通过调节母体膳食叶酸或胆碱水平研究其缺乏对子代健康结局的影响

摘要

本方案描述了在雌性小鼠妊娠前减少其叶酸或胆碱膳食摄入的方法，旨在研究母体饮食对子代健康结局的影响。

摘要

妊娠期和哺乳期的母体营养在子代神经发育过程中起着重要作用。一碳（1C）代谢以叶酸和胆碱以及其它B族维生素为核心，在胚胎神经管闭合过程中发挥关键作用。然而，母体在妊娠期间这些营养素缺乏对子代出生后健康结局的影响仍相对不明确。此外，母体饮食中缺乏叶酸或胆碱可能影响子代的其他健康结局，因此这一模型具有重要研究价值。本实验方案旨在概述通过饮食干预在雌性小鼠中诱导一碳代谢缺乏的操作流程。雌性小鼠自断乳起（约2月龄前）开始接受特定饮食，持续4至6周直至交配，并在整个妊娠期和哺乳期维持该饮食。可对这些雌鼠所产子代进行多种健康结局的评估。雌鼠可多次用于繁殖以产生子代，同时可采集其组织样本用于一碳代谢物的测定。本方案提供了通过诱导母体叶酸或胆碱饮食缺乏以研究子代健康结局的总体方法。

引言

妊娠期和哺乳期的母体营养在子代发育过程中起着至关重要的作用。一碳（1C）代谢是一个关键的代谢网络，可将营养信号与生物合成、氧化还原稳态以及表观遗传调控整合在一起。叶酸和胆碱是一碳代谢的核心组分，在神经管闭合过程中发挥重要作用。目前普遍建议育龄女性在生育期补充叶酸和胆碱¹。尽管叶酸在胎儿发育中的关键作用已明确，但其背后的分子机制仍不清晰。由于神经管闭合发生在妊娠第一孕期，因此建议育龄女性在怀孕前即开始摄入叶酸²。妊娠期母亲若缺乏叶酸或一碳代谢中的其他组分（如胆碱），其子代发生神经管缺陷的概率更高，这是因为在妊娠早期对核苷酸合成及其他生物学过程的需求极高³。

母体饮食中一碳代谢相关营养素摄入不足对子代健康结局的长期影响尚不明确。我们实验室及其他研究团队的研究表明，使用临床前模型发现，母体饮食中叶酸或胆碱缺乏确实会影响子代在缺血性脑卒中后的健康结局^4,5,6。临床研究也证实了母体饮食的影响，已有研究报道母体营养状况与子代脑体积减小及甲基化水平改变相关⁷。健康与疾病发育起源（DOHaD）理论认为，慢性疾病的易感性在胎儿期即已被编程in utero^8,9，而母体饮食在其中发挥着重要作用。

本实验方案旨在阐述在雌性小鼠怀孕前改变其1C饮食摄入的方法，以研究母体营养对子代健康结局的影响。

方案

本方案已获中西部大学机构动物照护与使用委员会批准，并按照其指南使用所有实验动物（方案编号 2983）。本研究使用 2 月龄雌性 C57BL/6J 小鼠（体重约 20 g）。通常情况下，可使用处于生殖年龄的雌性小鼠。¹⁰为避免窝别效应，每种饮食需使用多只雌性动物¹¹. 本研究中所用试剂和设备的详细信息列于 材料表.

1. 实验准备

1. 从商业啮齿类动物饲料生产商处获取叶酸或胆碱缺乏的饲料。有关缺乏饲料中所需的微量和宏量营养素（包括叶酸或胆碱确切含量）的详细列表，请参见表1。
   注意：需同时订购相应的对照饲料；详细信息列于表1。这些饲料基于AIN93G配方，含有啮齿类动物推荐的营养成分¹⁰。
2. 与生产商合作确定饲料的颜色，因为这有助于在实验研究期间正确分配饲料。本研究使用绿色表示叶酸缺乏饲料，黄色表示胆碱缺乏饲料，白色表示对照饲料。这些颜色均易于区分。
   注意：不限制饮水量。饮水中不含任何叶酸、胆碱或其他一碳代谢物。

2. 诱导叶酸或胆碱饮食缺乏

1. 在将雌性小鼠分组进行饮食干预之前，称量所有动物的体重。该数值将作为基线体重。
2. 根据各实验室具体的笼具配置（通风或非通风型，参见材料表），每周数次更换或补充每只笼子中的特殊饲料颗粒。切勿过度填充笼内食槽中的特殊饲料，因为饲料一旦与动物唾液接触后可能变质，长时间放置会导致饲料质量下降。
   注意：确保饲料库存按照生产商的指导条件储存，并在有效期内使用。
3. 在交配前，让雌性小鼠持续摄入指定饮食4至6周。
4. 将雄性小鼠引入雌性小鼠的笼中以进行交配。确保在雌性小鼠已摄入特殊饮食至少4至6周后，再将雄性小鼠放入其笼中。每只雌性笼中放入一只雄性小鼠，持续一至数天。
   注意：在本研究中，雄性小鼠在整个实验期间（约4个月）均与雌性共同饲养，以增加产仔数量，因为小鼠可在分娩后再次交配¹²。年龄超过6个月的雌性小鼠未用于任何实验。
5. 每天检查雌性小鼠是否有交配栓，以确认是否已完成交配。
6. 每周定期收集雌性小鼠的体重数据，以监测其健康状况和妊娠情况。
   注意：雌性小鼠在妊娠期（约21天）和哺乳期（约21天）持续摄入指定饮食是安全的。
7. 当子代断奶后（出生约21天），将其分别置于叶酸和胆碱缺乏饮食以及对照饮食中。具体细节请参见结果部分。
   注意：在研究母体饮食对子代健康影响时，建议子代断奶后采用对照饮食。对照饮食必须含有足够维持生存所需的维生素和营养成分。
8. 在研究结束时（通过测定每周体重以监测摄入叶酸或胆碱缺乏饮食的雌性小鼠整体健康状况），采用过量CO₂（剂量为每分钟10%-30%体积置换，遵循机构批准的实验方案）对母鼠实施安乐死，并采集组织（步骤3）以确认饮食诱导的营养缺乏状态。

3. 一碳代谢及相关代谢物测定的组织采集

注意：处死动物时，必须确保动物对脚趾挤压无反应。确认动物无反应后，方可开始组织解剖。需要解剖的组织应在操作前预先确定^13,14，并准备好所需材料，包括用于储存的离心管、适当的解剖工具以及干冰或液氮。

1. 按照先前发表的方案采集血液和肝脏组织^15,16。
   1. 通过心脏穿刺采集约 500–1000 µL 血液 ，具体步骤如下。详细信息请参见 Parasuraman 等人¹⁷：
      1. 在皮肤和腹壁上做 V 形切口，将腹腔器官移开，然后将针头穿过膈肌插入心脏以采集血液样本。
      2. 将血液样本放入 EDTA 涂层的试管中。试管可在室温下放置，直至所有样本采集完毕。
   2. 将血液样本在 4 °C 条件下以 1000–2000 x g 离心 7 分钟，以分离血浆。收集血浆至 1.5 mL 微量离心管中，随后储存在 -80 °C 直至分析。
   3. 为取出肝脏，打开腹腔，并根据先前发表的方案解剖整个肝脏¹⁵。
      1. 将肝脏从体腔中取出后，用小剪刀将组织切成小块，并使用干冰或液氮进行速冻。
         注：冷冻的组织块可置于 1.5 mL 冻存微量离心管中，在 -80 °C 保存至分析前。

结果

本研究旨在探讨母体饮食中叶酸或胆碱缺乏对子代健康结局的影响。通过测定每周体重，以监测维持在叶酸或胆碱缺乏饮食下的雌性小鼠整体健康状况。在我们之前的研究中，不同母体饮食组之间的体重未观察到变化⁴。图1展示了雌性小鼠在交配前四周内维持在对照、胆碱缺乏或叶酸缺乏饮食下的基线体重和每周体重（F (_1.144,4.577) = 11.96，p = 0.196）。一个普遍的观察结果是，与标准小鼠饲料相比，这些特殊饮食组产生的子代数量有所减少。但该差异尚未达到统计学显著性。

当雌性小鼠摄入缺乏一碳单位（1C）的饮食（如缺乏叶酸或胆碱）时，体内处理一碳单位的组织中代谢物会发生变化。可采用多种技术对一碳单位及相关代谢物进行测定。在本研究中，采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC）进行检测，方法如前所述¹²。本文提供了肝脏（表2）和血浆（表3

讨论

在科研实验室实施本方案时，研究人员在开始实验前需考虑若干重要事项。首先，在饲料制备过程中，需为饲料生产预留充足的准备时间，以确保实验开始前饲料能够到位。不同公司的生产周期各不相同，还需将饲料运输时间纳入考虑。处于繁殖年龄的雌性小鼠（约2-2.5月龄）可在交配前4-6周开始喂饲该饲料^4,6,14。既往研究仅使用了C57Bl/6J小鼠^4,5,6,18，但其他研究团队在类似实验中也使用了BALB/c小鼠^19,20,21。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	Eppendorf
C57BL/6 雌性小鼠	Charles River	27	小鼠也可在实验室内部进行繁育。
胆碱缺乏饮食	Envigo	TD.06119
对照饮食	Envigo	TD.190790
EDTA管
叶酸缺乏饮食	Envigo	TD.01546
GraphPad Prism			https://www.graphpad.com/features
啮齿类动物的饲养环境	Lab Products, LLC	一个带通风系统的笼架 &和笼子
液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）	SCIEX，马萨诸塞州弗雷明汉	5500 QTrap
超高效液相色谱（UPLC）	美国马里兰州哥伦比亚岛津公司	Nexera