此处展示了一种微创外科手术操作，该操作包括将激光多普勒探头放置于颅骨上大脑中动脉（MCA）远端区域，即适用于大鼠和小鼠的眶周位置，以评估短暂性MCA闭塞期间的血流情况。
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摘要
摘要
大脑中动脉阻塞（MCAO）是啮齿类动物缺血性脑卒中临床前建模的金标准方法。然而，即使由经验最丰富的手术操作者实施，也不能保证阻塞一定成功。操作错误主要发生在栓线插入深度不当时，可能导致无梗死发生或血管穿孔，后者可致动物死亡。激光多普勒血流仪（LDF）是一种可靠的技术，可在MCAO手术过程中实时监测局部脑血流量（CBF）。本文展示了一种在小鼠和大鼠中快速实施眼眶周围放置激光多普勒探头以测量CBF的技术。我们的目的是简化LDF的应用，促进其广泛使用，从而提高手术的可靠性。该技术无需进行颅骨减薄或使用专用设备，通过将探头置于眼眶周围区域而非传统的背侧位置，提高了操作效率并更易于推广。本文所述方案包括术前准备、眼眶周围多普勒探头放置以及术后护理。代表性结果包括手术关键步骤的图示，以及显示成功MCAO手术的典型LDF血流曲线，同时展示了因栓线放置失败导致并发症的案例。本方案阐明了LDF在确认栓线正确放置中的作用，并提供了一种较其他方法更为简化的操作流程。
引言
自1986年首次在大鼠中引入大脑中动脉阻塞（MCAO）方法以来1，该技术已在啮齿类动物中得到广泛应用，随后Longa于1990年提出了改良方法2，不久后又出现了适用于小鼠的多种改良方案3。尽管Longa的原始文献中未提及，但利用激光多普勒血流仪（LDF）信号来确认栓线位置的方法很快在后续研究中被报道4。在MCAO操作过程中使用LDF在现有文献中被广泛描述，但在当前卒中临床前评估网络（Stroke Preclinical Assessment Networks, SPAN）的标准操作规程（SOPs）中被列为可选步骤5。
在MCAO手术过程中，使用激光多普勒血流仪（LDF）可确认缝线放置位置的正确性，从而提高实验设计的严谨性以及后续结果的可靠性，尤其在旨在探索药物疗效的实验中更为重要。LDF的使用可减少因缝线位置不当导致的手术错误，避免出现两种极端情况：缝线插入不足导致无脑缺血损伤，或插入过深引起血管穿孔而导致动物死亡。另一方面，LDF的使用与MCAO术后常见的梗死体积变异性无关6。在MCAO操作中使用LDF可能被认为具有难度且操作繁琐，尤其是在大鼠中，因其颅骨比小鼠更厚，可能需要在LDF探头放置前进行颅骨减薄处理7,8。此外，背侧探头放置在某些方案中常被描述为需要特殊设备或预处理步骤7,8,9。由于上述种种障碍，研究中可能未能实施LDF以确认缝线的正确位置。
在本实验方案中，我们描述了一种将激光多普勒探头置于颅骨上、大脑中动脉远端区域（即眶周放置）的方法，用于在小鼠和大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）过程中评估脑血流。我们提出该方法的依据是，与文献中报道的一些方法7,8,9,10相比，该方法具有多重优势：创伤更小、操作快速，且无需进行颅骨减薄处理，除激光多普勒探头外无需其他特殊设备。
方案
成年小鼠和大鼠用于本方案的示例（25 g，C57BL/6J，Jackson Laboratories；250 g，Sprague Dawley，Envigo）。动物操作和实验程序均经亚利桑那大学机构动物护理与使用委员会批准，并符合国家法律法规及实验室动物护理原则11大鼠和小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环（上午7点至晚上7点）环境中，自由获取食物和水 随意摄取.
1. 术前准备
注意：通常情况下，啮齿类动物的MCAO手术作为存活手术进行，必须采用无菌手术技术或仅使用无菌器械尖端的技术，具体方法应遵循机构特定的IACUC方案。本实验中，术者采用仅使用无菌器械尖端的技术，并使用经过灭菌的器械和耗材。
- 使用商用消毒剂对术区工作台面进行消毒，并通过高压灭菌法准备无菌手术包，内含手术器械、手术单、纱布、棉签、缝合线和手术刀片。在生存性手术过程中，应按照IACUC批准的技术维持无菌条件，例如使用食品级塑料薄膜覆盖显微镜旋钮并进行铺巾。
- 若在同一手术时段内进行多例啮齿类动物手术，每次操作之间应使用干珠灭菌器对手术器械重新灭菌。
- 将大鼠或小鼠放入诱导室，使用3%–5%异氟烷（1 L/min，混合80%空气和20%氧气）诱导麻醉。
- 将动物从诱导室转移至实验台上的鼻罩进行维持麻醉（小鼠：0.5 L/min，80%/20%氧气/空气混合气；大鼠：1.5 L/min，80%/20%氧气/空气混合气）。在双眼涂抹眼用软膏，并小心剃除将进行大脑中动脉阻塞（MCAO）手术一侧（通常为右侧）耳部与眼眶之间的毛发，使用电动剪时注意避免划伤皮肤。在大鼠中，剃毛后可在眼眶与耳部之间中点附近观察到胡须凹陷。根据MCAO手术需要，继续剃除其他相关区域毛发9（不在本文讨论范围内）。
- 根据需要将动物放回诱导室，或转移至已预热至37 °C的手术台上连接鼻罩。插入直肠温度计。在整个手术过程中，应根据批准的IACUC方案将动物体温维持在约36 °C ± 1 °C。
- 用棉签蘸取聚维酮碘对皮肤进行消毒，从手术区域中心向外螺旋式擦拭。随后使用酒精消毒垫擦拭。上述两步重复三次。通过脚趾夹捏反射每15分钟检查一次麻醉深度，确认麻醉状态适当。
2. 眶周多普勒探头放置
- 使用小剪刀，在眼睛外角与耳褶之间做一个垂直切口（小鼠：约 0.5 cm；大鼠：约 0.7 cm），如图 2A（小鼠）和图 3A（大鼠）所示，以暴露浅层筋膜及下方肌肉。
注意：应根据 IACUC 协议批准，在术前进行镇痛处理。 - 使用锐利的镊子和弯剪，小心地剪开肌层，直至暴露颅骨。用镊子尖端触碰时，颅骨表面平坦且质地坚硬。此区域即为激光多普勒探头放置的窗口，如图 2B所示。
- 使用镊子电凝工具止血，扩大窗口，并确保通向颅骨的路径畅通。
- 窗口打开后，根据需要使用棉签吸除多余血液。
将小鼠或大鼠置于仰卧位。 - 用镊子牵开皮肤或组织，将多普勒探头置入眶周窗口，使其紧贴颅骨，垂直放置，且无皮肤或肌肉阻碍激光信号。该区域位于大脑中动脉远端上方，如图 1A,B所示。用实验室胶带固定探头位置。本方案中描述的是使用直型探头。
注意：我们承认不同实验室的手术方案可能存在差异。文献中（如被报道）有些实验室会磨薄颅骨，而有些则不会9。这可能是因为眶周区域的颅骨本身较薄，但此仅为推测。根据我们的经验，在小鼠和大鼠中可直接放置探头而无需磨骨，本方案即展示了该方法。 - 使用合适的软件在显示器上监测相对血流读数（图 2D、图 3C、D）。LDF 读数会有所变化，但检测血流下降的最佳范围为>200 灌注单位（PU）。
- 继续进行大脑中动脉阻塞（MCAO）手术9（不在本文范围之内）。在 MCAO 手术过程中，可通过短暂结扎颈总动脉来测试探头位置，此时应引起血流突然下降（约 50%）。
3. 多普勒探头移除及术后护理
- 在MCAO结束或血流读数完成后，从手术窗口移除激光多普勒探头。在小鼠MCAO手术过程中，多普勒探头通常会一直保留在原位，因为缺血时间通常少于90分钟。而在大鼠MCAO操作中，可在栓线放置到位并进入缺血期后（通常 > 90 分钟）后，再次将其置于眶周窗口，通过重复步骤 2.6 和 2.7 确认再灌注。
注意：可在小鼠MCAO模型中观察到典型的LDF连续追踪曲线 图 4A典型的LDF记录图显示了大鼠MCAO手术过程中的血流变化 图4B. - 沿预定切口部位皮下注射经IACUC批准的局部麻醉剂。
- 使用可吸收缝合线或手术胶，按照批准的IACUC方案，以标准外科结法将皮肤缝合1-2针。根据IACUC方案批准的术后镇痛处理方案进行镇痛治疗（例如0.5%盐酸布比卡因） & 2% 利多卡因，小鼠和大鼠仅在切口内使用一次）。动物在能够维持胸卧位之前不得无人看管，且在完全恢复之前不得与其他动物合笼。
结果
激光多普勒探头放置于大脑中动脉区域的位置在图1中以示意图形式展示，提供了血管结构的图解，并从矢状面和背侧视角提供了可视化指引。图2总结了小鼠激光多普勒探头放置的关键步骤及结果。图2A显示了一只已麻醉并准备好的小鼠图像，其上标有虚线，指示为后续放置激光多普勒探头所需做垂直切口的位置。颅骨的眼周开窗区域在图2B中予以展示。
图3总结了激光多普勒探头在大鼠体内的放置位置。图3A显示了一只已麻醉并准备好的大鼠图像，其上标有虚线，指示为后续放置激光多普勒探头所需做垂直切口的位置。由于大鼠的眼眶周围区域比小鼠更深，因此无法直接观察到该区域。在此情况下，可如步骤2.3所述触摸到颅骨。图3B展示了仰卧位大鼠在眼眶周围区域放置激光多普勒探头的情况。
小鼠MCAO手术过程中典型的LDF描记图如图4A所示。该图显示了缺血成功诱导的结果，表现为当颈动脉结扎以及栓线推进至大脑中动脉（MCA）开口时，相对脑血流量（CBF）出现明显且即时的下降。描记图末端显示了再灌注的开始，表现为当颈动脉松开以及栓线从MCA撤出时，相对CBF出现明显且即时的上升。大鼠MCAO手术期间典型的LDF缺血读数如图4B所示，该图显示了成功诱导缺血后，为在再灌注期间进行LDF测量而移除探头并重新放置的过程。在大鼠手术中，缺血时间可能超过60分钟，动物在缺血期间可能苏醒，因此应在再灌注前重新麻醉。在此情况下，将探头重新定位至眶周窗，继续记录LDF描记图。描记图中表现为当颈动脉结扎且栓线推进至MCA开口时，相对CBF出现明显且即时的下降，提示缺血的发生。第二次LDF描记图中表现为相对CBF明显且即时的上升，提示再灌注的发生，此现象发生在颈动脉松开之后，以及栓线从MCA开口撤出时。眶周多普勒探头置于MCA的远端分支上方，因此位于MCA血流分布范围内，MCAO手术期间血流减少导致CBF下降，如图4所示。
我们在图5中展示了体现MCAO手术失败的LDF轨迹。图5A总结了一例大鼠手术的LDF轨迹，该手术最初成功闭塞颈动脉，但随后发生松动，且栓线放置不成功，表现为相对CBF缓慢下降。这种LDF模式通常与穿支动脉穿孔相关，可通过尸检确认。另一例小鼠MCAO手术的LDF轨迹（图5B）显示颈动脉闭塞不明确，可能导致无法检测到栓线在大脑中动脉开口处的到位情况。由于当栓线轻微回撤时，相对CBF恢复迟缓，因此怀疑发生了大脑中动脉穿孔。这些实例突显了LDF轨迹在区分MCAO手术成功与失败中的关键作用，并强调了精细的外科操作和措施对于获得可靠实验结果的重要性。
图 1：激光多普勒探头相对于大脑中动脉（MCA）位置的示意图。 激光多普勒探头放置位置的示意图，分别显示（A）矢状面和（B）背侧视图。使用 Biorender.com 制作；KT26JWLYF6。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：小鼠激光多普勒探头置入手术步骤示意图。（A）小鼠仰卧位时，为放置激光多普勒探头所需做垂直切口位置的图像。（B）使用镊子和/或剪刀处理小鼠眶周窗及颅骨的图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：大鼠激光多普勒探头放置手术步骤示意图。（A）大鼠仰卧位时，为放置激光多普勒探头所需垂直切口位置的示意图。（B）仰卧位大鼠眶周区域的激光多普勒探头放置示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：小鼠和大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）手术成功实施的激光多普勒血流（LDF）记录示例。 （A）小鼠MCAO手术过程中大脑中动脉区域的LDF读数。该记录图显示了以下步骤的确认：1. 颈动脉结扎导致的动脉闭塞；2. 线栓插入至大脑中动脉；3. 持续缺血60分钟后移除线栓；4. 解开颈动脉结扎实现再灌注。图中a和b部分展示了在记录过程中颈动脉被解开又重新结扎时多普勒信号的变化形态。该技术可用于确认探头的正确放置。（B）大鼠MCAO手术过程中大脑中动脉区域的LDF读数。与小鼠类似，该记录图显示了以下步骤的确认：1. 颈动脉结扎导致的动脉闭塞；2. 线栓插入至大脑中动脉。在大鼠MCAO手术中，多普勒探头常被移除，动物在整个缺血期间保持清醒并可自由活动。在再灌注前重新建立LDF监测：3. 确认线栓已被移除；4. 确认颈动脉结扎已被解开，完成再灌注过程。在小鼠和大鼠的MCAO手术中，探头成功放置的标志是能够清晰观察到线栓正确到位，并表现为LDF记录中出现两次明显且突然的血流下降（代表缺血），随后出现两次明显且突然的血流上升（代表再灌注）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：显示小鼠和大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）操作不成功的激光多普勒血流图示例。（A）大鼠中提示导丝位置不确定的LDF图示示例。在颈动脉被结扎（1.）、变松（2.）并再次结扎（3.）的过程中，当导丝到达大脑中动脉开口处时，LDF并未出现突然下降，而是表现为不明显且缓慢的下降。该图示可能提示大脑中动脉穿孔，动物可能无法存活至再灌注后的24小时内；可通过尸检确认导丝穿孔情况。（B）小鼠中提示导丝位置不确定的LDF图示示例。在此图示中，颈动脉结扎的证据不明确（1.），随后在导丝到达大脑中动脉开口处时LDF下降也不明显（2.）。此外，当导丝轻微撤回时，脑血流相对增加的速度迟缓（3.）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
大脑中动脉阻塞（MCAO）是模拟啮齿类动物脑动脉阻塞与再灌注的金标准方法，也是临床前卒中研究的核心技术，能够诱导啮齿类动物产生局灶性缺血，以模拟人类卒中的病理生理过程。该手术操作精确，但不同操作者之间甚至同一操作者内部均存在显著的变异。尽管目前尚无证据表明使用激光多普勒血流监测（LDF）能够降低变异程度，但在某些实验设计中，它可能提高科学研究的严谨性和实验结果的质量。其优势在于，LDF可验证栓线位置，并在术中实时提供脑血流量（CBF）信息，从而确认大脑中动脉是否已被成功阻塞。约75%的小鼠研究报道使用了激光多普勒探头12,13，而在一项关于大鼠研究的荟萃分析中，该参数并未被报告14。LDF的一种常用替代方法是通过带有刻度的栓线测量插入深度（例如，在大鼠中从颈总动脉分叉处插入18–20 mm），或测量从插入点外露的剩余栓线长度（例如，10 mm）10。然而，这种替代方法不如LDF可靠，因为栓线插入的精确深度可能因动物体型、体重以及实验所用具体方案的不同而略有差异。考虑到血管穿孔或阻塞不完全等不良手术结局的风险，这些差异对于MCAO手术的可重复性而言至关重要。
尽管激光多普勒血流仪（LDF）是一种用于验证微丝放置位置的方法，并且得到SPAN的支持，但它并非已发表的SPAN-SOP5中必需的步骤。本方案克服了在仰卧位动物上进行主要操作时使用特殊设备以及将探头难以放置于颅骨背侧区域等障碍；这些因素通常会延长手术时间。相比之下，本方案采用单一直型激光多普勒探头及监测仪、眶周放置位置，且无需进行颅骨变薄处理。综合这些步骤，使整个操作过程显著简化并缩短（通常少于5分钟），相较于文献中描述的其他类似方法是一项重要改进7,8,9,10。该方案也可根据外科医生的实际需要进行调整。在对所述技术进行故障排查时，可能需要重新调整探头位置，尤其是在第2.8步中未观察到血流量下降的情况下。
激光多普勒血流监测（LDF）的应用仅限于确认线栓放置位置，尚未发现其与梗死体积变异性相关，而小鼠和大鼠实验方法中的梗死体积变异性可能>20%12,14。梗死体积的变异性一直是临床前脑卒中研究中的长期难题。尽管这种增加的变异性可能模拟人类患者中观察到的梗死体积多样性13，但如果未予以充分控制，所观察到的变异性可能导致统计效能不足的研究结果。虽然目前尚无单一因素可预测方法学带来的变异性，但确认线栓放置位置是药物疗效研究中的一个重要因素。本文所述方案可能已在小鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）操作中使用，但在大鼠中可能应用不足，因为文献中更常描述的是背侧放置方式9。我们认为，这种简化的激光多普勒探头放置方法有助于优化临床前脑卒中研究的技术方法，以实现更高的实验精确性和转化相关性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由 NINDS 1R41NS124450 资助。BioRender：KT26JWLYF6
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 弯头弹簧剪刀 | Castroviejo | 1501710 | |
| #5 镊子 | Fine science tools | 11250-20 | |
| #5/45 镊子 | Fine science tools | 1151-35 | |
| 电凝钳工具 | Conmed | M18019-01 | |
| 实验室胶带 | Fisherbrand Labeling Tape | 15-950 | |
| 激光多普勒血流监测仪 | Moore Instruments | MOORVMS-LDF | |
| LDF 软件 | Perisoft for Windows 或 moorSOFT | NA | |
| 小鼠剪毛器 | Philips Norelco | MG7910 | |
| Periflux System 4000，探头 407 | Perimed | 设备已不再供应 | |
| 塑料保鲜膜 | Glad | press n seal | |
| 大鼠剪毛器 | oster | A5 或类似型号 | |
| 小型啮齿动物麻醉机 | JD Medical | 定制订单 | |
| 小型剪刀 | excelta | 362 Sissors 或类似型号 | |
| 带探头的温度监测系统 | Physitemp | TCAT-2AC 控制器 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66839
