本实验方案基于LPS和ATP诱导的PMA分化THP-1巨噬细胞死亡。我们采用流式细胞术分析Annexin V与7-AAD双染色以检测细胞死亡，并利用全细胞进行扫描电子显微镜观察细胞膜形态。
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摘要
摘要
细胞死亡是所有生物体中的一种基本过程。本方案建立了一种脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）诱导的、经佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯（PMA）分化的人单核细胞（THP-1）来源巨噬细胞脂质沉积模型，用于观察细胞死亡。LPS联合ATP是一种经典的炎症诱导方法，常用于研究细胞焦亡，但细胞凋亡和坏死性凋亡也对LPS/ATP刺激有响应。正常情况下，磷脂酰丝氨酸仅定位于细胞质膜的内小叶。然而，在细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的早期阶段，细胞膜仍保持完整，但磷脂酰丝氨酸暴露于膜外；在晚期阶段，细胞膜完整性丧失。本研究采用流式细胞术分析Annexin V与7-氨基放线菌素D（7-AAD）双染色，以检测整体细胞中的细胞死亡情况。结果显示 ，经LPS/ATP刺激后有大量细胞死亡。通过扫描电子显微镜，我们观察了单个细胞中可能存在的细胞死亡形态。结果表明，细胞在LPS/ATP刺激后可能发生焦亡、凋亡或坏死性凋亡。本方案重点在于观察LPS/ATP刺激后巨噬细胞的死亡情况。结果表明，LPS与ATP刺激后的细胞死亡不仅限于焦亡，也可能发生凋亡和坏死性凋亡，有助于研究人员更全面地理解LPS与ATP刺激后的细胞死亡类型，并选择更合适的实验方法。
引言
细胞死亡是所有生物体中一种基本的生理过程。近年来，大量研究表明，细胞死亡参与了机体内的免疫反应与稳态维持。研究细胞死亡有助于我们更好地理解疾病的发生与发展。目前已描述了多种程序性细胞死亡形式，并鉴定出这些过程中的一些关键靶点。焦亡、凋亡和坏死性凋亡是三种在基因层面明确界定的程序性细胞死亡通路，参与机体稳态及疾病过程1。
细胞焦亡的特征是细胞膜上形成孔隙并释放细胞内容物。活化的caspase或颗粒酶可切割gasdermin蛋白，使其N端结构域被释放，随后发生寡聚化、与细胞膜结合并形成孔隙2,3,4。gasdermin形成的孔隙在细胞膜上提供了一种非典型的分泌通道，引发下游细胞反应，包括内容物释放和离子内流2,3,4。最终，细胞在ninjurin-1的促进下发生质膜破裂和焦亡性裂解5。在细胞凋亡过程中，活化的Bax和Bak在线粒体外膜上形成寡聚体，释放细胞色素C，该过程受到BCL-2家族促凋亡与抗凋亡蛋白、起始cas....
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方案
1. 细胞系与细胞培养
- 将人单核细胞系 THP-1 培养于含 10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素和 0.05 mM β-巯基乙醇的 RPMI-1640 完全培养基中。在 37 °C、5% CO2 的湿化空气中培养细胞。每 2–3 天传代一次。
注意：THP-1 为悬浮细胞，传代时建议更换一半培养基。若在光学显微镜下观察到大量细胞碎片，可在室温下以 300 × g 离心 3 分钟，随后将细胞重悬于预热的新鲜完全培养基中。 - 所有实验均使用处于对数生长期的细胞（第 4–10 代）。当细胞状态良好且处于对数生长期时，在 100 × 光学显微镜下观察应呈圆形、明亮、致密，且无团块和细胞碎片。
2. THP-1 细胞的分化
- 制备浓度为 1 mM 的佛波酯（PMA）储备液（将 1 mg PMA 溶解于 1.62 mL 二甲基亚砜中）。用完全细胞培养基将 PMA 储备液稀释至终工作浓度为 100 nM。
- 将培养皿中的细胞收集至 10 mL 无菌离心管中，在室温下以 300 × g 离心 3 分钟，用含 PMA 的 3 mL 完全培养基重悬细胞。
- 打开细胞计数仪并启动计数软件。吸取 20 µL 细胞悬液加入细胞计数板，然后将计数板插....
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结果
细胞样品按照方案所述进行处理，并进行了流式细胞术检测。正常细胞不能被Annexin V和7-AAD染色（Annexin V-/7-AAD-）。在细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的早期阶段，磷脂酰丝氨酸（PS）暴露并结合Annexin V，但细胞膜仍保持完整，可将7-AAD排除在细胞外（Annexin V+/7-AAD-）。在后期阶段，细胞膜完整性丧失，细胞同时被Annexin V和7-AAD染色，呈现双阳性结果（Annexin V+/7-AAD+）。坏死细胞仅被7-AAD染色（Annexin V-/7-AAD+）。图1显示，在LPS/ATP刺激后，Q2象限中的细胞数量显著增加，表明发生了细胞死亡。
我们使用扫描电镜（SEM）捕获细胞质膜表面，直接观察单个细胞的膜特征。 图2A 显示对照组细胞，图2B-D 显示经LPS/ATP刺激后的细胞。我们观.......
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讨论
在本研究中，采用两种方法检测LPS和ATP诱导的PMA分化THP-1巨噬细胞死亡。使用Annexin V/7-AAD双染法，并通过流式细胞术对整体染色结果进行分析。与其他流式细胞术分析类似，设置了未染色细胞组以及两个单染细胞组，以排除假阳性与假阴性结果。结果显示，在LPS/ATP刺激后，部分细胞失去细胞膜完整性，提示可能发生细胞死亡。该检测方法使我们能够从整体细胞水平评估细胞死亡情况。值得注意的是，Annexin V/7-AAD双染法不足以区分细胞焦亡、凋亡与坏死性凋亡。在这三种死亡方式的早期阶段，磷脂酰丝氨酸（PS）均会外翻至质膜外侧，Annexin V染色呈阳性；在晚期阶段，细胞膜完整性均丧失，染色结果表现为双阳性。因此，我们进一步采用扫描电镜（SEM）观察可能发生的细胞死亡形态。
在细胞凋亡中，BAX/BAK 在线粒体外膜上形成孔道，随后发生细胞皱缩和细胞膜出泡。坏死性凋亡通过 MLKL 在细胞膜上打开孔道，而焦亡信号则激活 gasdermin 在细胞膜上形成孔道。值得注意的是，焦亡和坏死性凋亡在最终阶段均伴随细胞膜破裂。然而，gasdermin 形成的孔道明显大于 MLKL.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们非常感谢成都中医药大学中医药创新研究院孙佳怡和杨璐在流式细胞术方面提供的协助，感谢西南道地药材国家重点实验室陈翠萍在扫描电子显微镜方面给予的帮助。本工作得到国家自然科学基金[82104491]、四川省自然科学基金[2023NSFSC0674]以及中国博士后科学基金[2021M693789]的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰酶溶液（不含EDTA） | BOSTER 生物科技有限公司 | PYG0068 | |
| 5 mL 聚苯乙烯圆底管 | CORNING | 352235 | |
| 5 mL离心管 | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6孔板 | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD 凋亡分析试剂盒 | Absin（上海）生物技术有限公司 | abs50007 | Annexin V-PE、7-AAD、5×结合缓冲液，凋亡阳性对照溶液 |
| 细胞培养 CO2 培养箱 | Esco（上海）企业发展有限公司 | N/A | |
| 细胞培养皿，100 mm | Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 荧光细胞计数仪 | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 计数板 | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| 离心机 | 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 | L530 | |
| 铬明矾 | 广东翁江化学试剂有限公司 | PA04354 | |
| 盖玻片，9 毫米 | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| 临界点干燥仪 | Quorum Technologies | K850 | |
| 二甲基亚砜 | BOSTER 生物科技有限公司 | PYG0040 | |
| 电子显微镜固定剂 | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% 戊二醛，100 mM 磷酸盐 |
| 电子天平 | SHIMADZU | ATX124 | |
| 无水乙醇 | 成都科龙化工试剂有限公司 | 2021033102 | |
| 流式细胞仪 | Becton, Dickinson and Company | FACSCanto <图片替代文本"公式 1" 源文本：src="/files/ftp_upload/66831/66831eq01.jpg" 样式="margin: auto;"/> | |
| 流式细胞术分析软件 | Becton, Dickinson and Company | BD FACSDivaTM 软件 | |
| 明胶 | 广东翁江化学试剂有限公司 | PA00256 | |
| 高分辨率冷场发射扫描电子显微镜 | TITACHI | Regulus 8100 | |
| 人单核细胞系 THP-1 | 普罗赛尔生命科学&Technology Co., Ltd. | CL0233 | |
| 倒置显微镜 | 徕卡显微系统有限公司 | DMi1 | |
| 红外涡旋混匀仪 | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| 脂多糖 | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | L8880 | LPS 来源于大肠杆菌 Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | A8270 | |
| 佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯 | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | P6741 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| 移液器 | Eppendorf AG | N/A | |
| 移液器吸头，10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| 1 mL 移液器吸头 | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| 移液器吸头，200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 完全培养基 | 普罗赛生命科学&Technology有限公司 | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05 mM β-巯基乙醇 + 1% 青霉素-链霉素 |
| RPMI-1640 培养基 | 上海 基础培养基 有限公司 | K211104 | |
| 鞘液 | 贝克曼库尔特 | 8546733 | |
| 溅射镀膜仪 | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| 恒温水浴锅 | 国华电器有限公司 | HH-1 |
参考文献
- Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
- Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 ....
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重印与许可
