种从小鼠体内手术切除腹后神经节腰段交感神经元的实验方案。该操作将有助于开展多种研究，以探究交感神经支配在远端组织靶标中的作用。

摘要

周围神经损伤十分常见，但损伤后仅有10%的患者能够实现完全的功能恢复。交感神经系统在维持机体稳态中发挥着多种关键作用，然而其在周围神经损伤背景下的研究却十分有限。目前，关于节后交感神经元在外周远端靶器官中功能范围尚不明确。为了更深入地探究交感神经对周围靶组织的支配作用，可采用外科手术建立"敲除"模型作为替代方法。尽管可通过化学手段实现该模型，但化学破坏节后交感神经元可能缺乏特异性且具有剂量依赖性。在小动物中曾被认为"几乎不可行"的小鼠腰交感神经节切除术，现可特异性地靶向支配后肢的节后交感神经元。本文详细描述了如何通过存活手术方式，外科切除小鼠L2-L5腰交感神经节，该方法可稳定地降低后肢足垫的出汗反应以及坐骨神经中交感神经轴突的数量。

引言

周围神经损伤（PNI）可导致远端靶组织出现运动、感觉和交感功能障碍，且这些功能很少能完全恢复¹。PNI 的研究通常集中于 运动和感觉神经的再生；然而，大鼠坐骨神经中近四分之一的纤维为无髓鞘的交感轴突²。 尽管如此，交感神经支配在外周组织中的作用尚未完全阐明³。交感神经系统在维持机体稳态中起着重要作用，参与免疫调节、体温调节、血管张力、线粒体生物发生等多种生理过程^{4,5,6,7,8,9,10,11}。当神经肌肉接头处的交感神经支配丧失后，即使运动神经元的支配得以保留，仍可观察到持续的肌无力和突触不稳定性¹²。已有研究表明，交感神经对神经肌肉接头处突触传递的调控作用会随年龄增长而下降

方案

所有实验均经埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（IACUC方案编号PROTO202100177）。本研究使用了四只14周龄、体重在16–21 g之间的成年雌性野生型C57BL/6J小鼠。本实验所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.

1. 术前准备

1. 将手术器械进行高压灭菌：锋利剪刀1把，精细镊子2把，持针器1把。
2. 将加热垫预热至37 °C，并放置于手术台面下方。
3. 用消毒剂喷洒手术区域，包括麻醉诱导舱，并用纸巾彻底擦拭干净。
4. 洗手并穿戴适合小鼠操作的个人防护装备。
5. 以5 mg/kg体重剂量经口给予美洛昔康，每次一滴，待小鼠完全吞咽后再给予下一滴。给予足够时间确保动物完全吞咽药物，以避免诱导过程中发生误吸。
6. 使用3%异氟烷（氧气流速1 L/min）对小鼠进行麻醉诱导（遵循机构批准的实验方案）。
7. 当小鼠已进入麻醉状态（脚趾夹捏无反应）后，将其仰卧位放置于手术台面上，鼻部置于合适的鼻罩中。
8. 确认小鼠鼻罩佩戴合适后，将异氟烷浓度调整为2%，以维持麻醉状态。
9. 在小鼠眼部涂抹眼用润滑剂，以防止角结膜干燥症（干眼症）。
10. 使用手术胶带将小鼠稳妥固定于手术台面上。
11. 持续监测呼吸是否平稳及呼吸频....

结果

本方案描述了从小鼠体内手术切除腰交感神经节后神经元的方法。两只小鼠接受了腰交感神经切除术，另两只小鼠作为对照组。为成功实施腰交感神经切除术，必须充分暴露至少双侧L2和L3腰交感神经节，如图1所示。切除L4和L5神经节可实现下肢的完全交感去神经支配；然而，较低位的神经节可能被泌尿生殖器官遮挡而难以观察。既往逆行示踪研究表明，L2-L5神经节中的大部分神经元集中于L2和L3神经节。尽管代表性结果仅使用了年龄匹配的雌性小鼠获得，但该手术已在雄性和雌性小鼠中多次重复实施，且在睾丸动脉或卵巢动脉以及交感神经节的位置方面未观察到显著的解剖学差异。

去除神经节后，汗腺对匹鲁卡品的反应迅速减弱，术后第7天即可观察到显著差异（图2）。选择术后第7天是因为在大鼠多种坐骨神经损伤后，交感介导的出汗活动在7天内呈指数级下降³⁴。由于轴突变性可能需要长达14天才能完成，且术中可能难以清晰辨认L4和L5神经节（膀胱和生殖器官可能遮挡视野），因此.......

讨论

腰交感神经节是非常微小的结构，位于许多重要的腹腔器官和大血管后方。因此，该操作需要极高的精确度和准确性。大部分难点在于术中识别交感神经节。建议学习者在对活体小鼠进行该操作之前，先能够在小鼠尸体上识别出神经节。在移开肠道后识别交感神经节时，常常需要进行问题排查。为确保充分的视野暴露，必须能够看到降结肠。将肠道移出腹腔时，必须包括盲肠。此外，膀胱可能充盈并肿大，这会遮挡降结肠的视野，进而影响腹主动脉和下腔静脉的观察。理想情况下，应在小鼠麻醉后、做皮肤切口前，手动排空膀胱。然而，如果未排空膀胱且术中视野受阻，可使用两根无菌棉签轻轻挤压排空。操作时需注意避免损伤连接在膀胱后壁的输尿管。一旦在降结肠后方识别出腹主动脉和下腔静脉，充分牵拉并稳定这些血管对于观察交感神经节至关重要。筋膜相对坚韧，若缝线仅穿过筋膜层及神经连接而未穿透血管壁，则应将血管至少从正中线向外牵拉1 mm。覆盖在交感神经节上方的筋膜可用镊子轻轻剥离。若术中发生小血管破裂，应在关闭腹腔前用无菌棉签压迫至少10秒，以确保充分止血。如果手术过程中刺破了大的腹腔血管，应立即对小鼠实施安乐死。

尽管该方法能够直接观察并切除交感神经节，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-0 可吸收缝线	CP Medical	421A
5-0 尼龙缝线	Med-Vet International	MV-661
70% 乙醇	Sigma-Aldrich	E7023-4L
麻醉诱导室	Kent Scientific VetFlo	VetFlo-0530XS
麻醉蒸发器	Kent Scientific VetFlo	13-005-202
聚维酮碘	HealthyPets	BET16OZ
C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratory	#000664
鸡抗神经丝重链抗体	Abcam	ab72996
冷冻切片机	Leica	CM1850
数据分析软件	Prism
尖头镊子	World Precision Instruments	500233
荧光显微镜	Nikon	Ti-E
山羊抗鸡 IgG 488	Invitrogen	A32931
山羊抗兔 IgG 647	Invitrogen	A21245
加热垫	Braintree Scientific	39DP
图像分析软件	Fiji
成像软件	Nikon	NIS-Elements
异氟烷	Med-Vet International	RXISO-250
美洛昔康	Med-Vet International	RXMELOXIDYL32
持针器	Roboz Surgical Store	RS-7894
正常山羊血清	Abcam	ab7481
眼科软膏	Refresh	Refresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato 突变小鼠	Jackson Laboratory	#016223, #007914
盐酸毛果芸香碱	Sigma-Aldrich	P6503
兔抗酪氨酸羟化酶抗体	Abcam	ab112
小型直剪刀	Fine Science Tools	14084-09
无菌棉签 2x2	Dynarex	3252
无菌棉签棒	Dynarex	4301
无菌手术单	Med-Vet International	DR4042
无菌生理盐水溶液	Med-Vet International	1070988-BX
ThCre:mTmG 突变小鼠	突变小鼠资源与研究中心	品系 #017262-UCD	Jackson Laboratory, 品系 #007576
ThCre:tdTomato 突变小鼠	欧洲小鼠突变库	品系 #00254	Jackson Laboratory, 品系 #007914