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评估利用徒手切片和半薄切片技术对小麦（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）中C3与C4光合作用差异的结构特征

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DOI：

10.3791/66843

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2024年7月12日

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

本文内容

摘要

评估C3和C4植物叶片横切面之间的解剖学差异有助于理解光合作用效率。本文介绍了小麦（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）这两种作物物种的徒手切片和半薄叶片横切片的制备与观察方法，并阐述了制备过程中需要注意的事项。

摘要

与C3光合作用机制相比，C4光合作用效率的提高源于其在维管束鞘细胞中浓缩CO2的能力。C4光合作用的有效性以及内在水分利用效率，直接与叶肉细胞和维管束鞘细胞的比例、 维管束鞘的大小和密度，以及维管束鞘细胞的大小、密度和细胞壁厚度相关。利用常规光学显微镜对徒手切片和半薄切片进行快速显微分析，可鉴定并观察特定细胞类型，从而获得有关C4作物光合效率的有价值信息。此外，本文还展示了在徒手切片和半薄切片制备过程中可能影响解剖学测量和细胞类型判断的常见错误，并说明了如何避免这些错误。该显微分析方法为研究光合作用对环境变化的适应性提供了高效手段，同时有助于对未来气候条件下的作物进行快速筛选。

引言

光合作用是一种将光能转化为化学能的基本过程，是陆地营养网络的基础。大多数植物采用C3光合途径，其主要光合产物为三碳化合物3-磷酸甘油酸。C3光合作用在20多亿年前演化形成，当时大气中CO2浓度较高而O2浓度较低1。在这种环境下演化而来的关键光合酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco），在当前低CO2高O2的条件下表现欠佳，因其会与O2发生竞争性反应，从而启动光呼吸过程2。光呼吸是一种消耗能量而非产生能量的浪费性代谢途径，并以释放CO2作为副产物。因此，维持叶绿体中Rubisco周围的高CO2浓度以防止加氧反应至关重要3,4。由于C3植物无法浓缩CO2，从环境空气到叶绿体之间存在显著的CO2浓度下降，限制了光合作用，影响植物生长和生物量积累2,5,6。

在C3植物中，光合作用受限于CO2通过气孔的进入、其在叶肉组织中的扩散以及光合酶的生物化学活性。CO2的进入首先受到气孔导度的限制，而气孔导度受空气温度和湿度等环境条件调控。随后，CO2穿过叶片内部的气相和液相，最终到达Rubisco7。在C3植物中，光合作用的所有阶段均发生在叶肉细胞的叶绿体中，植物需要维持大气中的CO2持续不断地进入叶绿体。叶绿体中CO2的可利用性依赖于气孔开放程度、叶肉结构以及单个细胞和叶绿体的特性，这使得植物容易受到最终影响光合作用的环境限制因素的影响，例如水分供应不足和高温7,8,9,10，尤其凸显了其对气候变化条件的脆弱性11。

鉴于C3途径存在的效率低下问题，以及在维持最佳CO2浓度方面的能力有限且易受环境因素影响，某些植物进化出了另一种途径，即C4光合作用途径。典型地，C4植物具有两个在空间上分离的生化途径；初始的CO2固定发生在叶肉细胞中，由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEP羧化酶）催化，该酶对CO2的亲和力高于Rubisco，且不具有加氧活性。所形成的C4产物进一步被转运至维管束鞘细胞，在其中脱羧释放出CO2，再由Rubisco固定（即C3光合作用）12,13,14。PEP羧化酶对CO2的高亲和力以及维管束鞘细胞较厚的细胞壁，使得维管束鞘细胞内CO2得以浓缩，从而C4植物通过在空间上分隔CO2固定与卡尔文循环来最小化光呼吸作用。C4途径的采用体现了自然界对环境限制的适应性响应，为提升作物在气候变化条件下的生产力与抗逆性提供了潜在策略的启示15。

C4植物叶片结构的特化解剖特征表现为：维管束周围被含有叶绿体的增大的维管束鞘细胞所包围，并且叶肉细胞呈辐射状排列，形成围绕维管束鞘细胞的外环结构。叶肉细胞与维管束鞘细胞紧密相邻，使得两种细胞之间能够快速而持续地转运代谢物。这种细胞排列方式是C4植物的典型特征，被称为花环结构（Kranz anatomy）16。在C3植物中，叶肉细胞的特化和排列方式可能有所不同，但其维管束鞘细胞明显更小，且仅含有少量叶绿体或完全不含叶绿体。特化的花环结构可使CO2在维管束鞘细胞的叶绿体中富集，而此处正是C3羧化酶Rubisco的所在位置，从而有效抑制光呼吸4, 17, 18。尽管这种结构看似复杂，但在被子植物的进化过程中，此类结构已独立出现了多次，表明这是一条相对可行的进化路径19,20,21。已有研究表明，多个分类群正处于C3与C4碳代谢之间的中间阶段，被称为C3-C4或C2类型，具备浓缩和再同化CO2的能力22,23,24,25。

许多 C4 植物是具有重要经济价值的作物，近几十年来，通过基因工程改造水稻等 C3 作物以提高其对气候变化的适应能力并保障产量，已成为研究热点26,27。然而，这些基因工程工作的推进需要对 C4 植物特有的解剖结构及其对光合作用的调控机制有深入的理解2,28。

建立C4型花环结构是实现将C4光合作用引入C3作物这一宏伟目标的前提条件25。然而，目前对花环结构发育调控机制的理解仍有限，且缺乏快速筛选其关键解剖特征的方法，这使得杂交物种的鉴定变得困难。先前的研究表明，调控C3和C4植物光合效率的关键特征包括叶脉间距离、维管束鞘复合体的直径以及维管束鞘细胞的大小14,29。这些特征可通过徒手切片进行快速筛选，并利用半薄切片进行定量分析。本文描述了一种通过徒手横切片和光学显微镜评估C3与C4解剖学差异诊断特征的方法，具体包括维管束鞘面积、叶脉间距离和叶脉频率。

方案

1. 植物生长条件

  1. 选择小麦（Triticum aestivum L. 变种 冬小麦 "弗雷迪斯"）和玉米（玉米（Zea mays） L. var. saccharata "金黄矮秆玉米"）作为代表性 C3 和 C4 分别种植这两种植物。将两种植物的种子置于环境可控的生长室中进行培养。
  2. 将相对湿度维持在55%，气温控制为25 °C/18 °C（昼/夜），光照周期为12小时。植物表面的光合光子通量密度（Q）维持在1200 µmol/m²/s。2/s 以模拟其自然生长条件。所有植物均在环境温度下培养，CO2 400 µmol/mol 的浓度
  3. 每2天给植物浇水一次nd 用蒸馏水浇灌，并在幼苗出土10天后施用霍格兰营养液。在指定条件下培养植物60天，取完全展开的叶片用于显微分析。

2. 徒手切片的制备与观察

  1. 从每株植物中选取3片成熟且未衰老的叶片，并将其保存在蒸馏水中。使用新的单面剃须刀片，进行一次水平切割，使切面与叶片表面呈直角，以确保获得垂直于叶片表面的横切面。
  2. 将叶片样本置于涂有牙科蜡的玻璃板上，以固定样品并防止滑动。切割时将刀片垂直向下移动，干净地穿过细胞。将所得横切片保存在蒸馏水中。
  3. 将样本置于载玻片上，先在载玻片上滴加一滴水，将切片放入水滴中，再盖上盖玻片，用于显微观察和成像。注意避免产生气泡。
  4. 在复式光学显微镜下以10倍和20倍放大倍数观察玻片。根据软件操作指南保存图像，并同时记录相应的标尺。

3. 半薄切片的制备

  1. 在玻璃板上，从玉米（Z. mays）和小麦（T. aestivum）叶片的中脉两侧叶间区域切取约 3 mm × 5 mm 大小的组织片段，操作方式同步骤 2.2。确保切取片段的长度方向与叶片纹理方向一致。
  2. 将植物材料放入注射器中，加入 1 mL 固定液（4% 戊二醛溶于 0.1 M 磷酸缓冲液，pH = 6.9，表 1）。
  3. 将注射器垂直放置，排出空气后用手指堵住尖端，抽动活塞以产生真空。重复此操作，直至样品沉入注射器底部，表明固定液已充分渗透。
  4. 将注射器内容物转移至已标记的玻璃小瓶中，在 4 °C 下保存 48 小时，再进行下一步操作（表 2）。
  5. 对于每个小瓶，用移液器小心吸除固定液，加入磷酸缓冲液至完全覆盖样品，静置 30 分钟。重复此步骤 3 次。
  6. 用移液器吸除磷酸缓冲液，加入四氧化锇（注意：有剧毒），直至完全覆盖样品。样品及其他有机物将变为黑色。操作时需佩戴双层手套。静置 1 小时。
  7. 用移液器吸除上一步溶液，用蒸馏水覆盖样品，静置 30 分钟。重复此步骤 3 次，每次均需佩戴双层手套。
  8. 用移液器吸除上一步溶液，用 50/50 蒸馏水-乙醇溶液覆盖样品，静置 30 分钟。随后依次使用以下比例的蒸馏水-乙醇溶液重复该步骤：30/70、20/80、10/90，最后用 100% 乙醇处理 2 次。上述任一溶液中的样品均可在 4 °C 下过夜保存。
  9. 用移液器吸除上一步溶液，用 1/3 树脂-乙醇溶液覆盖样品，将样品置于混匀仪上，静置 2 小时。随后依次使用以下比例的树脂-乙醇溶液重复该步骤：1/2、1/1、2/1、3/1，最后用 100% 树脂处理 2 次。 上述任一溶液中的样品均可在 4 °C 下过夜保存。
  10. 用 100% 树脂覆盖平底包埋模具的凹槽（16 个凹槽，每个凹槽尺寸：14 长 × 4.8 宽 × 3 深（mm）），将样品放置于凹槽一端。为每个样品准备手写纸标签，并将其置于凹槽另一端。
  11. 用 100% 树脂完全填满所有凹槽，若样品或标签发生移位应将其摆正。用包埋膜覆盖模具，并按照丙烯酸树脂产品说明在烘箱中进行聚合。
  12. 将含有样品的聚合块安装至超薄切片机的样品夹头上。使用粗制玻璃刀修块，直至组织可见并去除多余树脂。
  13. 使用玻璃刀或金刚石刀横向切割半薄切片（厚度 1 µm）。用金属接种环从水面上捞取切片，转移至载玻片上。将载玻片置于加热板（60 °C）上烘干，使切片牢固附着于玻片。
  14. 用甲苯胺蓝（1% 水溶液）对固定后的切片染色 5 秒，随后用蒸馏水冲洗，并再次在加热板上烘干。
    注意：化学固定过程必须在通风橱中进行。玻璃刀应定期更换，以确保切口锋利，获得无撕裂或变形的切片。

4. 样品成像

  1. 新鲜叶片切片的成像
    1. 根据说明书设置配备相应软件的复合光学显微镜。
    2. 将玻片放置在载物台上。调节目镜，先用10倍物镜观察切片以获得整体视野，然后依次使用20倍和40倍物镜进行观察。
    3. 在每个物镜下，切换至实时成像通道，聚焦于目标区域，并定位维管束周围鞘细胞。
    4. 聚焦完成后，点击冻结按钮，并在“工具”选项卡中点击比例尺按钮添加比例尺。将图像保存为.TIF格式，用于后续图像分析。
  2. 树脂浸渗切片的成像
    1. 将自动光学显微镜与计算机上的配套软件连接并进行设置。
    2. 加载透明通道，将玻片置于显微镜载物台上。使用40倍物镜放大倍率对切片进行聚焦，并调节亮度，确保所有细胞结构均清晰可见。
    3. 使用导航功能设定切片的成像区域，确保整个切片被完整成像，然后点击拼接按钮。
    4. 点击完成，然后点击开始，使显微镜自动完成整个切片的成像。打开图像分析软件，导入显微镜拍摄的图像瓦片。
    5. 使用“对齐”功能，确保各图像瓦片之间无重叠。生成图像后，通过“调整”选项卡校正位置、亮度和旋转角度。
    6. 在保存为.TIF格式前，将比例尺打印在图像上。
  3. 使用ImageJ软件进行解剖学测量
    1. 打开ImageJ软件，通过将图像拖入窗口的方式加载图像。
    2. 使用直线工具按以下步骤校准比例尺：在图像的比例尺上绘制一条直线，选择分析 > 设置比例尺，将“已知距离”设置为比例尺的实际长度，并将长度单位更改为正确的单位。
    3. 选择直线工具，在目标区域上划线，然后按M键，测量所需性状。
    4. 对于面积测量，选择多边形选区工具，围绕目标组织绘制轮廓，最后按M键结束。测量结果将以弹出窗口形式显示，可复制到电子表格中进行进一步数据分析。

结果

图1A展示了叶片切片的正确取向，适用于新鲜切片和光学显微镜观察。使用单面刀片和牙科蜡板切割新鲜切片的方法见图1B。所得切片如图1C所示。

图2展示了C3植物T. aestivum和C4植物Z. mays代表性叶片的徒手切片。维管束鞘细胞在叶脉周围清晰可见，其中玉米的细胞更圆且颜色更绿，表明其叶绿体含量更高。通过这些图像可以测量叶片厚度和维管束鞘的总面积；然而，该方法无法对叶肉组织进行进一步表征。

图3展示了T. aestivum和Z. mays的半薄横切面。通过该方法，叶片的所有组织均清晰可见且可测量。Z. mays中可见典型的克兰兹（Kranz）解剖结构，其叶肉细胞围绕维管束排列。维管束鞘细胞增大并富含叶绿体，且明显向叶肉细胞一侧聚集，这有利于维管束鞘细胞与叶肉细胞之间快速交换代谢物。基于这些图像，测定了以下叶片结构性状：小维管束与大维管束之间的叶脉间距、维管束鞘直径、维管束鞘总面积、维管束区域面积、维管束鞘细胞面积占比、维管束鞘细胞面积、500 µm范围内的叶脉密度，以及叶片厚度。图4中的箱线图显示了T. aestivum与Z. mays在上述性状上的差异。除大维管束间叶脉间距这一性状外，其余所有性状在95%置信区间内均具有显著差异（p值 < 0.05）。

图4展示了一系列箱线图，呈现了T. aestivum与Z. mays在解剖学性状上的差异，体现了C3与C4维管束鞘结构之间的典型区别。两种作物在叶脉间距离、维管束鞘直径（在相同生长条件下）、维管束鞘细胞及非光合组织（即叶脉）所占比例，以及500 µm叶段宽度内的叶脉密度等方面均存在显著差异——这些特征均强烈反映了C3与C4植物叶片解剖结构的预期差异。

图5展示了一些在切片或样品制备过程中可能出现的典型错误。这些图像中的叶片解剖结构被遮蔽或变形，因此无法用于可靠的形态学表征。使用超薄切片机切片时，若苏木精蓝染色时间过长，可能导致染色过深，从而掩盖细胞结构（图5A、B）。在渗透处理过程中常出现树脂未能充分渗透叶片组织的错误（图5C、D）。若叶片横切面沿纹理方向切割，会导致细胞呈椭圆形，使得叶肉细胞和维管束鞘细胞无法准确定位和正确测量（图5F、G、H）。

使用 R（版本 4.3.1）进行统计分析以生成箱线图。叶片解剖性状测量三次重复（每株植物取 3 片叶子，每个物种取 3 株植物）。

叶片切片过程示意图；植物样品制备、切割、用于化学分析的烧杯装置。
图1：新鲜叶片横切面的正确切割方法。（A）为获得横切面，叶片切片的方向示意图。（B）使用单面剃须刀片在平整的牙科蜡块上进行叶片切片的技术。（C）所得横切面呈薄片状的叶片细条，可直接用于载玻片装片并在显微镜下观察。请点击此处查看该图的放大版本。

显示富含叶绿素组织中叶肉和维管束的植物横切面显微图像。
图 2：代表性叶片的手工切片。 （A）C3 植物 Triticum aestivum（400 倍放大）；（B）C4 植物 Zea mays（200 倍放大）。细胞类型由箭头指示，其中 V = 维管束，BSC = 维管束鞘细胞，MC = 叶肉细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示组织层和维管系统的叶片解剖图，标注的横截面。
图 3：半薄横切面。 （A）Zea mays 和（B）Triticum aestivum，用于展示具有花环结构（Kranz anatomy）的 C4 植物（A）与无花环结构的 C3 植物（B）在维管束鞘和叶绿体位置上的差异。缩写：Tl = 叶片厚度，BS = 维管束鞘，SV = 小叶脉，ID = 脉间距离，LV = 大叶脉。 请点击此处查看该图的放大版本。

生物数据的箱线图分析；T检验结果；九个变量；T. aestivum 与 Z. mays 的比较
图 4：箱线图显示 Triticum aestivum 与 Zea mays 在解剖特征上的差异。（A）小叶脉间的叶脉间距，（B）大叶脉间的叶脉间距，（C）维管束鞘直径，（D）维管束鞘总面积，（E）叶脉面积，（F）维管束鞘细胞面积占比，（G）维管束鞘细胞面积，（H）500 µm 范围内的叶脉频率，以及（I）叶片厚度。请点击此处查看该图的放大版本。

显微植物组织横切面，染色，高亮细胞结构，50-100µm 尺度。
图 5：组织处理过程中可能出现的常见错误示例，红色箭头指示。 在 LR White 丙烯酸树脂包埋样品中过度染色：(A) Triticum aestivum 和 (B) Zea mays；在 Spurr's 环氧树脂包埋切片中出现的树脂撕裂：(C) Ceratozamia robusta 和 (D) Dioon mejiae；T. aestivum 徒手切片显示 (E) 横切面和 (F) 纵切面；由于斜切导致的切片偏差：(G) Annona muricata 和 (H) Encephalartos villosus。请点击此处查看该图的放大版本。

溶液配制方法终体积
缓冲液1基础液将7.12 g Na2HPO4 · 2H2O溶解于200 mL蒸馏水中200 mL
缓冲液2基础液将7.12 g NaH2PO4 · 2H2O溶解于200 mL蒸馏水中200 mL
磷酸盐缓冲液取36 mL 基础液1、14 mL 基础液2和50 mL蒸馏水混合100 mL
固定液取9.25 mL 5% 戊二醛（注意：参见材料表）、12.5 mL 磷酸盐缓冲液和28.25 mL 蒸馏水混合。4 °C 保存。50 mL

表1：固定液配方。

步骤描述持续时间重复次数
1缓冲液冲洗用移液器轻轻去除固定剂，加入磷酸盐缓冲液至完全覆盖样品，静置 30 min。30 min3x
21% 四氧化锇染色（注意：参见材料表）用移液器去除磷酸盐缓冲液，加入四氧化锇至完全覆盖样品。样品及其他有机物质将变为黑色。需佩戴双层手套。60 min1
3用蒸馏水冲洗样品用移液器去除前一步溶液，用蒸馏水覆盖样品，静置 30 min。重复此步骤 3 次。需佩戴双层手套。30 min3 次
4乙醇梯度浸入用移液器去除前一步溶液，用 50/50 蒸馏水-乙醇溶液覆盖样品，静置 30 min。随后依次使用以下比例的蒸馏水-乙醇溶液重复此步骤：30/70、20/80、10/90 和 100% 乙醇。30 min1
5树脂-乙醇梯度浸入用移液器去除前一步溶液，用 1/3 树脂-乙醇溶液覆盖样品，将样品置于混合板上，静置 2 h。随后依次使用以下比例的树脂-乙醇溶液重复此步骤：1/2、1/1、2/1、3/1 和 100% 树脂。120 min1
6在冰箱中存放 72 h，再进行聚合
7根据产品说明书对浸入树脂的叶段进行聚合，以获得树脂包埋样品。

表2：树脂渗透处理方案。

讨论

本文讨论了测量叶片解剖结构的定量与定性方法，以及这些方法的优化途径。此外，本研究方法还应用于代表性作物物种，以确定哪些解剖特征在区分C3和C4横切面时最为有效。理解这些特征至关重要，因为被称为C2光合作用的杂交类型正成为更具前景的研究方向。截至目前，仅有一种作物物种Diplotaxis tenuifolia（芝麻菜）被确认具有C2光合作用，但实际存在的种类可能多于现有记录25。C2类群内部表现出较高的种内光合多样性与可塑性，这意味着确认C2光合作用的存在需要多方面的证据支持，例如CO2补偿点测定、超微结构分析以及免疫组织化学技术30。

徒手切片和半薄切片已用于鉴定和测量特定植物组织多年，但本文旨在讨论其在解剖学叶片结构中的特定应用，这些结构影响 C3 和 C4 作物植物之间的光合作用差异。徒手切片和半薄切片均存在一些需要注意的问题。徒手切片虽然获取迅速，但所得叶片切片厚度往往不一致，从而阻碍定量分析。这一问题可通过使用专门设备对新鲜植物材料进行切片（例如振动切片机或冷冻切片机）来避免。徒手切片产生的较厚切片可能导致多层细胞重叠，使细胞结构模糊，进而影响解剖学观察。如果切片的目的仅为定性分析，则徒手切片具有可对植物组织进行化学处理（即组织化学）的优势31，从而可定性指示植物细胞中特定化合物的存在。相反，半薄切片几乎总能获得厚度一致的切片，但其制备过程更长、更精细，因而更容易出错。文中将进一步讨论可能出现的问题及其规避方法。

固定
无论是徒手切片还是半薄切片，均需使用新鲜材料，即充分吸水的植物叶片。萎蔫叶片的切片因细胞膨压降低而缺乏结构完整性。在对树脂包埋材料进行半薄切片时，关键步骤是确保叶片组织在真空条件下固定，以置换叶片内部的空气。这一步骤有助于在渗透过程中维持组织的结构完整性和渗透平衡。若此步骤操作不当，细胞容易发生塌陷，导致横切面无法真实反映叶片的实际结构，进而造成解剖学测量结果的错误32。

相反，高真空压力可能会损伤组织较软的叶片（如子叶），导致细胞皱缩或样品被破坏。可通过使用适当的真空泵设置，或完全省略真空步骤而仅将样品浸泡在固定液中来避免此问题。若选择后者，可将样品各侧进行切割，以促进固定液渗入组织。

预浸润
细胞壁厚度和石细胞组织是对溶液渗透性影响最大的解剖学特征，而溶液渗透性决定了样本固定和浸润的效果。植物组织中石细胞的主要功能是提供机械支撑和保护作用，这可能会影响浸润过程33。由于这些组织具有高度增厚且木质化的细胞壁，溶液的渗透可能受到阻碍。存在浸润问题的样品在切片时会出现半薄切片中细胞破裂以及树脂出现裂痕的现象（图5C、D）。进行纵切时会导致细胞形变，从而在解剖学分析以及叶片性状（如细胞大小和细胞密度）测量中引入偏差（图5F–H）。

树脂渗透
高质量的切片对于观察解剖组织至关重要，而组织的观察效果直接受到样本包埋介质的影响。植物组织学中最常用的包埋介质包括石蜡、环氧树脂和丙烯酸树脂34,35。石蜡包埋需要先用化学固定剂处理样品，再用液态石蜡进行渗透，随后在室温下固化。这类切片通常厚度为5–10 µm，而如本文所示，仅使用未经固定的鲜活组织，通过手工操作同样可获得同等质量的切片（图2）。然而，在某些情况下，例如围绕维管束鞘的细胞排列对于区分C3和C4植物具有重要意义时，则需要使用更为坚固和刚性的包埋介质。本研究对环氧树脂（Spurr's树脂36）和丙烯酸树脂（LR White）在硬度、持久性、样品渗透性以及切片耐久性方面进行了测试。环氧树脂已被用于生物材料包埋数十年之久37。丙烯酸树脂相对较为新型，最初因其长期稳定性而被考虑用于植物样本包埋；与环氧树脂不同，它不会因紫外线照射而变色，也更不易发生收缩38。本研究选用LR White丙烯酸树脂（硬质型），因其具有无毒性和抗紫外线降解的配方。丙烯酸树脂通常比环氧树脂粘度显著更低，有利于更快地渗透样品，同时其材料硬度也使得使用切片机时切割更加清晰平整39。图5C、D展示了在含有大量结构组织的叶片样本中使用环氧树脂的结果，由于环氧树脂较软，切片过程中不可避免地出现撕裂，而使用丙烯酸树脂时则无此问题（图3）。

超薄切片
修除多余的树脂可能会导致树脂产生裂纹并延伸至样品内部。为避免这种情况，必须考虑所选包埋树脂的密度和脆性。切片时应深入切面，以避免因手工修块或使用粗糙刀具修切而产生的伪影。样品应垂直于样品台进行固定，并通过目镜增加放大倍数以及观察已固定和染色的切片来验证其对齐情况。植物细胞若未以完全垂直的角度切割，在显微镜下会呈现锥形细胞，即一端大于另一端40。

染色后处理
使用亚甲蓝（1% 水溶液）对超薄切片机切出的半薄切片进行染色。如果染液在切片上干燥时间过长，会导致染色过度，成像时切片出现过度饱和（图5A）。若染液过滤不充分，未溶解的颗粒会在切片上析出并干燥，阻碍解剖结构的观察（图5B）。该问题可通过配制亚甲蓝溶液时使用细滤膜过滤，并控制切片与染液的接触时间来避免。染色前，样品需在60 °C加热板上干燥，以确保切片牢固附着于玻璃载玻片；但切片接触亚甲蓝染液的时间不应超过10秒，之后应立即冲洗并再次干燥41。

关于解剖学测量的考虑
本文所示的测量指标仅仅是可通过半薄切片进行定量评估的众多解剖性状中的一个示例，包括胞间气腔所占比例、平均叶肉细胞厚度（不含维管组织）以及单位叶面积内叶肉细胞暴露于胞间气腔的表面积42。然而，尽管维管束鞘细胞大小是区分C3和C4代谢的重要指标，维管束鞘细胞壁厚度则是另一项重要性状，仅靠光学显微镜无法观察该特征，因为它决定了维管束鞘细胞的通透程度，即CO2反向扩散回叶肉细胞的量42,43。高通透性会降低光合效率，因为用于PEP羧化酶固定CO2的大量能量将因此损失44,45,46。对于此类超微结构分析，需要透射电子显微镜（TEM）及图像分析技术。尽管本研究仅考虑了光学显微镜观察，但实验方案中包含了四氧化锇处理步骤，该试剂是一种用于对比增强和固定的试剂，是TEM显微技术的关键基础。因此，即使在样品制备时未计划进行TEM分析，聚合后的样品仍可在需要时用于TEM分析。

尽管解剖学诊断可轻易检测到类似克兰兹（Kranz-like）的结构，但还可通过气体交换测量进一步诊断C4途径的存在，此类测量可显示出典型的C4生理特征，即较低的CO2补偿点、光合作用受O2抑制程度较小以及不同的碳同位素组成2,4,47。

还应注意，维管束鞘细胞花环结构并非C4光合作用发育所必需，这一点已由单细胞C4植物的发现所证实48,49,50。因此，仅依靠解剖学分析可能不足以检测研究较少的分类群中的C4生理特征。将解剖学特征鉴定与生理学分析相结合，为研究作物和野生植物叶片性状及其结构与功能关系提供了强有力的工具。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢欧盟H2020计划（项目GAIN4CROPS，资助编号862087）。卓越中心AgroCropFuture——未来气候下的农业生态与新型作物，由爱沙尼亚教育与研究部资助。我们感谢Evelin Loit-Harro教授提供普通小麦（T. aestivum）和玉米（Z. mays）种子，感谢Paula Palmet和Vaiko Vainola在制备叶片横切面过程中提供的帮助，以及João Paulo de Silva Souza在分析工作中的协助。所有图像均来自爱沙尼亚生命科学大学显微技术平台在不同项目中获得的结果。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二水合磷酸氢二钠（Na2高倍物镜42H2O) 纯PENTA, CZ10028-24-7
包埋膜，7.8 mil 厚，8 x 12.5（203 x 318 mm）ACLAR，美国10501-10
乙醇，abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000危险：高度易燃的液体和蒸气。
EVOS Invitrogen FL Auto 2 成像系统Thermo Fisher Scientific，美国
带金属框的16孔平嵌聚四氟乙烯模具PELCO，美国10501
2 ml 玻璃小瓶VWR生命科学，美国548-0045
戊二醛 50% 溶液VWR Life Science，美国23H2856331危险：吸入致命。吞咽有毒。造成严重皮肤灼伤和眼睛损伤。可能引起呼吸道刺激。佩戴防护手套、防护服、眼面部防护装备。
Histo金刚石刀Diatome, 美国
LEICA EM UC7Leica 维也纳，奥地利
LR White树脂硬质型号Electron Microscopy Sciences，美国14383危险：引起皮肤刺激。引起严重眼刺激。可能引起呼吸道刺激。可能引起困倦或头晕。佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护。
显微镜载玻片Normax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 和 Nikon DS-Fi1 5 MP尼康公司，日本
四氧化锇（OsO₄）4)Agar Scientific Ltd, GBR1019危险：吞咽、皮肤接触或吸入会致命。造成严重皮肤灼伤和眼睛损伤。佩戴双层防护手套、防护服及眼睛和面部防护装备。
移液器和移液器吸头赛默飞世尔科技，FIKJ16047
磷酸二氢钠二水合物（NaH2PO4 . 2H2O) 纯PENTA, CZ13472-35-0
10 ml 注射器Ecoject, DE20010
甲苯胺蓝，通用级Fisher Scientific，英国2045836

参考文献

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