评估C3和C4植物叶片横切面之间的解剖学差异有助于理解光合作用效率。本文介绍了小麦（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）这两种作物物种的徒手切片和半薄叶片横切片的制备与观察方法，并阐述了制备过程中需要注意的事项。
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方法文章
评估利用徒手切片和半薄切片技术对小麦（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）中C3与C4光合作用差异的结构特征
本文内容
摘要
摘要
与C3光合作用机制相比，C4光合作用效率的提高源于其在维管束鞘细胞中浓缩CO2的能力。C4光合作用的有效性以及内在水分利用效率，直接与叶肉细胞和维管束鞘细胞的比例、 维管束鞘的大小和密度，以及维管束鞘细胞的大小、密度和细胞壁厚度相关。利用常规光学显微镜对徒手切片和半薄切片进行快速显微分析，可鉴定并观察特定细胞类型，从而获得有关C4作物光合效率的有价值信息。此外，本文还展示了在徒手切片和半薄切片制备过程中可能影响解剖学测量和细胞类型判断的常见错误，并说明了如何避免这些错误。该显微分析方法为研究光合作用对环境变化的适应性提供了高效手段，同时有助于对未来气候条件下的作物进行快速筛选。
引言
光合作用是一种将光能转化为化学能的基本过程，是陆地营养网络的基础。大多数植物采用C3光合途径，其主要光合产物为三碳化合物3-磷酸甘油酸。C3光合作用在20多亿年前演化形成，当时大气中CO2浓度较高而O2浓度较低1。在这种环境下演化而来的关键光合酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco），在当前低CO2高O2的条件下表现欠佳，因其会与O2发生竞争性反应，从而启动光呼吸过程2。光呼吸是一种消耗能量而非产生能量的浪费性代谢途径，并以释放CO2作为副产物。因此，维持叶绿体中Rubisco周围的高CO2浓度以防止加氧反应至关重要3,4。由于C3植物无法浓缩CO2，从环境空气到叶绿体之间存在显著的CO2浓度下降，限制了光合作用，影响植物生长和生物量积累2,5,6。
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方案
1. 植物生长条件
- 选择小麦（Triticum aestivum L. 变种 冬小麦 "弗雷迪斯"）和玉米（玉米（Zea mays） L. var. saccharata "金黄矮秆玉米"）作为代表性 C3 和 C4 分别种植这两种植物。将两种植物的种子置于环境可控的生长室中进行培养。
- 将相对湿度维持在55%，气温控制为25 °C/18 °C（昼/夜），光照周期为12小时。植物表面的光合光子通量密度（Q）维持在1200 µmol/m²/s。2/s 以模拟其自然生长条件。所有植物均在环境温度下培养，CO2 400 µmol/mol 的浓度
- 每2天给植物浇水一次nd 用蒸馏水浇灌，并在幼苗出土10天后施用霍格兰营养液。在指定条件下培养植物60天，取完全展开的叶片用于显微分析。
2. 徒手切片的制备与观察
- 从每株植物中选取3片成熟且未衰老的叶片，并将其保存在蒸馏水中。使用新的单面剃须刀片，进行一次水平切割，使切面与叶片表面呈直角，以确保获得垂直于叶片表面的横切面。
- 将叶片样本置于涂有牙科蜡的玻璃板上，以固定样品并防止滑动....
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结果
图1A展示了叶片切片的正确取向，适用于新鲜切片和光学显微镜观察。使用单面刀片和牙科蜡板切割新鲜切片的方法见图1B。所得切片如图1C所示。
图2展示了C3植物T. aestivum和C4植物Z. mays代表性叶片的徒手切片。维管束鞘细胞在叶脉周围清晰可见，其中玉米的细胞更圆且颜色更绿，表明其叶绿体含量更高。通过这些图像可以测量叶片厚度和维管束鞘的总面积；然而，该方法无法对叶肉组织进行进一步表征。
图3展示了T. aestivum和Z. mays的半薄横切面。通过该方法，叶片的所有组织均清晰可见且可测量。Z. m.......
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讨论
本文讨论了测量叶片解剖结构的定量与定性方法，以及这些方法的优化途径。此外，本研究方法还应用于代表性作物物种，以确定哪些解剖特征在区分C3和C4横切面时最为有效。理解这些特征至关重要，因为被称为C2光合作用的杂交类型正成为更具前景的研究方向。截至目前，仅有一种作物物种Diplotaxis tenuifolia（芝麻菜）被确认具有C2光合作用，但实际存在的种类可能多于现有记录25。C2类群内部表现出较高的种内光合多样性与可塑性，这意味着确认C2光合作用的存在需要多方面的证据支持，例如CO2补偿点测定、超微结构分析以及免疫组织化学技术30。
徒手切片和半薄切片已用于鉴定和测量特定植物组织多年，但本文旨在讨论其在解剖学叶片结构中的特定应用，这些结构影响 C3 和 C4 作物植物之间的.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢欧盟H2020计划（项目GAIN4CROPS，资助编号862087）。卓越中心AgroCropFuture——未来气候下的农业生态与新型作物，由爱沙尼亚教育与研究部资助。我们感谢Evelin Loit-Harro教授提供普通小麦（T. aestivum）和玉米（Z. mays）种子，感谢Paula Palmet和Vaiko Vainola在制备叶片横切面过程中提供的帮助，以及João Paulo de Silva Souza在分析工作中的协助。所有图像均来自爱沙尼亚生命科学大学显微技术平台在不同项目中获得的结果。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二水合磷酸氢二钠（Na2高倍物镜42H2O) 纯 | PENTA, CZ | 10028-24-7 | |
| 包埋膜，7.8 mil 厚，8 x 12.5（203 x 318 mm） | ACLAR，美国 | 10501-10 | |
| 乙醇，abs. 100% a.r. | Chem-Lab NV, BE | CL00.0505.1000 | 危险：高度易燃的液体和蒸气。 |
| EVOS Invitrogen FL Auto 2 成像系统 | Thermo Fisher Scientific，美国 | ||
| 带金属框的16孔平嵌聚四氟乙烯模具 | PELCO，美国 | 10501 | |
| 2 ml 玻璃小瓶 | VWR生命科学，美国 | 548-0045 | |
| 戊二醛 50% 溶液 | VWR Life Science，美国 | 23H2856331 | 危险：吸入致命。吞咽有毒。造成严重皮肤灼伤和眼睛损伤。可能引起呼吸道刺激。佩戴防护手套、防护服、眼面部防护装备。 |
| Histo金刚石刀 | Diatome, 美国 | ||
| LEICA EM UC7 | Leica 维也纳，奥地利 | ||
| LR White树脂硬质型号 | Electron Microscopy Sciences，美国 | 14383 | 危险：引起皮肤刺激。引起严重眼刺激。可能引起呼吸道刺激。可能引起困倦或头晕。佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护。 |
| 显微镜载玻片 | Normax, PT | 5470308A | |
| Nikon Eclipse E600 和 Nikon DS-Fi1 5 MP | 尼康公司，日本 | ||
| 四氧化锇（OsO₄）4) | Agar Scientific Ltd, GB | R1019 | 危险：吞咽、皮肤接触或吸入会致命。造成严重皮肤灼伤和眼睛损伤。佩戴双层防护手套、防护服及眼睛和面部防护装备。 |
| 移液器和移液器吸头 | 赛默飞世尔科技，FI | KJ16047 | |
| 磷酸二氢钠二水合物（NaH2PO4 . 2H2O) 纯 | PENTA, CZ | 13472-35-0 | |
| 10 ml 注射器 | Ecoject, DE | 20010 | |
| 甲苯胺蓝，通用级 | Fisher Scientific，英国 | 2045836 |
参考文献
- Erb, T. J., Zarzycki, J. A short history of RubisCO: the rise and fall (?) of Nature's predominant CO2 fixing enzyme. Curr Opinion Biotechnol. 49, 100-107 (2018).
- Smith, E. N., et al. Improving pho....
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