LPS和ATP诱导的PMA分化THP-1巨噬细胞死亡及其验证

摘要

该方案基于 LPS 和 ATP 诱导的 PMA 分化 THP-1 巨噬细胞的死亡。我们使用流式细胞术分析膜联蛋白V和7-AAD双染色以检测细胞死亡，使用整个细胞并采用扫描电子显微镜观察细胞膜形态。

摘要

细胞死亡是所有生物体的基本过程。该方案建立了脂多糖 （LPS） 和三磷酸腺苷 （ATP） 诱导的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 （PMA） 分化的人单核细胞 （THP-1） 巨噬细胞中的脂质沉积模型，以观察细胞死亡。LPS联合ATP是一种经典的炎症诱导方法，常用于研究焦亡，但细胞凋亡和坏死性凋亡也对LPS/ATP的刺激有反应。在正常情况下，磷脂酰丝氨酸仅局限于质膜的内小叶中。然而，在细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的早期阶段，细胞膜保持完整并暴露于磷脂酰丝氨酸，而在后期阶段，细胞膜失去其完整性。本文采用流式细胞术分析膜联蛋白V和7-氨基放线菌素D（AAD）双染色，检测全细胞的细胞死亡情况。结果显示，在用LPS/ATP刺激后，大量细胞死亡。使用扫描电子显微镜，我们观察了单个细胞中细胞死亡的可能形式。结果表明，在用LPS/ATP刺激后，细胞可能会发生焦亡、凋亡或坏死性凋亡。该协议的重点是观察用LPS / ATP刺激后巨噬细胞的死亡。结果表明，LPS和ATP刺激后的细胞死亡不仅限于焦亡，还可以发生凋亡和坏死性细胞凋亡，有助于研究人员更好地了解LPS和ATP刺激后的细胞死亡，并选择更好的实验方法。

引言

细胞死亡是所有生物体的基本生理过程。近年来，大量研究表明，细胞死亡与生物体内的免疫和平衡有关。研究细胞死亡有助于我们更好地了解疾病的发生和发展。已经描述了几种形式的程序性细胞死亡，并且已经确定了这些过程中的一些关键靶点。焦亡、凋亡和坏死性凋亡是参与内部平衡和疾病¹ 的三种遗传定义的程序性细胞死亡途径。

细胞焦亡的特征是膜孔的形成和细胞内容物的释放。活化的半胱天冬酶或颗粒酶裂解 gasdermins 以分离其 N 端结构域，然后这些结构域寡聚化，与膜结合并形成孔 ^2,3,4。Gasdermin 孔提供跨细胞膜的非典型分泌通道，导致下游细胞反应，包括内容物释放和离子流入 ^2,3,4。最终，细胞最终经历质膜破裂和由 ninjurin-1⁵ 促进的焦亡裂解。在凋亡中，活化的 Bax 和 Bak 在线粒体外膜上形成寡聚体并释放细胞色素 C，细胞色素 C 受 BCL-2 家族的促凋亡和抗凋亡蛋白、起始蛋白半胱天冬酶（casp....

方案

1. 细胞系和细胞培养

1. 在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素和 0.05 mM β-巯基乙醇的 RPMI-1640 完全培养基中培养人单核细胞系 THP-1。在37°C的5%CO₂ 湿润空气中培养细胞。每 2-3 天传代培养一次细胞。
   注意:THP-1 是悬浮细胞，选择更换一半的培养基进行传代培养。当在光学显微镜下观察许多细胞片段时，在室温下以300× g 离心3分钟。将细胞重悬于预热的新鲜完全细胞培养基中。
2. 使用对数生长阶段的细胞（在第4-10代中）进行所有实验。当细胞处于良好状态和对数生长阶段时，它们在100x的光学显微镜下是圆形的，明亮的，致密的，没有团块和细胞碎片。

2. THP-1细胞的分化

1. 制备浓度为 1 mM 的 PMA 储备溶液（将 1 mg PMA 溶解在 1.62 mL 二甲基亚砜中）。用完全细胞培养基稀释PMA储备溶液至终工作浓度为100nM。
2. 将培养皿中的细胞收集到 10 mL 无菌离心管中。在室温下以 300 x g 离心 3 分钟，用 3 mL 含有 PMA 的完全培养基重悬细胞。
3. 打开细胞计数仪和计数软件。将 20 μL 细胞悬液移液到细胞计数板上，并将其插入细胞计数板。点击 ....

结果

按照方案中的描述处理细胞样品，并进行流式细胞术检测。正常细胞不能用膜联蛋白V和7-AAD（膜联蛋白V-/7-AAD-）染色。在细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的早期阶段，PS暴露并与Annexin V结合，但细胞膜仍然完整，从细胞外空间排除了7-AAD（Annexin V+/7-AAD-）。在后期阶段，细胞膜失去完整性，细胞同时被膜联蛋白V和7-AAD染色，显示出双重阳性结果（膜联蛋白V+/7-AAD+）。坏死细胞仅用7-AAD（Annexin V-/7-AAD+）.......

讨论

在本文中，使用两种方法检测 LPS 和 ATP 诱导的 PMA 分化 THP-1 巨噬细胞的死亡。采用膜联蛋白V/7-AAD双染色，采用流式细胞术分析整体染色结果。与其他流式细胞术分析一样，设置一组未染色细胞和两组单染色细胞以排除假阳性和假阴性结果。结果表明，LPS/ATP刺激后，几种细胞失去了膜的完整性，表明可能已经发生了细胞死亡。这种检测方法使我们能够评估整个细胞的细胞死亡。值得注意的是，Anne.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰酶溶液（不含 EDTA）	博斯特生物科技 co.ltd	PYG0068
5 mL 聚苯乙烯圆底管	康宁	352235
5 mL 离心管	Labgic Technology Co.， Ltd.	BS-50-M
6 孔板	索尔发生命科学研究有限公司	220100
膜联蛋白 V-PE/7-AAD 细胞凋亡分析试剂盒	苦艾蛋白（上海）生物科技有限公司 co.ltd	abs50007	膜联蛋白 V-PE， 7-AAD， 5×结合缓冲液、细胞凋亡阳性对照溶液
细胞培养 CO2 培养箱	Esco （Shanghai） Enterprise Development Co.， Ltd.	N/A
细胞培养皿，100 mm	索法生命科学研究有限公司	230301
Cellometer K2 荧光细胞计数器	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 计数室	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
离心机	湖南湘益实验室仪器开发有限公司	L530
铬明矾	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co.， Ltd. 广东瓮江化学试剂有限公司
盖玻片 9 mm	Labgic Technology Co.， Ltd.	BS-09-RC
临界点干燥器	Quorum Technologies	K850
二甲基亚砜	博斯特生物科技 co.ltd	PYG0040
电子显微镜固定剂	Servicebio Technology co.nbsp;	G1102	2.5% 戊二酸二醛，100 mM 磷盐
电子天平	岛津	ATX124
乙醇绝对值	成都科隆化工有限公司	2021033102
流式细胞仪	Becton，Dickinson and Company	FACSCanto
流式细胞术分析软件	Becton，Dickinson and Company	BD FACSDivaTM 软件
明胶	广东瓮江化学试剂有限公司	PA00256
高分辨率冷场发射扫描电子显微镜	TITACHI	Regulus 8100
人单核细胞系 THP-1	Procell Life Science&Technology Co.，Ltd.[科技有限公司]	CL0233
倒置显微镜	Leica Microsystems Co.， Ltd	DMi1
红外涡旋混合器	VELP Scientifica Srl	ZX4
脂多糖	北京阳光生物科技 &科技有限公司	L8880	LPS 来源于大肠杆菌 055：B5
Na2ATP	北京阳光生物科学科技有限公司	A8270
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸盐	北京阳光生物科技 &科技有限公司	P6741
磷酸盐缓冲盐水	Servicebio Technology co.ltd	G4202
移液器	Eppendorf AG	N/A
移液器吸头， 10 μL	Servicebio Technology co.nbsp;	T-10PL
移液器吸头，1 mL	Servicebio Technology co.，nbsp;	T-1250L
移液器吸头，200 &μ;L	Servicebio Technology co.nbsp;	T-200L
RPMI-1640 完整培养基	Procell Life Science&Technology Co.，Ltd.[科技有限公司]	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM &β;-巯基乙醇 + 1% P/S
RPMI-1640 培养基	上海 BasalMedia Technologies Co.， LTD. 技术
护套液	BECKMAN COULTER	8546733
溅射镀膜机	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
恒温水浴锅	国华电器有限公司	HH-1

PA04354有限公司K211104型