本方案描述了一种改进的小鼠青春期骨生长板损伤模型。利用携带I型、II型和X型胶原三系谱荧光报告基因的转基因小鼠，这些胶原分别对应生长板三种不同基质层的主要细胞外基质成分，通过显微镜下观察内源性荧光来引导损伤位置的定位。
本文内容
摘要
摘要
儿童骨骼中的软骨生长板能够促进肢体延长，但其强度相对于骨骼较弱，因此在骨骼承受过载时容易发生骨折。 对于严重骨折的生长板，目前亟需更有效的治疗方法，因为损伤后的修复反应会形成骨性桥接，导致生长板过早融合，从而引起肢体发育迟缓和（或）畸形。小鼠生长板损伤模型有利于开展机制研究，但 建立该模型具有挑战性，原因是幼鼠的生长板体积微小，难以准确观察和精确损伤。 本文介绍了一种改进的生长板损伤模型，该模型利用携带I型、II型和X型胶原三系荧光报告基因的转基因小鼠。
这些小鼠表现出与生长板三种主要基质相关的天然荧光。在荧光体视显微镜引导下进行活体成像时，以生长板的肥大区作为参考，使用磨头可重复地制造出类似于Salter-Harris II型损伤的生长板损伤。对天然荧光进行冰冻组织学分析，可简化对损伤后细胞反应的评估。该方法代表了生长板损伤研究的重大进步，为研究病理机制和评估新的治疗策略提供了详细且可重复的技术手段。
引言
骨生长板在儿童和青少年时期长骨的纵向生长中起着关键作用1。生长板位于长骨的末端，由多个区域组成，其中软骨细胞是负责生成和维持这一动态生长区域的主要细胞成分。生长板通过软骨内成骨过程实现骨骼的延长和扩展，该过程依次包括软骨细胞增殖、肥大、凋亡、血管侵入、成骨前体细胞募集以及最终的骨形成2。由于生长板相对于成熟骨组织较软，在运动或其他活动中骨骼承受过载时极易发生骨折。Salter-Harris分类法将生长板损伤分为五种不同类型3。其中，穿过生长板肥大区及邻近下方骨组织的II型骨折最为常见4。当肥大区或邻近骨组织受损后，常会形成骨性桥接，导致相邻长骨节段过早融合5。骨性桥接会阻碍生长板的正常扩展。目前尚无有效的预防骨性桥接形成的治疗方法，部分病例是否治疗取决于患者的年龄以及骨性桥接的大小和位置6。当肢体畸形严重时，可采用手术治疗，包括切除骨性桥接后植入脂肪或硅胶等间隔材料，或进行矫正性截骨术和骨延长术；然而骨性桥接仍可能再次形成6。未来需要更多研究来预防骨性桥接的形成，并改善儿童骨生长板损伤的治疗效果。
已建立多种动物模型，以探索损伤后生长板骨桥形成障碍的潜在机制，并开发新的预防策略7,8,9,10,11,12。这些动物模型通常以胫骨近端生长板和股骨远端生长板作为主要损伤部位，因为这些部位通常是人类损伤的好发位置。动物骨缺损可通过类似于真实骨折路径的侧方入路，或从生长板上方或下方入路，在生长板内形成中央钻孔来建立。在先前报道的一种大鼠模型中，通过在胫骨中段皮质开窗，插入牙科钻头并向上经髓腔朝向膝关节钻孔，从而在中央区域损伤生长板7,13。另一种近期的小鼠模型则采用侧方入路，使用细针在生长板内形成平面针道8。在一种广泛应用的大鼠模型中，通过在髁间关节软骨处钻孔，在股骨远端生长板内制造缺损9,14。在兔和羊等较大动物中，生长板缺损既可通过在近端胫骨和股骨远端直接侧方钻孔或切割进入生长板而诱导，也可通过从生长板下方入路制造中央缺损，同时保持生长板边缘结构不变10,11,12,15。
生长板损伤的小鼠模型在机制研究中具有优势，可利用基因修饰小鼠完成干细胞谱系示踪等研究8。然而，在小鼠或大鼠动物模型中，一个主要挑战是难以对生长板的特定亚区域造成一致且精确的损伤。为了模拟Salter-Harris分类中描述的临床相关骨折路径之一，必须损伤生长板的特定区域及其邻近骨组织。迄今为止，啮齿类动物模型的主要困难在于手术制造损伤时缺乏可视化手段来识别生长板的各层结构。本方案描述了一种改进的技术，通过使用表达I型、II型和X型胶原荧光报告基因的三重转基因小鼠16,17,18，实现对小鼠生长板特定层结构的靶向性损伤。这些胶原蛋白在生长板各个主要区域呈现不同颜色的荧光，使得在荧光体视显微镜下进行生长板损伤手术时，能够直观区分生长板的不同部分。使用此类转基因小鼠可在发育阶段与受伤儿童相当的幼年小鼠中实现前所未有的损伤精确度。
方案
研究工作严格遵守机构指南进行。所有动物实验程序在开展前均已获得康涅狄格大学健康中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。该实验方案的概要如图1示意图所示。
图1：三色胶原报告小鼠生长板损伤实验方案示意图。 请点击此处查看该图的高清版本。
1. 小鼠繁殖及手术前准备
- 按照标准繁育程序培育表达 Col1a1-GFPTpz、Col2a1-CFP 和 Col10a1-mCherry16,17,18,19,20,21 的三色转基因胶原报告小鼠，以获得8只用于手术的2周龄（±1天）幼鼠。通过荧光显微镜检测尾尖组织片段的基因型，验证三重转基因的表达。仅使用三种荧光信号均为阳性的个体，以在后续组织学分析中最大化发挥报告系统的效益。
注：选择2周龄（±1天）的小鼠是因为其骨骼生长板的发育阶段与人类青少年相似22。本方案适用于雄性和雌性小鼠。 - 在手术当天或手术前一天，使用经酒精消毒棉片消毒后的耳标钳对每只用于手术的小鼠进行耳缘穿孔标记以实现个体识别，称量每只小鼠体重并记录数值。
- 在异氟烷麻醉作用下，使用电动剪刀将小鼠右侧后肢从髋部至足部完全剃毛。诱导麻醉时，采用异氟烷（2–3%）与100%氧气的混合气体，以1 L/min的流速在1–2 L的诱导室中进行。取出小鼠后，通过夹捏脚趾确认麻醉深度，此时小鼠不应出现移动反应。
注：该麻醉深度足以维持足够长时间，无需使用麻醉面罩即可完成剃毛操作。 - 在异氟烷麻醉状态下，采用26 kV（800 mA）的功率设置对活体小鼠进行X射线成像，获取胫骨图像以记录初始肢体长度。
- 将小鼠放入X射线柜前，使用异氟烷（2–3%）与100%氧气的混合气体（流速1 L/min）在1–2 L诱导室中诱导深度麻醉。
- 每次将三只麻醉后的小鼠并排俯卧放置于X射线柜内适当高度的隔板上，使一次成像可同时包含三只小鼠。展开四肢，确保胫骨不被身体遮挡。为提高测量准确性，成像时在小鼠旁放置放射显影标尺（图2A）。
- 将准备好的小鼠放回饲养笼中，与母鼠一同等待后续手术操作。
2. 手术用品和无菌工作区域的准备
- 将以下物品进行高压灭菌：10-20 块纱布垫、棉签涂抹棒、牙科车针（直径 0.5 mm）、牙科手机、格拉夫镊、弯蚊式止血钳、弯精细剪刀、持针器、牙周探针以及牙科 Cleoid-Discoid 雕刻刀。
- 准备其他必要的无菌用品：布托啡诺注射混悬液、20 G 针头、1 mL 注射器、无菌毛巾单、5-0 无染色编织涂层薇乔缝线、聚维酮碘、磷酸盐缓冲盐水、酒精消毒片、#15 手术刀片、外科手套、环境表面屏障保护套管、眼用润滑剂、70% 乙醇喷雾。启动玻璃珠灭菌器，用于手术过程中对器械的额外灭菌，并打开置于带有灭菌垫料的洁净小鼠笼下的电热板。
- 使用 70% 乙醇清洁并灭菌荧光体视显微镜载物台、邻近表面及手术器械架。用无菌毛巾单覆盖这些将作为手术操作区域的表面。
- 组装电动高速牙科钻系统。将电子脚踏控制器连接至控制单元，并用已消毒的表面屏障保护套管覆盖手机导线。安装无菌的 0.5 mm 圆形牙科车针。打开控制器，设置传动比为 1:1，最高速度为 30,000 rpm。
- 用胶带将异氟烷麻醉机的柔性导管固定在荧光体视显微镜载物台上，导管末端为鼻罩，鼻罩外覆盖已消毒的表面屏障保护套管。
- 开启荧光体视显微镜及相关辅助设备，并打开图像采集软件。
图 2：三系荧光报告小鼠生长板损伤实验的关键步骤。（A）在X射线柜中将放射不透性标尺与小鼠并排放置，通过Faxitron X射线成像测量胫骨长度。（B）在荧光体视显微镜下进行手术时，麻醉后小鼠的正确体位。黑色箭头指示近端胫骨位置。（C）为暴露生长板所作切口的示例。（D）荧光体视显微镜下照亮生长板肥大区（白色箭头）。相邻的增殖区由黄色箭头指示。（E）外科医生在明视照明下将0.5 mm牙科钻头接触生长板的操作示例。（F）在荧光体视显微镜引导下，将牙科钻头精确置入肥大区。（G）类Salter-Harris II型生长板缺损的示例（白色箭头）。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 近端胫骨生长板损伤造模操作
- 将小鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉，调节异氟烷浓度至2-3%，氧气流速为1 L/min。通过脚趾夹捏试验及呼吸模式观察，确认小鼠进入深度麻醉状态。
- 从小鼠取出后立即皮下注射规定剂量一半的丁丙诺啡。缓释型丁丙诺啡的给药剂量为每只小鼠3.25 mg/kg。
- 涂抹眼用润滑剂以保护小鼠术中眼睛免于干燥，并将小鼠以仰卧位转移至体视显微镜载物台上的异氟烷面罩装置（图2B）。调节面罩中的麻醉气体流速为2%，氧气流速为1 L/min。
- 依次使用聚维酮碘和70%乙醇对右后肢、骨盆区域、左后肢前侧及尾部进行消毒，以确保手术过程中的无菌状态，并最大限度降低手术部位或操作过程中因接触动物而引起的污染或感染风险。
- 在手术开始前，再次通过脚趾夹捏试验和呼吸模式观察，确认麻醉深度持续稳定。
- 在强光照明下，使用#15手术刀在右膝关节稍下方的皮肤做一初始长度约5 mm的切口，以暴露右侧胫骨近端（图2C）。必要时可用剪刀延长切口。保持左侧对侧胫骨不受损伤，作为内部未损伤对照。
- 使用#15手术刀的背面在胫骨近端覆盖的肌肉上进行纵向钝性分离，清除软组织以充分暴露生长板。
- 关闭手术室灯光，选择正确的荧光通道以照射目标生长板区域。成像各荧光胶原所需的滤光片组如下：Col 2 Cyan：ET436/20x（激发），ET480/40 m（发射）；Col 10 mCherry：ET577/20x（激发），ET640/40 m（发射）；Col 1 Topaz：ET500/20x（激发），ET535/30 m（发射）。调整小鼠位置以观察胫骨近端生长板（图2D）。轻微调整皮肤切口位置，先更近端、再稍远端，确保观察到的是胫骨生长板而非股骨生长板。
- 通过显微镜目镜观察，在肥大区生长板中部将0.5 mm牙科钻头平行于胫骨轴线放置，采用外侧入路方式制造类似Salter-Harris II型损伤（图2E、F）。为可重复地制造模拟Salter-Harris II型损伤的缺损，请保持肢体与工作台面平行，使钻头进入路径不会倾斜进入骨骺。踩下钻机踏板启动钻头旋转，并轻柔地将钻头压入生长板，深度不超过钻头直径（图2G）。
注意：由第二人协助稳定小鼠肢体将有助于操作。 - 使用一滴无菌PBS冲洗损伤部位，清除任何碎屑。
- 使用牙周探针确认缺损深度为0.5 mm。
4. 损伤后操作与关闭
- 为进行零时点缺陷表征，在组织闭合前采集受伤的后肢和对照侧肢体。按照第6节中的说明进行后续的显微计算机断层扫描（microCT）和冷冻组织学成像所需的组织取材与制备。
注意：对于在生长板缺损中植入治疗物质的实验，该缺损本身仅能容纳一个大致呈球形、直径为0.5 mm或体积为0.082 mm3（0.082 µL）的生物材料。 - 在显微镜下使用镊子将生物材料插入生长板缺损处，或向缺损内注射液态治疗剂。若实验设计不要求治疗物质仅限于缺损区域，则可使用更大体积的生物材料或注射物。
- 仔细对齐皮肤边缘，确保植入材料（如有）牢固保留在缺损部位内。
- 采用5-0聚乙醇酸缝线进行间断缝合，有效闭合皮肤切口。
- 使用无菌水浸湿的棉签彻底清除手术区域以外残留的聚维酮碘，操作时注意避免接触伤口及其周围邻近区域。
- 将小鼠从显微镜载物台上的异氟烷鼻罩移至恢复笼，侧卧置于加热垫上新鲜的垫料中。
- 密切观察小鼠呼吸频率约5分钟，在异氟烷麻醉作用即将消退（表现为呼吸频率增加）、但尚未出现活动能力前，给予剩余剂量的丁丙诺啡以实现镇痛。将小鼠保留在独立的恢复笼中，直至其完全恢复自主行走能力，之后将其归还母鼠及同窝幼鼠。
- 术后最初48小时内每日检查，随后每周评估一次，直至实施安乐死。重点关注感染迹象、运动能力、取食情况以及缝线完整性。
- 在标准时间（即3周龄）对小鼠进行断奶。
5. 肢体长度测量
- 根据实验假设和设计确定的时间点，使用异氟烷麻醉小鼠，并对受伤和未受伤的胫骨全长进行X射线成像，如图2A所示，并参见第1.4节描述。用于进行一致肢体长度测量的合适解剖标志包括胫骨骨骺顶端以及胫距关节处胫骨远端末端，如图3所示。
注意：成像用于评估因损伤导致的肢体长度及肢体长度差异，以及术后特定时间点生长板组织内骨桥的形成情况。
6. 组织解剖、固定、显微CT成像与包埋
- 通过 CO₂ 安乐死小鼠2 窒息法处死，优先使用自动化的CO₂2 通过颈椎脱位等替代方法确认死亡的诱导系统。
- 分离完整的后肢，去除骨骼及膝关节囊区域的皮肤和肌肉，以备组织学和显微CT分析。
- 在将后肢放入固定液之前，使用显微解剖剪小心地切除髌骨，以促进固定液渗入膝关节腔。采用29 G胰岛素注射器将冰冷的10%磷酸盐缓冲甲醛溶液充分注入膝关节腔的各个区域。切断股骨和胫骨的骨干部分，以增强固定液对骨髓腔的渗透。将关节组织保持在完全伸展的状态下，置于固定液中固定24–36小时 4 °C 用纱布将它绑在一根细杆上。
警告：甲醛具有毒性，应在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备。
- 在将后肢放入固定液之前，使用显微解剖剪小心地切除髌骨，以促进固定液渗入膝关节腔。采用29 G胰岛素注射器将冰冷的10%磷酸盐缓冲甲醛溶液充分注入膝关节腔的各个区域。切断股骨和胫骨的骨干部分，以增强固定液对骨髓腔的渗透。将关节组织保持在完全伸展的状态下，置于固定液中固定24–36小时 4 °C 用纱布将它绑在一根细杆上。
- 在福尔马林固定 24-48 小时后 4 °C将样本转移至PBS后，通过显微CT成像对对侧及损伤样本进行高分辨率X射线显微CT扫描，以评估骨桥形成情况。使用 体素大小 的 6.0 µm, 采样时间 的 330,000 毫秒，以及 能量设置 的 55,000 V 与一个 强度 的 145 µA.
- 在进行 microCT 成像以及额外 24 小时的甲醛固定后 4 °C，用1×PBS冲洗样本，每次5分钟，共3次；然后将样本分别浸入含10%蔗糖的1×PBS中1小时、含20%蔗糖的1×PBS中1小时，以及含30%蔗糖的1×PBS中过夜。使用装有蔗糖溶液的29 G胰岛素注射器，确保蔗糖溶液渗透至膝关节腔的所有区域。转移至-80 °C 若未在蔗糖溶液中浸泡过夜后立即进行包埋，应将样本保存于冷冻器中，以确保GFP报告基因及组织酶活性的保留。
- 在包埋前去除关节区域的任何残留肌肉组织。将样本用冷冻包埋介质平衡过夜，以促进介质渗透至膝关节腔内。
- 观察 microCT 图像，以确定包埋前缺损和骨桥的位置。在冷冻模具中加入一层薄薄的冷冻包埋介质，将解剖后仍保持连接的胫骨/股骨/关节放置于其中，使感兴趣区域朝向 90° 包埋介质的表面。
注意：此方向可确保切片捕获到侧方创建缺损的侧面观。若骨性桥接位于缺损边缘附近，则此方向还可避免在对组织进行初始较厚切片时遗漏目标区域。 - 将冷冻模具置于干冰上，直至冷冻包埋介质凝固并固定住样本。在保持冷冻模具处于干冰上的同时，继续向其中添加包埋介质至充满。
- 固定样本后，将冷冻模具浸入用干冰预冷的2-甲基丁烷中，直至完全冻结。冷冻完成后，除去多余的2-甲基丁烷，用玻璃纸包裹冷冻模具，并于-20 °C 或 -80 °C.
注意：若在冷冻包埋介质中长期保存超过1-2个月，-80 °C 建议采取措施以防止干燥。有关胶带辅助冷冻切片及切片黏附至载玻片的方法，此前已有描述。23.
7. 连续成像、染色与重新成像
- 采用成像、染色和再成像的顺序步骤，以促进在同一组织切片中检测和共定位多种生物信号，具体方法如先前所述23。针对三色胶原报告小鼠的生长板切片，建议执行以下步骤。这种有序的方法可确保对分子信号和结构细节进行全面可视化。
- 首先，在第一轮成像中捕获三种胶原蛋白的内源性荧光信号。
- 进行钙黄绿素蓝染色并成像以显示矿化组织23，随后进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）酶活性染色及成像23。
注：尽管此处未展示TRAP酶活性染色结果，但该染色步骤仍需执行，因其在进行代表性结果部分所示的番红O/快绿染色前，对去除矿化物质至关重要。 - 按照下述方法进行4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色，然后进行成像。
- 将已完成前期成像的载玻片放入盛有1×PBS的柯林瓶中，浸泡至盖玻片从载玻片上脱落。脱落后取出盖玻片并彻底干燥。
- 在盖玻片上滴加DAPI复染溶液，使用DAPI以1:1,000比例稀释于50%甘油与1×PBS混合液中的工作液。加样后立即进行成像。
- 最后应用番红O/快绿染色以突出组织结构，然后进行成像。
注：将此步骤作为最终步骤，以便将显色图像与荧光信号进行关联。- 配制Weigert铁苏木精溶液。溶液A：将1 g苏木精溶解于100 mL 95%乙醇中；溶液B：将4 mL 29%氯化铁溶液、95 mL去离子水和1 mL浓盐酸混合。将等体积的溶液A与溶液B混合，得到Weigert工作用铁苏木精溶液，该溶液在约4周内保持稳定。
- 将载玻片浸入去离子水中，每次2分钟，共2次，以充分水化。
- 加入Weigert工作用铁苏木精溶液染色5分钟。
- 用自来水冲洗载玻片5分钟，再用去离子水短暂冲洗1分钟。
- 用0.2%快绿溶液（0.2 g快绿FCF溶于100 mL去离子水中）染色2分钟。
- 用1%乙酸短暂冲洗1分钟。
- 用0.1%番红O溶液（0.1 g番红O溶于100 mL去离子水中）染色1分钟。
- 用去离子水冲洗至颜色视觉平衡，约5分钟。
- 将载玻片封片于含30%甘油的去离子水中（避免使用PBS），并立即进行成像，以防止组织中染料扩散。如需突出显示生长板静止区细胞，请使用Cy5滤光片进行成像：ET640/30x（激发），ET690/50 m（发射）。
结果
本实验方案利用三系荧光报告小鼠，通过X型胶原蛋白固有的红色荧光实现手术引导，从而在胫骨近端生长板上精确诱导侧向缺损。外科医生通过体视显微镜目镜并使用mCherry滤光片观察时的视野如图2D所示。内源性X型胶原荧光使外科医生能够将磨钻准确定位于肥大区，从而制造出一种可模拟临床常见生长板损伤的骨性桥接模型（图2F）。在红色通道下，该荧光信号最强，因此推荐在磨钻定位过程中使用此通道。此外，若实验目的为研究生长板其他区域（非肥大区及其邻近钙化区）的损伤，也可利用三重转基因小鼠其他颜色的内源性荧光来引导缺损的建立。
使用直径为 0.5 mm 的牙科钻头在生长板肥大区及相邻的下部骨组织中创建类似Salter-Harris II型的缺损，并通过显微CT和冷冻组织学成像对N = 3只小鼠的损伤侧（0时间点）近端胫骨与未损伤的对侧对照进行验证（图4）。该缺损在三维显微CT图像中难以观察，但在二维横截面中可被识别（图3A、B、E、F）。图3G展示了I型胶原生成性成骨细胞（绿色荧光）、II型胶原生成性增殖软骨细胞（青色荧光）以及X型胶原生成性肥大软骨细胞的分布情况。在损伤小鼠的图像中（图4G），肥大区、初步钙化层以及部分最新形成的骨组织出现中断，而增殖区仅受到轻微扰动。藏红O/快绿染色（图4H）最能清晰显示缺损在损伤生长板中的具体位置，因为所有细胞均清晰可见。
X射线分析为活体小鼠中此类生长板损伤对胫骨长度及随时间推移骨性桥形成的影响提供了一定的见解(图3)。术前及术后3周获取的未损伤(图3A)与损伤后(图3B)胫骨的对比影像显示，肢体有显著生长，生长板变薄，并在术后3周时于损伤生长板区域形成明显的不透X线区域。该生长板内的不透X线影在未损伤侧及术前小鼠中均不存在。因此，Faxitron是观察活体小鼠因损伤所致病理变化（如骨性桥形成及肢体长度变化）的一种方法。
术后3周，对离体骨骼进行显微CT成像，可清晰显示损伤生长板内骨性桥接结构的形成(图5)。如图5所示的六只不同受伤小鼠的图像所示，所有小鼠均出现一致的骨性桥接结构。通过使用Scanco Medical软件，对近端胫骨生长板的每一断层图像进行分析，利用选择工具勾画出骨性桥接区域(图5B)，随后将整个生长板体积内各断层的面积进行积分，从而计算出骨性桥接的总体积24。按此方法计算的骨性桥接体积为0.0761 mm3 ± 0.0246（均值 ± 标准差，N = 6）。尽管手术采用的是侧方入路，损伤了生长板的外缘及中心区域，但大部分骨性桥接结构仍主要在生长板中部形成。这一现象可归因于骨性桥接的形成主要由骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）而非软骨膜来源的细胞所介导25。
在这些三色转基因小鼠中，通过天然胶原荧光可增强对受损生长板的冷冻组织学分析(图6)。该方法揭示了损伤部位骨细胞与软骨细胞之间复杂的相互作用。为指导包埋与切片操作，已向组织学技术人员提供图6J、K所示的显微CT图像。产生I型胶原的骨细胞可见于图6L、O、P（绿色荧光），而产生II型胶原的增殖性软骨细胞可见于图6L、O、Q（青色荧光）。产生X型胶原的肥大软骨细胞可见于图6L、O、R（红色荧光）。这种多色荧光方法能够在矿化组织背景下，对术后骨桥区域内的软骨细胞分化进行详细观察。DAPI染色用于确认所有细胞类型在生长板区域内的分布情况(图6M)。番红O/快绿染色则展示了受损生长板内软骨与骨的组成及结构排列(图6N)。使用Cy5滤光片对这些染色切片进行成像时，明显增强了骺端骨与软骨交界处静息区细胞的信号亮度。
图3对侧对照和损伤小鼠胫骨的X射线图像。 (A在小鼠2周龄时（术前）及5周龄时（术后3周）拍摄对侧对照胫骨的X射线图像，以显示此期间内骨骼的生长程度。B同一时间点取自同一只小鼠的受伤胫骨，如图（A）。胫骨长度测量所用的解剖标志为胫骨近端头部顶点至踝关节处胫骨远端末端（红色双头箭头）。在损伤的近端胫骨生长板中，5周时可见不透X线的骨桥。比例尺 = 5.00 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：时间零点对侧对照与损伤小鼠近端胫骨的显微CT及组织学图像。（A,E）和（B,F）显示三维及横断面二维显微CT视图，其中（E）和（F）中的缺损由红色箭头指示。（C,G）复合融合的冷冻组织学图像，将三个固有荧光层与一个矿化组织层合并。绿色细胞（Col3.6GFPtpz）为产生I型胶原的成骨细胞，青蓝色细胞（Col2A1GFPcyan）为产生II型胶原的增殖性软骨细胞，红色细胞（Col10A1RFPchry）为产生X型胶原的肥大软骨细胞。（D,H）与（C）和（G）相同区域的藏红O/快绿染色。比例尺 = 1.0 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：本实验方案形成的骨桥的显微CT图像。（A,C,E,G,I,K）在钻孔损伤造模后3周，六只不同小鼠胫骨近端生长板的横截面图像。骨桥在（A）中以红色虚线标出。（B,D,F,H,J,L）纵向切去一部分后的三维重建图像。骨桥在（B）中以红色虚线标出。比例尺 = 1.0 mm。请点击此处查看该图的高清版本。
图6：对侧对照及损伤小鼠近端胫骨形成骨桥的MicroCT与组织学图像。 （A,J）和（B,K）显示三维及横断面二维MicroCT视图，其中（J）和（K）中的黄色箭头指示骨桥位置。（C,L）融合了三个内源性荧光层与矿化组织层的复合共聚焦冷冻组织学图像。绿色细胞（Col3.6GFPtpz）为产生I型胶原的成骨细胞，青蓝色细胞（Col2A1GFPcyan）为产生II型胶原的增殖性软骨细胞，红色细胞（Col10A1RFPchry）为产生X型胶原的肥大软骨细胞。白色框表示在图 F 和 O 中放大的区域。（D,M）图 C 和 L 中生长板区域的矿化组织与DAPI染色。（E,N）与（D）和（M）相同区域的番红O/快绿染色，并用Cy5荧光扫描。（F,O）图 C 和 L 合并图像中生长板区域的更高倍放大视图。（G-I,P-R）在矿化组织背景下的各内源性荧光单通道图像。比例尺 = 1.0 mm（A-E）和（J-N），= 250 µm（F-I）和（O-R）。 请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
三色胶原报告基因小鼠的创新应用能够以预设的大小和位置构建生长板缺损，显著提高了小鼠生长板损伤实验模型的准确性。由于2周龄小鼠体型较小，必须使用0.5 mm的微型磨钻来制造损伤，以避免削弱肢体并导致全层骨折。外科医生在制造缺损时也需施加适当的压力，以免钻入骨内过深，原因同上。使用perioprobe对于确认一致的损伤深度至关重要。
与任何手术一样，必须确认麻醉深度足够，可通过偶尔捏压脚趾来验证，且整个过程中需保持无菌状态。另一个重要的手术要点是，建议使用解剖刀进行钝性分离，因为这种方法可避免损伤软组织，并有助于确保小鼠在麻醉恢复后能够立即行走，以接近母鼠获取营养和安慰。根据我们的经验，使用缝线闭合的伤口均成功愈合，无需使用伤口夹。建议在小鼠2周龄时进行手术，以最好地模拟经历骨骺板骨折的幼儿情况。该方案的一个缺点是，由于分娩时间不可预测，使用此小鼠模型要求外科医生能在短时间内随时到位。
关于钻头定位以制造缺损，该方案描述了使用mCherry/Texas red滤光片组来创建损伤，该滤光片组可因X型胶原荧光较强而照亮生长板内的肥大区。为确保损伤位于胫骨生长板内，可轻微左右移动软组织切口，以确认视野中为近端胫骨生长板而非股骨。在滤光片组通道之间切换，以照亮增殖软骨细胞区或邻近骨组织区域，有助于确认操作位置相对于增殖区及邻近骨组织的准确性。
尽管在活体小鼠中可通过荧光显微镜区分增殖性软骨细胞区以及骨骺和干骺端骨组织，但II型和I型胶原报告基因的真实价值主要体现在生长板的组织学分析过程中。由于冷冻组织学处理具有水相特性，传统的显色染料沉淀方法因脱水步骤可能导致显色与荧光成像位置不匹配而不适用。尽管水相染色方案产生的染色模式与石蜡切片相似，但染色后必须尽快成像，以防止染料从组织中扩散。使用含30%甘油的蒸馏水作为封片介质可减缓染料扩散，从而允许在同一组织切片上进行多次显色染色，包括使用番红O/快绿对软骨染色。
软骨内成骨过程清晰可见，红色的软骨细胞排列在正在形成的骨桥周围（图6）。结合使用免疫组织化学技术（已有多种适用于小鼠的抗体可供选择），可进一步增强在此类转基因小鼠中开展的机制性研究。综上所述，在该转基因小鼠模型中联合应用Faxitron、显微CT和冷冻组织学成像技术，能够全面揭示生长板损伤后所发生的宏观与微观变化，为未来开发减轻此类不良后果的治疗干预手段奠定基础。进一步对这些转基因小鼠进行遗传学改造，可实现谱系示踪研究，以明确在修复过程中时空动态参与的细胞来源。对具有额外基因修饰的小鼠开展实验，将有助于研究软骨相关疾病，例如骨软骨瘤——一种发生在生长板附近的软骨和骨组织过度增生疾病。
本模型的一致性体现在所有小鼠均能可重复地形成骨性桥接，且无需因关节软骨损伤而剔除任何小鼠。相较于以往的模型，本模型具有改进意义：既往模型通过生长板下方的皮质骨开窗，将锐器或磨头向上斜向接近生长板，偶尔会穿透进入关节软骨。而关节软骨的额外损伤并不能模拟儿童中常见的生长板损伤。本动物模型的损伤更为精确，减少了每次实验所需的小鼠数量，这是另一项改进。使用转基因小鼠可使研究人员将损伤精准定位在生长板的特定亚区，例如肥大层/暂时钙化区，或骨骺/静止区/增殖区，而不影响关节软骨。然而，该模型的一个局限性在于骨性桥接体积存在变异，不同受伤动物之间的体积差异可达30%。因此，要检测对骨性桥接形成具有临床意义的影响，仍需使用较大量的动物以达到统计学显著性。
与先前发表的大鼠或兔生长板损伤模型相比，此处所述的小鼠模型具有多项优势7,9,10,14，包括所需实验动物数量更少、成本降低、由于骨性桥形成具有良好的可重复性而实现高效的重复样本量、研究周期更短，以及因对三重转基因小鼠进行活体成像而实现更精确的损伤定位。尽管未详细讨论，该小鼠模型还可用于测试组织工程植入物或递送生长因子的生物材料。此小鼠方法的一个显著局限性在于，用于递送治疗性药物或细胞的植入物尺寸受限于约直径0.5 mm的球形缺损体积，仅较大的动物模型才能容纳临床上拟用于人类患者的测试材料体积。本方案中制造的钻孔缺损与实际人类常见的薄层骨折在几何形态上并不相同，因此与真实的人类损伤存在差异。然而，该小鼠模型优势显著，且采用侧向入路可避免损伤关节软骨，而若沿胫骨长轴方向在生长板上下盲穿进针则可能造成此类损伤。该方法代表了生长板损伤研究领域的重要进步，为深入探究病理机制及评估新型治疗策略提供了详尽且可重复的技术路径。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院下属的国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）基金（项目编号：1R21AR079153）以及康涅狄格大学研究增强计划（REP）基金的资助。作者谨此感谢康涅狄格大学MicroCT成像中心的Renata Rydzik提供的技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-甲基丁烷 | Sigma Aldrich | M32631 | |
| 酒精消毒片 | Acme United Corporation | H305-200 | |
| Axio Scan.Z1 | 卡尔·蔡司股份公司 | Axio Scan.Z1 | |
| AxioVision 软件 | 卡尔·蔡司股份公司 | ||
| 聚维酮碘溶液（10%） | Avrio Health L.P. | 67618-150-01 | |
| 钙黄绿素 | Sigma Aldrich | C0875 | |
| 钙黄绿素蓝 | Sigma Aldrich | M1255 | |
| CFP滤光片组 | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| Cryomatrix | 赛默飞世尔科技 | 6769006 | |
| 冷冻模具 | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | |
| 冷冻切片机 | Leica Biosystems | 3050s | |
| 冷冻切片机刀片 | 赛默飞世尔科技 | 3051835 | |
| Cryotape | 实验部分 | Cryofilm 2C | |
| 弯头精细剪刀 | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| 弯头蚊式止血钳 | HuFriedyGroup | H3 | |
| Cy5滤光片组 | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| DAPI | 赛默飞世尔科技 | 62247 | |
| DAPI滤光片组 | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| 牙科钻头（0.5 mm 直径） | |||
| 牙科凿形盘状雕刻器 | ACE Surgical Supply Inc. | 6200097A-EA | |
| 干式玻璃珠灭菌器（Inotech Steri 350） | Inotech Bioscience, LLC | IS-250 | |
| 耳标打孔 | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| 电加热垫 | |||
| 电子脚踏控制器 | Nouvag AG | 1866nou | |
| 电子马达 31 ESS | Nouvag AG | 2063nou | |
| 环境表面屏障（3 x 12英寸管状护套） | Patterson Companies, Inc. | BB-0312H | |
| 乙醇（70%） | |||
| Ethiqa XR（缓释注射用布托啡诺混悬液）1.3 mg/mL | 菲德利斯动物健康 | 86084-100-30 | |
| Faxitron X射线柜 | Kubtech Scientific | 参数 | |
| 荧光体视显微镜 | 卡尔·蔡司股份公司 | Lumar V12 | |
| GFP滤光片组 | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| 冰醋酸 | Sigma Aldrich | ARK2183 | |
| 玻璃显微镜载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 3051 | |
| 甘油 | Sigma Aldrich | G5516 | |
| 格拉夫镊子 | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| 手机（32:1 减速比直角手机，按钮式） | Nouvag AG | 5201 | |
| 种植学/口腔外科系统控制单元（Straumann） | Nouvag AG | 扫描电子显微镜 | |
| 带有内外双效过程指示剂的即封灭菌袋（3 1/2 x 5 1/4） 英寸 | Fisher Scientific | 01-812-50 | |
| 双面过程指示剂快速封口灭菌袋（5 4/1 x 10 英寸） | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| 胰岛素注射器（29 G） | Exel International | 26028 | |
| 异氟烷 | 德克拉制药公司 plc | 17033-091-25 | |
| 异氟烷麻醉系统 | |||
| mCherry滤光片组 | Chroma Technology Corp. | 39010 | |
| 显微解剖剪 | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| NaHCO₃3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| 针头（20 G） | Becton, Dickinson and Company | 305178 | |
| 持针器 | HuFriedyGroup | NHCW | |
| 中性缓冲甲醛（10%） | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| 非无菌涂抹棒 | Allegro Industries | 205 | |
| 无纺纱布（3 x 3 英寸） | Fisher Scientific | 22028560 | |
| Norland光学胶，61 | 诺兰德光学 | Norland光学胶，61 | |
| 眼用软膏（Optixcare 眼部润滑剂） | CLC Medica | ||
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | |
| 牙周探针 | HuFriedyGroup | PQW | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4（1×） | Gibco，隶属于 Life Technologies | 10-010-023 | |
| 塑料显微镜载玻片 | 电子显微镜科学公司 | 71890-01 | |
| 专业理发剪/修边器（Wahl Classic Peanut） | Wahl Clipper Corporation | 8685 | |
| 滚轴 | 电子显微镜科学公司 | 62800-46 | |
| Scanco Medical 软件 | SCANCO Medical | Scanco μCT 50 | |
| 无水乙酸钠 | Sigma Aldrich | S2889 | |
| 亚硝酸钠 | Sigma Aldrich | S2252 | |
| 酒石酸钠二水合物 | Sigma Aldrich | T6521 | |
| 样品圆盘 | Leica Biosystems | 14037008587 | |
| 不锈钢#15手术刀片 | Aspen Surgical Products, Inc. | 371615 | |
| 无菌外科手套 | Cardinal Health, Inc. | 2D72PT65X | |
| 无菌毛巾单（18 x 26 英寸） | IMCO | 4410-IMC | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S9378 | |
| 1 mL注射器 | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 未染色编织涂层薇乔缝线（5-0） | Ethicon Inc. | J490G | |
| 紫外黑光 | 通用电气 | F15T8-BLB |
参考文献
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