此处展示了一种微创外科手术操作，该操作包括将激光多普勒探头放置于颅骨上大脑中动脉（MCA）远端区域，即适用于大鼠和小鼠的眶周位置，以评估短暂性MCA闭塞期间的血流情况。
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摘要
摘要
大脑中动脉阻塞（MCAO）是啮齿类动物缺血性脑卒中临床前建模的金标准方法。然而，即使由经验最丰富的手术操作者实施，也不能保证阻塞一定成功。操作错误主要发生在栓线插入深度不当时，可能导致无梗死发生或血管穿孔，后者可致动物死亡。激光多普勒血流仪（LDF）是一种可靠的技术，可在MCAO手术过程中实时监测局部脑血流量（CBF）。本文展示了一种在小鼠和大鼠中快速实施眼眶周围放置激光多普勒探头以测量CBF的技术。我们的目的是简化LDF的应用，促进其广泛使用，从而提高手术的可靠性。该技术无需进行颅骨减薄或使用专用设备，通过将探头置于眼眶周围区域而非传统的背侧位置，提高了操作效率并更易于推广。本文所述方案包括术前准备、眼眶周围多普勒探头放置以及术后护理。代表性结果包括手术关键步骤的图示，以及显示成功MCAO手术的典型LDF血流曲线，同时展示了因栓线放置失败导致并发症的案例。本方案阐明了LDF在确认栓线正确放置中的作用，并提供了一种较其他方法更为简化的操作流程。
引言
自1986年首次在大鼠中引入大脑中动脉阻塞（MCAO）方法以来1，该技术已在啮齿类动物中得到广泛应用，随后Longa于1990年提出了改良方法2，不久后又出现了适用于小鼠的多种改良方案3。尽管Longa的原始文献中未提及，但利用激光多普勒血流仪（LDF）信号来确认栓线位置的方法很快在后续研究中被报道4。在MCAO操作过程中使用LDF在现有文献中被广泛描述，但在当前卒中临床前评估网络（Stroke Preclinical Assessment Networks, SPAN）的标准操作规程（SOPs）中被列为可选步骤5。
在MCAO手术过程中，使用激光多普勒血流仪（LDF）可确认缝线放置位置的正确性，从而提高实验设计的严谨性以及后续结果的可靠性，尤其在旨在探索药物疗效的实验中更为重要。LDF的使用可减少因缝线位置不当导致的手术错误，避免出现两种极端情况：缝线插入不足导致无脑缺血损伤，或插入过深引起血管穿孔而导致动物死亡。另一方面，LDF的使用与MCAO术后常见的梗死体积变异性无关6。在MCAO操作中使用LDF可能被认为具有难度且操作繁琐，尤其是在大鼠中，因其颅骨比小鼠更厚，可能需要在LDF探头放置前进行颅骨减薄处理7,8。此外，背侧探头放置在某些方案中常被描述为需要特殊设备或预处理步骤7,8,9。由于上述种种障碍，研究中可能未能实施LDF以确认缝线的正确位置。
在本实验方案中，我们描述了一种将激光多普勒探头置于颅骨上、大脑中动脉远端区域（即眶周放置）的方法，用于在小鼠和大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）过程中评估脑血流。我们提出该方法的依据是，与文献中报道的一些方法7,8,9,10相比，该方法具有多重优势：创伤更小、操作快速，且无需进行颅骨减薄处理，除激光多普勒探头外无需其他特殊设备。
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方案
成年小鼠和大鼠用于本方案的示例（25 g，C57BL/6J，Jackson Laboratories；250 g，Sprague Dawley，Envigo）。动物操作和实验程序均经亚利桑那大学机构动物护理与使用委员会批准，并符合国家法律法规及实验室动物护理原则11大鼠和小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环（上午7点至晚上7点）环境中，自由获取食物和水 随意摄取.
1. 术前准备
注意：通常情况下，啮齿类动物的MCAO手术作为存活手术进行，必须采用无菌手术技术或仅使用无菌器械尖端的技术，具体方法应遵循机构特定的IACUC方案。本实验中，术者采用仅使用无菌器械尖端的技术，并使用经过灭菌的器械和耗材。
- 使用商用消毒剂对术区工作台面进行消毒，并通过高压灭菌法准备无菌手术包，内含手术器械、手术单、纱布、棉签、缝合线和手术刀片。在生存性手术过程中，应按照IACUC批准的技术维持无菌条件，例如使用食品级塑料薄膜覆盖显微镜旋钮并进行铺巾。
- 若在同一手术时段内进行多例啮齿类动物手术，每次操作之间应使用干珠灭菌器对手术器械重新灭菌。
- 将大鼠或小鼠放入诱导室，使用3%–5%异氟烷（1 L/min，混合80%空气和20%氧气）诱导麻醉。
- 将动物从诱导室转移至实验台上的鼻罩进行维持麻醉（小鼠：0.5 L/min，80%/20%氧气/空气混合气；大鼠：1.5 L/min，80%/20%氧气/空气混合气）。在双眼涂抹眼用软膏，并小心剃除将进行大脑中动脉阻塞（MCAO）手术一侧（通常为右侧）耳部与眼眶之间的毛发，使用电动剪时注意避免划伤皮肤。在大鼠中，剃毛后可在眼眶与耳部之间中点附近观察到胡须凹陷。根据MCAO手术需要，继续剃除其他相关区域毛发9（不在本文讨论范围内）。
- 根据需要将动物放回诱导室，或转移至已预热至37 °C的手术台上连接鼻罩。插入直肠温度计。在整个手术过程中，应根据批准的IACUC方案将动物体温维持在约36 °C ± 1 °C。
- 用棉签蘸取聚维酮碘对皮肤进行消毒，从手术区域中心向外螺旋式擦拭。随后使用酒精消毒垫擦拭。上述两步重复三次。通过脚趾夹捏反射每15分钟检查一次麻醉深度，确认麻醉状态适当。
2. 眶周多普勒探头放置
- 使用小剪刀，在眼睛外角与耳褶之间做一个垂直切口（小鼠：约 0.5 cm；大鼠：约 0.7 cm），如图 2A（小鼠）和图 3A（大鼠）所示，以暴露浅层筋膜及下方肌肉。
注意：应根据 IACUC 协议批准，在术前进行镇痛处理。 - 使用锐利的镊子和弯剪，小心地剪开肌层，直至暴露颅骨。用镊子尖端触碰时，颅骨表面平坦且质地坚硬。此区域即为激光多普勒探头放置的窗口，如图 2B所示。
- 使用镊子电凝工具止血，扩大窗口，并确保通向颅骨的路径畅通。
- 窗口打开后，根据需要使用棉签吸除多余血液。
将小鼠或大鼠置于仰卧位。 - 用镊子牵开皮肤或组织，将多普勒探头置入眶周窗口，使其紧贴颅骨，垂直放置，且无皮肤或肌肉阻碍激光信号。该区域位于大脑中动脉远端上方，如图 1A,B所示。用实验室胶带固定探头位置。本方案中描述的是使用直型探头。
注意：我们承认不同实验室的手术方案可能存在差异。文献中（如被报道）有些实验室会磨薄颅骨，而有些则不会9。这可能是因为眶周区域的颅骨本身较薄，但此仅为推测。根据我们的经验，在小鼠和大鼠中可直接放置探头而无需磨骨，本方案即展示了该方法。 - 使用合适的软件在显示器上监测相对血流读数（图 2D、图 3C、D）。LDF 读数会有所变化，但检测血流下降的最佳范围为>200 灌注单位（PU）。
- 继续进行大脑中动脉阻塞（MCAO）手术9（不在本文范围之内）。在 MCAO 手术过程中，可通过短暂结扎颈总动脉来测试探头位置，此时应引起血流突然下降（约 50%）。
3. 多普勒探头移除及术后护理
- 在MCAO结束或血流读数完成后，从手术窗口移除激光多普勒探头。在小鼠MCAO手术过程中，多普勒探头通常会一直保留在原位，因为缺血时间通常少于90分钟。而在大鼠MCAO操作中，可在栓线放置到位并进入缺血期后（通常 > 90 分钟）后，再次将其置于眶周窗口，通过重复步骤 2.6 和 2.7 确认再灌注。
注意：可在小鼠MCAO模型中观察到典型的LDF连续追踪曲线 图 4A典型的LDF记录图显示了大鼠MCAO手术过程中的血流变化 图4B. - 沿预定切口部位皮下注射经IACUC批准的局部麻醉剂。
- 使用可吸收缝合线或手术胶，按照批准的IACUC方案，以标准外科结法将皮肤缝合1-2针。根据IACUC方案批准的术后镇痛处理方案进行镇痛治疗（例如0.5%盐酸布比卡因） & 2% 利多卡因，小鼠和大鼠仅在切口内使用一次）。动物在能够维持胸卧位之前不得无人看管，且在完全恢复之前不得与其他动物合笼。
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结果
激光多普勒探头放置于大脑中动脉区域的位置在图1中以示意图形式展示，提供了血管结构的图解，并从矢状面和背侧视角提供了可视化指引。图2总结了小鼠激光多普勒探头放置的关键步骤及结果。图2A显示了一只已麻醉并准备好的小鼠图像，其上标有虚线，指示为后续放置激光多普勒探头所需做垂直切口的位置。颅骨的眼周开窗区域在图2B中予以展示。
图3总结了激光多普勒探头在大鼠体内的放置位置。图3A显示了一只已麻醉并准备好的大鼠图像，其上标有虚线，指示为后续放置激光多普勒探头所需做垂直切口的位置。由于大鼠的眼眶周围区域比小鼠更深，因此无法直接观察到该区域。在此情况下，可如步骤2.3所述触摸到颅骨。图3B
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讨论
大脑中动脉阻塞（MCAO）是模拟啮齿类动物脑动脉阻塞与再灌注的金标准方法，也是临床前卒中研究的核心技术，能够诱导啮齿类动物产生局灶性缺血，以模拟人类卒中的病理生理过程。该手术操作精确，但不同操作者之间甚至同一操作者内部均存在显著的变异。尽管目前尚无证据表明使用激光多普勒血流监测（LDF）能够降低变异程度，但在某些实验设计中，它可能提高科学研究的严谨性和实验结果的质量。其优势在于，LDF可验证栓线位置，并在术中实时提供脑血流量（CBF）信息，从而确认大脑中动脉是否已被成功阻塞。约75%的小鼠研究报道使用了激光多普勒探头12,13，而在一项关于大鼠研究的荟萃分析中，该参数并未被报告14。LDF的一种常用替代方法是通过带有刻度的栓线测量插入深度（例如，在大鼠中从颈总动脉分叉处插入18–20 mm），或测量从插入点外露的剩余栓线长度（例如，10 mm）10。然而，这种替代方法不如LDF可靠，因为栓线插入的精确深度可能因动物体型、体重以...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由 NINDS 1R41NS124450 资助。BioRender：KT26JWLYF6
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 弯头弹簧剪刀 | Castroviejo | 1501710 | |
| #5 镊子 | Fine science tools | 11250-20 | |
| #5/45 镊子 | Fine science tools | 1151-35 | |
| 电凝钳工具 | Conmed | M18019-01 | |
| 实验室胶带 | Fisherbrand Labeling Tape | 15-950 | |
| 激光多普勒血流监测仪 | Moore Instruments | MOORVMS-LDF | |
| LDF 软件 | Perisoft for Windows 或 moorSOFT | NA | |
| 小鼠剪毛器 | Philips Norelco | MG7910 | |
| Periflux System 4000，探头 407 | Perimed | 设备已不再供应 | |
| 塑料保鲜膜 | Glad | press n seal | |
| 大鼠剪毛器 | oster | A5 或类似型号 | |
| 小型啮齿动物麻醉机 | JD Medical | 定制订单 | |
| 小型剪刀 | excelta | 362 Sissors 或类似型号 | |
| 带探头的温度监测系统 | Physitemp | TCAT-2AC 控制器 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66839
