Method Article

多细胞球体的生产和多参数活细胞荧光寿命成像显微镜 （FLIM）

DOI:

10.3791/66845

⸱

August 9th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 2Ghent Light Microscopy Core, Ghent University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们描述了不同的多细胞球体形成方法，以执行后续多参数活细胞显微镜检查。使用荧光寿命成像显微镜 （FLIM）、细胞自发荧光、染色染料和纳米颗粒，展示了分析活三维 （3D） 癌症和干细胞衍生球状体中细胞代谢、缺氧和细胞死亡的方法。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多细胞肿瘤球体是一种流行的 3D 组织微聚集体模型，用于复制肿瘤微环境、测试和优化药物治疗以及在 3D 环境中使用生物和纳米传感器。它们的易于生产、可预测的大小、生长以及观察到的营养和代谢物梯度对于概括 3D 生态位样细胞微环境非常重要。然而，球状体的异质性及其生产方法的可变性会影响整体细胞代谢、活力和药物反应。考虑到大小、可变性、生物制造需求以及在干细胞和癌细胞生物学中用作 体外 3D 组织模型的要求，这使得选择最合适的方法变得困难。特别是，球状体的产生会影响它们与定量活体显微镜的兼容性，例如光学代谢成像、荧光寿命成像显微镜 （FLIM）、使用纳米传感器监测球状体缺氧或活力。这里介绍了许多常规的球状体形成方案，突出了它们与活体宽场、共聚焦和双光子显微镜的兼容性。还介绍了使用多重自荧光 FLIM 以及使用各种类型的癌症和干细胞球体的后续成像到分析管道。

Introduction

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多细胞球状体代表一组 3D 组织模型，由细胞自聚集获得，呈球形。它们广泛用于在体外模拟细胞间和细胞间基质相互作用，并在多种癌症和干细胞衍生构建体中复制 3D 环境。采用多种技术来减少细胞粘附并促进聚集。这些方法包括依赖于表面张力1 的悬滴法;细胞附着排斥方法，如超低附着板、微模具和微孔 2,3;基于声波的方法4;流动诱导聚集方法（旋转瓶、生物反应器和微流体装置）5;磁性粒子辅助形成6 以及使用促进聚集的合成和基于 ECM 的基质和支架 7,8,9。

在癌症研究、开发和新药疗法的验证中，球状体是一种有吸引力的模型，因为它们能够概括营养物质、废物和 O2 的空间扩散限制梯度，通常会导致形成坏死核心，这是实体瘤的典型特征10,11。根据动物研究的 3R 原则（替代、还原和精炼），这些更可靠、更复杂的体外模型挑战了广泛使用动物模型的需求（食品和药物管理局 [FDA] 现代化法案 2.012）。除了癌症，球状体还可用于干细胞研究。例如，多能干细胞具有形成拟胚体 （EB） 的能力，可用于诱导多能干细胞 （iPSC） 分化为难以直接从患者那里获得的特殊细胞类型，例如神经前体细胞13 或卵巢颗粒细胞13,14。此外，EB 的形成通常是开发更复杂的类器官模型的第一步，例如神经15、视网膜16、心脏17、肝脏18、胃19 和肠道类器官20。在为实验选择合适的球状体形成方法时，应考虑包括大小、重现性、通量和下游应用在内的因素。

与 2D 培养相比，3D 培养的复杂性增加会导致更高的变异性。营养成分21、介质蒸发22、粘度23、pH 控制24、球状体形成方法，甚至培养时间25,26 等因素都可能导致获得不同形态、大小、活力和不同化学抗性的球状体27,28.最近的研究表明，球体氧梯度并不总是静态的，并且受形成方法、球体大小和细胞外粘度的影响，从而影响球体异质性29。为了提高微球的可重复性和数据可访问性，我们开发了 MISpheroID 知识库26，将细胞系、培养基、形成方法和微球大小确定为可重现结果的最小信息。因此，对多种高通量（SphericalPlate 5D、实验室制造的微模具和微组织模具）和低附着方法（即 Biofloat 和 Lipidure 涂层的 96 孔板，无支架和基于支架）进行了详细比较（图 1 和表 1），包括孔大小（给定最大球体尺寸的估计）、使用的耗材、准备时间以及在不将球体运输到显微镜培养皿的情况下监测球体的可能性。 后者支持长期研究，而使用高通量方法生产的球体通常会导致终点实验。除 5DspheriPlate 的网格外，所有方法都不会带来不需要的自发荧光，因此可以直接在显微镜中使用。

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图 1:球体形成方法解释。 高通量方法，例如 SphericalPlate 5D，它在板中集成了专利微孔，而实验室生产的微模具和 MicroTissue 模具使用印章在琼脂糖（蓝色）中制作多个微孔。Lipidure （Amsbio） 和 Biofloat （Sarstedt） 等低附着板使用非粘附涂层，可抑制细胞表面粘附并促进细胞自聚集。 请单击此处查看此图的较大版本。

5D 球形板自产微模微组织低附着方法
球状体数量/孔7501589811
直径井90 微米400 微米800 微米1 毫米
培养体积1 毫升5 毫升1 毫升200 微升
其他耗材/7 mL 3% 琼脂糖500 μL 2% 琼脂糖/ *
准备时间10 分钟2 小时 + 3 天培养基适应0.5 小时 + 15 分钟培养基适应10–30 分钟 + 1 小时干燥
监测是的不**是的是的
自发荧光是的不不不
可 重用不是的是的不**
成本€€€€€€€€€€€€: 涂层和 Matrigel
€€:商用 96 孔板
*一些细胞系需要添加 ECM（即 2%–5% Matrigel）以形成紧凑的球状体。
**涂层可重复使用，直到用完。但是，每个板会消耗少量介质，并且灰尘会随着时间的推移而积累。经常需要过滤器消毒。

表 1:多种球体形成方法的比较29."监测":无需转移到显微镜培养皿中即可监测球体的能力。€: 0-50€， €€: 50-150€ ， €€€: 150-500€ ， €€€€: >500€

荧光显微镜能够直接监测球状体内的关键生物学方面，包括细胞死亡、活力、增殖、代谢、粘度，甚至机械特性30。荧光寿命成像显微镜 （FLIM） 为研究荧光探针在其（微）环境中的相互作用 31,32,33,34 提供了额外的定量维度，从而可以根据不同的发射寿命35,36 分辨重叠的发射光谱以及基于内在细胞自发荧光探测细胞代谢。因此，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NAD（P）H）、黄素单核苷酸 （FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸 （FAD）、原卟啉 IX 等广泛使用的细胞自发荧光化合物可以用单光子和双光子 FLIM 测量，并作为葡萄糖分解代谢、氧化磷酸化 （OxPhos） 的内在"传感器"，并提供细胞氧化还原状态的一般概述。NAD（P）H 存在于游离细胞质中，或以蛋白质结合的线粒体形式存在37,38。同样，FAD 的氧化态是荧光的，游离形式的寿命更长。NAD（P）H 和 FAD 显微成像通常涉及双光子激发的 FLIM，旨在防止样品光损伤39。通常，"光学代谢成像"FLIM 可以与基于染料的探针、基因编码的生物传感器、磷光寿命成像显微镜 （PLIM） 和基于比率强度的测量结合使用，以提供球状体或类器官代谢、氧合、增殖和细胞活力的更完整图像 29,30,31.此外，FLIM 还可以与 Förster 共振能量转移 （FRET） 方法结合使用，以测量与受体紧密接触时供体荧光团的寿命变化，以研究药物与其靶结构域的结合 33,40,41。

通常对采集的 FLIM 图像进行分析，以逐个像素计算寿命。目前，至少有 3 种常用策略用于获得荧光寿命:半定量"快速 FLIM"42（有时称为"tau 感"43,44）、衰变曲线拟合，使用一、二或三指数拟合，以及具有相量变换和相量图分析的"无拟合"方法。根据供应商的不同，可以使用提供的（LAS X、Symphotime、SPCImage 等）或开源软件（例如 FLIMfit45、FLIMJ46 或其他47）来处理测量的 FLIM 数据。通常，供应商提供的软件可用于初步数据分析，而开源解决方案可以使用相量图和 3D 可视化等工具提供更准确的研究。

尽管 FLIM 作为研究球体的方法有用且有吸引力，但可用的实验方案很少，并且在选择最合适的形成方法以成功进行涉及 FLIM 的活体多参数显微镜实验方面普遍缺乏知识。在这里，根据它们的形态、活力和氧合，与最近验证和表征的远红外和近红外 （NIR） 氧传感纳米传感器 （MMIR1） 详细比较了常用的球状体形成方案。阳离子纳米颗粒浸渍了两种报告染料，即参比 O2 不敏感的氮杂-BODIPY（激发波长 650 nm，发射波长 675 nm）和 NIR O2 敏感的金属卟啉 PtTPTBPF（激发波长 620 nm，发射波长 760 nm）。MMIR1 能够在传统荧光显微镜（使用比率分析）或磷光寿命显微镜 （PLIM） 上实时分析氧梯度，而不会引入细胞毒性，并允许稳定的信号、长期监测和多路复用25,29。根据使用染料或纳米传感器染色的需要、球状体通量或细胞类型，可以选择最合适的形成方案。由于球体活力和氧合的研究与癌症和干细胞衍生的球体的研究相关，因此提出的方案还包括 NAD（P）H-FLIM 和 FAD-FLIM 与这些模型的示例和预期典型结果。所提出的成像和分析管道针对最流行的基于时间相关单光子计数的 FLIM 显微镜平台。

Protocol

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1. 多细胞球体的产生

  1. 细胞培养
    注:细胞培养物可从美国典型培养物保藏中心 （ATCC）、Lonza、Sigma-Aldrich 或其他供应商处收集。ATCC 提供所有必需的处理信息，包括首选生长培养基、传代培养程序、生物安全水平、生长速率和 STR 谱。在这里，将人结肠癌细胞系 HCT116 的 500 个细胞/球体用于补充有 10% FBS 和 1 mM 丙酮酸钠的 McCoy 5A 培养基 （VWR， 392-0420） 中。对于每天监测的长期实验，可以在培养基中加入 10 mM HEPES，pH 值为 7.2。
    1. 培养细胞培养物以达到 70%-90% 汇合度。
    2. 用预热 （37 °C） 无菌 PBS（25 cm2 瓶为 5 mL，每 75 cm2 烧瓶为 10 mL）冲洗细胞。
    3. 加入 0.05% 胰蛋白酶 - 1 mM EDTA 溶液（25 cm² 为 0.5 mL，或每 75cm2 培养瓶 1 mL），并在 37 °C、5% CO2、95% 湿度下孵育 5-10 分钟，以达到细胞分离。
      注意:在透射光（明场）显微镜下控制细胞分离。细胞过度暴露于解离酶溶液会影响其活力。
    4. 通过添加含有 10% FBS 的过量细胞培养基（每 1 mL 解离溶液至少 5 mL 培养基）来中和胰蛋白酶。
      注:对于在低 FBS 或无 FBS 培养基上培养的细胞，可以通过向胰蛋白酶处理的细胞培养物中加入 0.5 mL 100% FBS，然后离心以将细胞转移到其原始培养基中来完成胰蛋白酶中和。
    5. 通过移液分离细胞聚集体，以获得培养基中的单细胞悬浮液。
      注:使用顶部有 1000 μL 移液器吸头的血清移液器移液，可显著改善大体积悬浮细胞培养中单细胞悬液的生成。
    6. 使用计数室（Neubauer 规则血细胞计数器或其他替代品）计数每 1 mL 细胞悬液的细胞数。
    7. 稀释细胞悬液以获得每毫升所需的细胞数。
    8. 向细胞悬液中加入终浓度为 10 μg/mL 的浓 O2 探针（纳米颗粒）溶液，用于 O2 的比率分析。
      注:为确保细胞悬液均匀（使用探针），请在球状体形成前多次重悬。如果不需要 O2 探针，请跳过此步骤并继续形成球状体。处理 iPSC 时应应用修改后的方案。简而言之，iPSC 在 Geltrex 包被板上的菌落中生长，并使用 ReLeSR 传代，如供应商提供的方案48 中所述。在球状体形成当天，菌落应大、紧凑，并表现出具有明显边界的多层中心。用预热的无菌 PBS 冲洗细胞。加入 1 mL 温和的细胞解离试剂 （GCDR） 并在 37 °C 下孵育 8-10 分钟。使用 1000 μL 吸头轻轻地从孔中分离细胞并获得单细胞悬液。将单细胞悬液转移至无菌 50 mL 锥形管中，并加入 4 mL 预热的 DMEM-F12 培养基以中和 GCDR。用 1 mL DMEM-F12 洗涤孔，并将其转移到细胞悬液的其余部分。以 300 x g 离心 5 分钟。重悬于 1 mL 的适当培养基中，用于进一步实验。对于本手稿中描述的实验，使用了 mTeSR + 10 μM Rock 抑制剂。对细胞悬液进行计数和稀释，以获得所需的每毫升细胞数。
  2. 球体形成方法
    1. 3D 培养皿微模具
      注:这种高通量方法用于在直径为 800 μm、深度为 800 μm 的 9 x 9 微模具阵列中同时生成大量球状体（81 个球状体）。
      1. 在 dH2O 中冲洗用于铸造 3D 培养皿的微模具，并放入可高压灭菌的容器中。
      2. 量取 2 g 电泳级琼脂糖粉末，并将其放入干燥的 200 mL 高压灭菌安全玻璃瓶中。
        注:确保瓶子和琼脂糖粉末干燥，无液体或湿气。
      3. 用于用琼脂糖粉末在干循环中浇注 3D 培养皿和瓶子的高压灭菌微模具 30 分钟。
      4. 通过在 100 mL 超纯水中加入 0.9 g NaCl 制成 0.9 w/v% 盐水溶液，并通过高压灭菌灭菌。
        注意:NaCl 是制造商推荐的。它增加了琼脂糖的稳定性。
      5. 通过将无菌盐水添加到灭菌的琼脂糖粉末中来制备琼脂糖溶液。拧上松散的盖子，以避免压力积聚。旋转瓶子以混合琼脂糖粉。
      6. 使用微波炉煮沸并溶解琼脂糖粉。经常停止微波炉（~每 10 秒）。旋转瓶子并重复，直到琼脂糖溶解。
        注意:琼脂糖溶液很热，需要小心处理。熔化程序后立即摇晃可能会导致溶液从容器中爆裂。为避免事故，请使用装满不超过容量 50% 的足够大的容器，并使用适当的个人防护用品（手套、烤箱手套、护目镜和实验室外套）。
      7. 让溶解的琼脂糖溶液冷却至 60-70 °C。 使用无菌技术和条件，将熔融琼脂糖移液到微模具中（12 系列为 500 μL，24 系列为 330 μL）。
        注:混合或移液琼脂糖时避免形成气泡。在琼脂糖凝固之前，通过移液或轻轻刮擦去除微模具小特征中捕获的任何小气泡。
      8. 让琼脂糖凝固约 2-3 分钟。然后，小心地弯曲微模具以取出 3D 培养皿并转移到 12 孔组织培养板上。
        注:微模具的过度弯曲可能导致琼脂糖模具内形成裂纹。
      9. 为了平衡 3D 培养皿，添加 2.5 mL/孔细胞培养基。孵育 15 分钟或更长时间。去除培养基并用新鲜培养基替换。再次重复以用培养基平衡 3D 培养皿。
        注意:该协议可以在此处中断，直到细胞接种。对于长期储存（在 4 °C 下长达 2 周），请使用 PBS 溶液代替培养基。
      10. 完全去除培养基（或 PBS）周围的 3D 培养皿，并通过倾斜组织培养板准确去除 3D 培养皿内的培养基。
      11. 小心地将 190 μL 含有 40,500 个细胞的细胞悬液滴加到细胞接种室中（参见步骤 1.1）。
        注:琼脂糖印记中的微孔数决定了每个印记产生的球体数。在这种情况下，该琼脂糖模具包含 81 个微孔（81 x 500 个细胞/球状体）。添加到大孔中的悬浮液中细胞浓度的变化允许改变每个球体的细胞数，从而控制球体的大小。
      12. 让细胞沉淀到 3D Petri dsh 的特征中 ~10 分钟。然后，向 3D 培养皿的外部添加 2 mL 培养基。
      13. 将组织培养板放入细胞培养箱中，并根据需要更换 3D 培养皿周围的培养基。
    2. 低连接板
      注意:此方法用于每孔生成单个球体。包被板（脂质或 Biofloat）是市售的（跳过步骤 1.2.2.1-1.2.2.4）。或者，该涂层可以单独购买，用于涂覆未经处理的多孔板。建议用无菌水或 PBS 填充 96 孔板边缘的孔，因为这些孔中的蒸发速度更快，从而将球状体的孔数限制为 60 个。如果需要较少的球体，请用水或 PBS 填充周围的空井。使用无尘吸头进行液体处理，以避免将小颗粒带入孔中，因为它们会干扰球状体的形成。
      1. 将 0.25 g 聚合物粉末溶于玻璃瓶容器中的 50 mL 乙醇中，制备 0.5 w/v% 包被溶液。对涂层进行过滤消毒。
        注:过滤器灭菌和所有后续步骤必须在层流下的无菌条件下进行。
      2. 向 96 U 底培养板的每个孔中加入 200 μL 包被溶液。
      3. 孵育 1 分钟并去除多余的涂层。
        注:涂层溶液可多次使用。在室温 （RT） 下储存在玻璃容器中。不建议使用塑料容器，因为塑料会部分溶解并成为溶液的一部分。如果存在灰尘，请使用 0.22 μm 聚醚砜 （PES） 或尼龙针式过滤器进行过滤消毒。
      4. 让 96 孔板风干约 1 小时。
        注意:如果细胞需要细胞外基质，请继续执行步骤 1.2.3。包被板包裹在铝中后可在 RT 中储存长达 1 个月。当接种较低量的细胞/孔时，以 300 g 离心板 5 分钟有助于拉低细胞。
    3. 细胞外基质辅助形成方案
      注:一些细胞系本身不能产生足够的细胞外基质 （ECM），需要添加 ECM，例如 Matrigel、Cultrex 或 Geltrex 才能形成紧凑的球体 49,50,51。对于乳腺癌 MDA-MB-231、人真皮、前列腺癌细胞等细胞类型，可以使用步骤 1.2.2 并进行以下修改52，需要添加 ECM。最好使用无尘吸头进行液体处理，以避免灰尘干扰球状体的形成。步骤 1 和 4-7 必须在生物安全柜（II 级）下进行。
      1. 继续执行步骤 1.2.2.1-1.2.2.4（低连接板）进行表面处理。
      2. 将 96 孔板在冰箱中于 4 °C 预冷。
      3. 使用适用于 96 孔板的正确适配器准备离心机，并将其预冷 4 °C。
      4. 在预冷 （4 °C） 细胞培养基中制备 5% 基底膜基质 （BMM） 溶液。
        注意:BMM 在 RT 处快速交联。处理时，请将原液和溶液放在冰上。
      5. 准备细胞悬液（参见步骤 1.1）。
      6. 向每个孔中加入 50 μL BMM 溶液。
      7. 在 BMM 溶液（25,000 个细胞/孔）上的每个孔中轻轻加入 50 μL 细胞悬液。
        注意:不要将此体积喷射到孔中，否则细胞会在孔的侧面扩散，而不会聚集在底部。通过相应地调整细胞密度，可以获得较低的每孔细胞数。并非所有细胞都会在所有接种密度下形成球状体;必须根据 cell type 和 desired dimension 进行优化。在提供的体积下，BMM 的最终浓度为 2.5%。如果需要不同浓度的储备液，则必须制备较低/较高浓度的储备液。
      8. 将 96 孔板在 300 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。
        注意:如果没有此步骤，细胞将无法在孔底部正确聚集，从而导致形成多个较小的聚集体。离心机必须冷却以避免在此阶段发生交联。
      9. 将板放入细胞培养箱中。聚集体在播种后第 4 天被视为成熟。
        注:有关球体形成的其他方案，请参阅 补充文件 1。

2. 球状体的实时显微镜检查

  1. 制备用于实时成像分析的球状体
    注:根据实验设计（例如，长期监测或终点分析、显微镜设置或测量荧光的光谱特性）或由于球状体生产方法与显微镜的不兼容（例如，样品厚度、材料的自发荧光、成像过程中球状体的浮动）直接监测板中产生球状体的地方， 可能无法。该协议解释了用于成像的球体的制备，这些球体适用于大多数倒置宽场和共聚焦显微镜。
    1. 准备并预热 （37 °C） 成像介质:补充有 HEPES-Na、pH 7.2 （10 mM）、丙酮酸钠 （1 mM）、L-谷氨酰胺 （2 mM） 和葡萄糖 （5 mM） 的 DMEM，不含酚红。
      注:如果在成像过程中提供 CO2 控制，则可以单独使用碳酸氢钠或与 HEPES-Na 结合使用24。某些细胞培养类型不能耐受 HEPES 的存在。根据实验设计，可以修改丙酮酸、谷氨酰胺和葡萄糖含量。
    2. 准备无菌显微镜培养皿（市售或实验室制造），带有涂层（用于强球体粘附力）或非涂层（低球体粘附力）盖玻片表面（厚度 #1.5）。
      注:涂层的需求和类型取决于细胞类型、球体的粘附特性以及它们从 3D 到 2D 培养界面的细胞迁移速率。这一点很重要，因为涂层会促进 3D 组织的损失，改变球状体中微梯度的形状，从而改变细胞行为。对于某些实验（例如，成像分析对药物刺激的反应），需要对表面的球状体有很强的粘附性，并且最好涂有明胶、BMM、胶原蛋白、胶原蛋白/多聚-D-赖氨酸或多聚-D-赖氨酸的涂层。
    3. 从微图案琼脂糖或 96 孔板的微孔中轻轻洗出 O2 探针染色的球状体，并将仍然漂浮的球状体转移到 2 mL 样品瓶中。
      注:为确保从高通量方法中收集所有球状体，请用额外体积的培养基冲洗模具 1-3 次，将所有球状体悬浮液混合在一个小瓶中。对于低连接板中的球体，如果少量球体足以进行实验，则将球体从单个孔逐个收集到小瓶或直接收集到显微镜培养皿中。转移大球状体时，切开移液管尖端的末端，以确保移液过程中不会损坏。
    4. 将样品瓶垂直放置长达 5 分钟，让球体沉淀在样品瓶底部，形成可见的颗粒。
    5. 从试管中取出培养基，保持球体不受干扰，然后轻轻地将它们重悬于足够量的新鲜培养物中。
      注意:为了方便球体处理，也可以在此阶段小批量将球体转移到成像介质中;请参阅步骤 2.1.7 和 2.1.8。应平等对待来自不同实验组的球体，因为培养基成分和培养基预处理时间会影响其代谢。
    6. 当球体漂浮时，在显微镜培养皿的每个孔中转移等体积的球状体悬浮液。
    7. 将球体在 CO2 培养箱中于 37 °C 孵育 1-2 小时，以确保它们附着在显微镜培养皿/孔的表面。对于成像，请继续执行步骤 2.1.9。对于使用其他探针对球体进行染色，请继续执行步骤 2.1.8。
      注意:单元从 3D 球体迁移到 2D 表面界面的速率是时间的函数。为避免 3D 组织损失，必须根据细胞类型、表面涂层类型和实验设计优化孵育时间。例如，HCT116 取决于球体大小，需要至少 2 小时才能将球体正确附着到胶原 IV/poly-D-赖氨酸包被的表面，而 hDPSC 附着和迁移到 2D 界面非常快，导致 3D 组织在 1-2 小时内丢失。为避免由于过度扩散而对"2D 球体"进行成像，使用未镀膜的玻璃表面，以减少孵育时间。
    8. 将推荐或经验优化浓度的荧光探针添加到已知体积的球状体悬浮液中。成像前在 37 °C CO2 培养箱中孵育 1 小时。
      注:对于活/死测定，使用标准终浓度为 1 μg/mL 的碘化丙啶和钙黄绿素 Green-AM。为避免碘化丙啶染色对 iPSC 拟形体的毒性作用，碘化丙啶的最终浓度为 0.5 μg/mL。如果由于球体尺寸大而导致探针的扩散效率不高，则探针加载时间可能会延长。加载时间应始终被视为球体附着到表面所需的总孵育时间的一部分。如果球体附着需要更长的时间，则应在此期间结束时安排染色程序。请注意，较长的孵育时间可能会导致 3D 组织丢失。
    9. 去除细胞培养基或含有荧光探针的培养基，并将其更换为必要体积的成像培养基。为确保球体成像途中没有培养基荧光背景，重复培养基更换（洗涤）步骤最多 5 次。
      注:为避免在培养基更换过程中去除球状体，建议使用 200 μL 移液器从显微镜培养皿的边缘小心吸出培养基，并在显微镜培养皿中沿壁或侧面添加培养基。
    10. 立即继续执行成像协议的步骤 2.2.1。
      注:从制备到成像和实际成像采集之间的过长间隔会影响细胞代谢（例如，通过改变培养基成分）、活力（一些用于终点分析的荧光探针具有毒性作用，在长时间孵育后会刺激细胞死亡）并导致 3D 组织丢失。如果必须比较多组球体或实验条件，则必须相应地制定实验设计，以保持分析组之间治疗、预处理和成像程序的时间尽可能相等。
  2. 图像采集
    注意:该协议描述了使用 Stellaris 8 Falcon （Leica） 共聚焦显微镜和 Leica Application Suite X （LAS X） 软件版本 4.7 对活球体进行多参数成像。但是，只需进行微小的修改即可在替代显微镜平台上进行此类分析。
    1. 成像前 30-60 分钟打开温度气候控制装置。设置必要的通风速度和温度 （35-37 °C）。
      注意:如果除了温度控制之外，成像过程中还必须控制气体浓度（例如 CO2 或 O2），则还应提前启动相应的设备，以达到成像前的必要条件。
    2. 打开显微镜和连接的设备（即 WLL 激光器、计算机、水浸物镜的水泵和其他操作电子块）。启动与精确显微镜设置一起提供的显微镜控制软件（例如，LAS X 机器模式 或 带环境控制的机器模式）并初始化载物台校准。
    3. 在软件中选择所需的物镜，并根据需要应用浸入液。
      注意:对于实时显微镜，建议使用具有足够（"长"）工作距离的水或甘油浸没物镜，例如 HC Fluotar L 25x/0.95 W VIS IR（2.4 mm 工作距离）、HC PL Apo 40x/1.25 GLYC（0.35 mm 工作距离）或至少 NA = 0.4 或更高的空气物镜。放大倍率和工作距离的选择取决于成像样品的性质和大小以及测得的荧光信号（亮度、量子产率、染色效率，参见例如，关于染料和纳米颗粒的讨论53）。大型物体（球状体或类器官，>500 μm 大小）、"生物反应器"或微流控芯片需要长工作距离物镜和较低的放大倍率，而单个细胞或细胞器的分析需要高放大倍率，通常通过"马赛克"成像实现。
    4. 在载物台上设置带有球体的显微镜培养皿。调整焦点并查找目标/感兴趣区域 （ROI）。
      注意:如果必须找到小的、微弱的荧光、对比度差或稀有的物体并且很难找到焦点，建议预先聚焦在显微镜培养皿的壁上，并通过蛇形石"筛选"感兴趣的物体表面，从孔的一个角落开始。
    5. 选择 Open Project 窗口，然后单击相应的图标 Create a New Project。为研究项目文件指定一个标准名称（例如，从"YY-MM-DD+ 描述"开始）。在成像过程中，所有生成的图像将自动保存到创建的项目 .lif 文件中。
    6. 打开 Acquisition 窗口。根据测量荧光的已知光谱特性（激发/吸光度和发射光谱），设置白光激光 （WLL） 激发波长和混合或共振扫描检测器（HyD S、HyD X 或 HyD R 型）的所需范围。选择 Line （行 ） 或 Frame types of scan（扫描的 Line 或 Frame types of scan）。
      注:对于大多数市售荧光染料，光谱特性可以在 LAS X Dye Assistant 包中找到（或添加）。选择具有与探针光谱特性兼容的适当光谱灵敏度范围的探测器，并且在 FLIM 的情况下，与光子计数兼容（即 HyD X 或 HyD R）。对于多参数成像，将 WLL 设置在多个激发位置（例如，对于 FAD/Flavins 和比率 MMIR1 O2 探针的两个荧光通道的同时成像 - 参考和敏感，激发/发射设置可能是 460 nm/510-590 nm HyD X1 和 614 nm/631-690 HyD X3 和 724-800 nm HyD R相应地在一个或两个连续扫描序列中）。分配适当的探测器来收集发射很重要，因为探测器可能具有不同的光谱灵敏度54。
    7. （对于 FLIM 是可选的）在 Acquisition 窗口中，选择 FLIM 模式以执行结合光子计数（衰变收集）的成像。将立即打开一个额外的"LAS X 软件中的 FLIM 模块"来导航和分析 FLIM 数据。
    8. （对于 FLIM 是可选的）根据预期的荧光团平均寿命选择 WLL 脉冲重复率。
      注意:必须调整激光脉冲的频率以收集完整的荧光衰减。这可以使用安装在显微镜上的 Pulse Picker 功能来完成。荧光衰减与激光脉冲的重叠将导致估计的荧光寿命缩短。建议的脉冲间隔比预期的平均荧光寿命长 4-5 倍（例如，寿命长达 5 ns，为 25 ns/40 MHz）。许多脉冲激光器具有固定的 80 MHz 重复频率（仅适用于高达 2-3 ns 的范围）。这对于为实验选择正确的荧光基团非常重要。
    9. 使用 FAST LIVE 模式开始预览成像，并调整成像对象在感兴趣部分上的精细焦距。
      注意: 严格遵守激光安全规则。始终考虑激光安全规则，并等到成像停止后再打开透射灯，观察目镜或样品。
      注意:在 FAST LIVE 模式下，600 Hz（如果使用双向 X 扫描模式，则对应于最大帧速率 4.43/s）的高速扫描会自动应用于图像，以 256 x 256 像素的分辨率，以防止荧光发生光漂白。如果荧光信号太弱而无法聚焦在物体上，则打开针孔（例如，至 3-4 AU）和/或增加激光强度。避免不完整的腐烂收集。
    10. （对于 FLIM 是可选的）通过在 FLIM 模块 窗口（实时 模式）中查看成像过程中出现的像素强度直方图，调整适当的激光强度/针孔大小和分辨率，以实现计数率 ~1 光子/激光脉冲限制（红线）。避免明显高于 1 以排除堆积效应的风险。如果需要，调整 WLL 脉冲重复率，以便在衰减窗口中获得完整的衰减收集（为避免不完整的衰减收集，请参阅步骤 2.2.8）。
      注意:如果光子数量（强度）不足以重建可靠的衰减以进行拟合分析或相量图云，请应用多次扫描重复（帧或线，或设置扫描时间），增加激光强度和/或牺牲分辨率（扫描的 ROI 大小）。请注意，降低激光重复率需要收集更多的光子才能实现可靠的衰变重建，并且可能需要对成像参数进行额外的校正。注意强光和长时间连续照明对细胞活力和代谢的潜在影响55。在每种情况下，对活力和代谢的负面影响可能不同，具体取决于激发光的强度、持续时间和波长，以及成像方式（例如，单光子共聚焦与多光子成像）。相应地调整成像参数，并在必要时，在中试实验中通过钙黄绿素 Green-AM 或碘化丙啶强度控制细胞活力/死亡56。在可能的情况下，应考虑进一步优化荧光探针染色方案，以在实时显微镜检查期间达到足够的荧光信号。
    11. （对于 3D z 堆栈，可选）在 Fast Live 模式下，设置坐标、扫描方向，并将其归因于 Z 堆栈窗口（XYZ 扫描模式）中的 Begin 和 End。选择 Z 步长或步长数。
      注意:虽然软件会根据使用的分辨率和扫描参数自动计算"最佳"步数，但实时 3D 重建通常需要较少的步骤来实现快速采集，例如，1-2 μm 步长、50-100 μm 堆栈大小、双向扫描，需要 2-3 分钟的总扫描时间。请注意，亚细胞器、细胞和 3D 细胞模型在测量过程中也会移动。此外，由于光穿透深度和散射极限，通常只能在共聚焦 FLIM 上实现 50-100 μm 的扫描深度。
    12. 应用所有必要的设置后，开始映像。
    13. 为图像指定适当的名称。
    14. 在透射光模式下搜索下一个成像对象，并使用先前优化的成像设置重复成像过程（步骤 2.2.8-2.2.12）。
      注意:对于基于强度的比较或强度比分析（例如，基于 MMIR O2 探针的氧合分析），请始终对所有分析对象保持相同的成像设置（放大倍率和物镜类型、激光强度、功率和脉冲频率、激发波长、探测器范围、针孔、扫描速度、像素停留时间和分辨率）。然而，由于荧光寿命不取决于荧光强度，并且需要收集适当数量的光子才能进行可靠计算，因此可以在实验过程中重新调整 FLIM 成像参数，以保持收集的光子数在不同处理或实验条件之间具有可比性。因此，对于需要基于强度和基于荧光寿命的分析的多参数分析，必须对比较实验组中的所有对象应用优化的通用成像设置。对于"仅 FLIM"比较，可以将采集的图像与成像设置略有不同进行比较，因为 LAS X 软件提供了单个图像测量的 IRF 计算42。但是，对于 LAS X 之外的 FLIM 拟合分析（例如 FLIMfit45），应针对每种不同的成像条件测量仪器响应函数 （IRF），因为它无法从成像软件中导出。因此，为了简化实验设计和工作负载，建议对数据集中的所有图像应用相同的成像设置。然后，可以使用具有被测光谱通道 57,58,59 发射特性的淬灭或快速荧光寿命荧光团（在 ps 范围内）进行相应的 IRF 测量，通过金纳米颗粒发光60 或通过多光子 FLIM61 的二次谐波产生信号.在 LAS X 软件中，可以通过右键单击感兴趣的文件并选择 Apply Image Settings 来为新项目加载先前优化的成像参数。
    15. 映像会话完成后，保存映像项目。为了完成成像过程，请从显微镜载物台中取出样品，并根据成像设施中实施的标准程序从浸没液（如果使用）中清洁物镜。关闭项目和软件。关闭显微镜、激光器和所有连接的设备。
    16. 继续进行成像数据分析（步骤 2.3）。
  3. 使用 LAS X FLIM 模块和 FIJI 进行 NAD（P）H/FAD-FLIM 相量图像处理
    注意:该协议描述了 NAD（P）H 和 FAD/Flavins 自发荧光 FLIM 实例上频域数据的成像球体的荧光寿命分析。NAD（P）H 自发荧光测量成为代谢分析的金标准，其中短和长 NAD（P）H 自荧光寿命成分分别与糖酵解或氧化磷酸化 （OxPhos） 相关。这可以通过相量图上沿代谢轨迹向游离 NAD（P）H 或蛋白质结合的 NAD（P）H 的测量标准品的偏移来分析31,62.为了分析代谢变化的轨迹，以及比较实验组之间图上相量云的位置（参见步骤2.3.6下面的注释），基于相量云的几何中心（质心）的计算，实施了简化的相量坐标分析29.所描述的协议演示了斐济中质心坐标的计算，并使用坐标测量相量图上两点之间的距离（例如，从球体 NAD（P）H 自荧光相量云的质心到"游离 NAD（P）H"理论点的距离）。同样，可以分析 FAD 和其他自发荧光信号。数据集 1 .lif （需要 LAS X 软件）或 .ptu 提供了用于学习此过程的文件格式 （补充文件 2， 补充文件 3， 补充文件 4， 补充文件 5， 补充文件 6， 补充文件 7， 补充文件 8， 补充文件 9， 和 补充文件 10).
    1. 在 LAS X 中打开 FLIM 模块，选择打开项目，然后加载球状体图像文件 （.lif） 以进行自发荧光 NAD（P）H/FAD 分析。
      注意:由于 FLIM 模块中存在潜在错误和中间数据丢失，请使用原始球状体图像文件 （.lif） 的副本进行 NAD（P）H/FAD 分析，同时保持原始文件不变。
    2. 选择单个图像并导航到 FLIM 分析界面。点击 Phasor 以访问相量图并激活相量分析模式。应用过滤器（中位数 或 小波）并设置 阈值 ，以最小化噪声并提高所有相量分析的数据可见性。选择谐波。对于基于 NAD（P）H 数据的代谢变化分析，请继续执行步骤 2.3.3-2.3.5。对于相量图的一般比较，请从步骤 2.3.6 开始。
      注意:将分析设置（滤波器类型、谐波、阈值、合并和相量 ROI）均匀应用于比较数据集中的所有图像。
    3. （NAD（P）H 分析可选）选择任何与数据集相关的图像，并使用 Draw Ratio Cursor for Two Components 选项来准确定位标准相量绘图空间的通用圆上 0.45 ns 的位置。该位置将被分配给游离 NAD（P）H 的纯均相溶液的平均荧光寿命，该溶液通常接近单指数衰减62。
      注:游离 NADH 和游离 NAD（P）H 在水溶液中具有相似的光谱特性和相似的荧光寿命值，具有两个短寿命分量，0.3 ns 和 0.7 ns63。因此，为了基于相量的分析的简单性，并且由于寿命分量之间的微小差异，它们的荧光衰减被认为是单指数的，这允许在宇宙圆上分配相量云。游离 NAD（P）H 形式的参考平均寿命也可以在相量空间中测量和绘制，以进行类似的分析。参考寿命是根据文献62 选择的;请注意，在其他来源中，可以发现溶液中游离 NAD（P）H 的值略有不同 （0.4 ns64）。
    4. （NAD（P）H 分析可选）通过右键单击图并选择 导出数据，导出具有分配的游离 NAD（P）H 寿命的相量图（参见步骤 2.3.3）。将相量图作为 .tiff 格式文件导出到指定的存储文件夹。
      注意:从 LAS X FLIM 模块导出的相量图图像的原始像素大小始终为 1024 x 600 像素。如果使用其他软件进行数据导出和预分析，请确保以相同的大小和分辨率导出所有相量图图像。
    5. 要导出与球体相关的相量云，请使用 LAS X FLIM 模块中的 Draw Cursor 工具选择图像上的球体 ROI。如步骤 2.3.4 中所述导出生成的相量图。
      注意:相量空间的相应 g 和 s（类似于 x 和 y）坐标将根据它们的寿命分配给所选 ROI 的每个像素，并转换为频域数据集64,65。具有相似 tf （相位寿命）和 tm （调制寿命） 值的像素簇将在图上形成云图案（相量云），其中颜色编码（范围从深蓝色到红色）将反映寿命值的丰富性。通过云在宇宙圆上或内部的位置，可以区分单指数或多指数衰减。一些测量介质表现出强（自）荧光，导致在相量图上出现相应的云，这不能简单地用强度阈值来去除。此模式将影响质心坐标计算，并且必须从导出的相量图中排除。使用球状体 ROI 可以从进一步的相量分析中排除不相关的像素。
    6. 对数据集中的所有球状体 ROI 重复相量图导出过程（参见步骤 2.3.4 和 2.3.6）。此外，检查导出的 .tiff 图像集，以保证完整的数据集以进行进一步的比较分析，并确保所有导出的图像具有相同的像素大小（请参阅步骤 2.3.4 中的注释）。
      注意:在协议的这个阶段，图像集必须包括具有游离 NAD（P）H 位置的相量（基于文献或经验获得的数据）和所有球状体 ROI（或替代 ROI 模式，如果特定分析需要）相量图。从此步骤开始，将在斐济进行进一步分析，然后在电子表格中进行分析。使用 分析工具 窗口，在 FIJI 中设置 比例 选项，并确保所有相量图图像都使用相同的单位类型进行校准，例如，仅以像素为单位。如果没有，请在 Set Scale 窗口中为所选单位设置长度（例如，对于基于像素的缩放，在 Distance in Pixels 字段中输入 1，并将长度单位设置为 Pixel）。为了进一步比较，请使用相同的单位类型测量所有导出的数据。
    7. （NAD（P）H 分析可选）确定相应导出的相量图图像上游离 NAD（P）H 平均荧光寿命的像素点位置（参见步骤 2.3.3）:用 FIJI 打开相量图像，放大图像以像素分辨率清楚地可视化通用半圆和 双分量比率光标 线之间的交点;使用 Rectangle ROI 工具选择交点。
      注意:确保矩形选择是交点周围的小区域，以便在下一步（步骤 2.3.9）中准确确定其坐标。
    8. （NAD（P）H 分析可选）打开 Analyze 工具，选择 Set Measurements 窗口，然后选择质心作为测量参数。单击分析工具窗口中的测量以确定游离 NAD（P）H 参考点的质心坐标。将这些坐标导出到电子表格。
      注意:Free-NAD（P）H坐标将用作参考点，以比较从该点到数据集中球体相量云位置的距离（在NAD（P）H FLIM自发荧光分析中表征糖酵解和OxPhos之间代谢变化的方法）
    9. 使用 FIJI 打开椭球体相量云的图像。打开 图像窗口 工具，选择 调整，然后选择 颜色阈值 在工具栏中。选择所选的阈值方法（例如，Otsu），并设置色相值和亮度值，以缩小选择具有最丰富像素坐标的相量云部分的参数。单击 Select 以定义集群区域。
      注意:对于必须分析的所有相量图图像，请保持相同的阈值参数。对于呈现的 NAD（P）H-FLIM 数据，选择了设置色相值 9 和亮度值 160 的阈值方法 Otsu 并将其应用于所有相量图像。或者，可以将所选区域复制到 ROI Manager（按照路径 Edit > Selection > Add to Manager） 创建相量 ROI 库以进行进一步分析。
    10. 在保持选择的同时，按照步骤 2.3.9 中描述的过程计算所选区域的质心坐标。将这些坐标导出到电子表格文件。
    11. 重复步骤 2.3.9 和 2.3.10 以确定所有 ROI 相量图像的质心坐标，以在电子表格中创建数据集。
      注意:使用 ROI Manager ROI 库有助于简化和组织 ROI 分析（请参阅步骤 2.3.10）
    12. （NAD（P）H 分析可选）打开包含来自不同比较组的导出的无参考 NAD（P）H 和球状体 ROI 坐标的电子表格。使用确定的坐标和以下等式计算每个单独的球体相量质心之间的距离，以参考游离 NAD（P）H 位置:
      figure-protocol-1
      其中，Xc 和 Yc 是质心坐标，Xf 和 Yf 是参考坐标。
      注意:仅当数据集中的所有质心都位于朝向参考点的同一线性轨迹上时，才适合应用质心参数来确定向参考寿命的偏移。为了检查这一点，必须将数据集中的所有质心与同一坐标空间中的参考点一起绘制，并执行线性趋势对齐。如果通过所有点绘制的线性趋势线的 R2 系数接近 1（例如，R2 为 0.8-0.99），则假定距离分析是合适的。
    13. 相应地组织所有数据以进行比较，并使用任何相应的软件（例如 Origin、MatLab）进行统计分析。根据数据集特征（分布正态性、统计单位数等）选择合适的统计检验。
      注意:对于 NAD（P）H 分析，根据实验条件比较距离值以表征代谢变化。要比较实验组之间的任何相量图，请执行 ROI 相量云质心坐标的比较。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

选择合适的球体形成方法
所选的球状体形成方法可以极大地影响球状体的大小、形状、细胞密度、活力和药物敏感性（图 2）。以前，比较了多种高通量（SphericalPlate 5D、实验室制造的微模具和微组织模具）和"中等通量"低附着（Biofloat 和 Lipidure 涂层的 96 孔板）方法对球体活力和氧合的影响29。

在这里，不同的形成方法会产生不同大小的球体，即使相同的初始浓度为 500 个细胞/球体。 形成 5 天后，与高通量方法相比，在低附着 96 孔板中形成的 HCT116 球体明显更大（图 2 和 表 2）。此外，低附着方法导致碘化丙啶染色（红色）检测到的坏死核心的明显发展，而使用其他方法（微组织、实验室制造的模具和球形板 5D）生成的球体显示出死细胞在球体上的弥散分布（图 2A）。球状体体积上细胞活力的这种差异也会影响氧气通过介质的扩散，进而受 O2 分压、消耗速率、温度和 O2 溶解度的影响。此外，在高通量方法中，营养物质会耗尽，并且由于相同体积内有大量球状体，因此废物积累得更快，因此需要更频繁的培养基更换（图 2A）。

使用最近表征和验证的 MMIR1 探针29 测量总体球体氧合，之前报道了详细的方案25。只能在高通量方法和低附着方法之间分别比较氧合（图 2B），因为所有比较的球状体形成方法的信噪比都不同。与微组织 （P 值 = 0.0697） 和实验室制造的微模具 （P 值 = 0.0005） 相比，球形板 5D 球体显示出较低的整体氧合（图 2C）。与琼脂糖模具方法相比，使用 5D 球形板产生的球体在距培养基空气界面表面更远的距离生长，从而导致静态培养中的 O2 递送速度变慢。这个假设是有效的，因为两个低附着板之间的氧合值以及两种琼脂糖霉菌方法之间的氧合值在统计学上是相似的（图 2D）。

figure-results-1
图 2:球状体形成方法会影响形态、大小、活力和氧合。（A） HCT116 球状体（初始接种密度 500 个细胞）生长 5 天，然后用碘化丙啶（细胞坏死，红色，1 μg/mL）和钙黄绿素 Green-AM（活细胞，绿色，1 μg/mL）染色 1 小时。低附着形成方法可产生包含坏死核心（红色）的更大球体。比例尺为 100 μm。（B） 通过不同方法产生的 HCT116 球体氧合（在球体形成过程中加入 20 μg/mL MMIR1 的初始接种 500 个细胞，6 天）显示微组织和实验室制造的微模具的氧合球体比 SphericalPlate 5D 多。（D） 5 天后面积正方形的球体大小。结果显示 6-16 个球体的平均 ± SEM。5D = 球形板 5D，MM = 微模法，MT = 微组织法。P 值 < 0.001 和 ****P 值 <0.0001 请单击此处查看此图的较大版本。

形成方法每孔的球状体数量每孔接种的细胞总量面积平方 （μm²）
微组织8140,500 个细胞/190 μl112,558 ± 15,702
实验室制造的微孔1859794,500 个细胞/mL53,460 ± 8,332
球形板 5D750375,000 个细胞/mL44,048 ± 7,259
脂质1500 / 200 微升257,148 ± 28,132
生物漂浮物1500 / 200 微升254,475 ± 21365

表 2:不同的球体形成方法会导致球体大小的差异，以面积平方衡量。

在为实验选择特定的球状体形成方法时，必须记住，添加纳米颗粒会影响球状体的形状。当使用带有圆底微孔的脂质涂层时，可能会发生探针沉淀，导致形成"卫星球体"或非圆形球体（图 3）。在商用 Biofloat 板中添加 O2 探针会导致非致密的球状体外围，这表明纳米颗粒与微孔板涂层的潜在干扰。球体的形态也会受到附着在移液管吸头上的灰尘的影响。悬浮细胞会粘附在灰尘上，从而影响形状。因此，建议使用盒装中提供的可再填充移液器吸头。

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图 3:透射光显微镜图像，其中包含非理想球体形成的示例。 纳米颗粒的不正确储存会导致探针沉淀，干扰球状体的形成。探头和灰尘干扰的示例。比例尺为 100 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

显然，球体形成方法会影响球体的大小、形态和活力，并导致其氧合的差异。琼脂糖模具的高通量方法（例如，市售的，如 MicroTissue 模具）与大多数实验兼容。它产生更具可重复性的形状，不会诱导纳米颗粒沉淀，可重复使用，并且可以与直接随访显微镜兼容。然而，对于大球状体 （>800 μm） 和长期培养，建议使用低吸附方法，因为高通量方法需要频繁更换培养基。在这种情况下，纳米颗粒沉淀问题及其对球状体形成的影响可以通过在球状体形成之前对 2D 单层培养物进行过夜预染色来避免（图 4）。

figure-results-3
图 4:为实时荧光显微镜选择球状体形成方法的建议算法。请单击此处查看此图的较大版本。

  

通过双光子 FLIM 显微镜对球状体进行多参数 FLIM 的 NAD（P）H 成像揭示了 HCT116 球状体的代谢异质性
NAD（P）H 是无标记代谢成像中的重要自发荧光标志物，糖酵解的寿命较短，而 OxPhos 的寿命较长，能够破译球状体和类器官31 等 3D 模型中代谢活动的空间分布。为了方便地分析 HCT116 球体中的 NAD（P）H 分布，使用了基于相量的定量方法进行自发荧光 NAD（P）H 分析，揭示了糖酵解和氧化磷酸化 （OxPhos） 连接状态。虽然 HCT116 球体的荧光强度图像没有显示球体之间的显着差异，但 NAD（P）H 的快速 FLIM 成像揭示了球体光学切片内的明显差异。在快速 FLIM 图像中，内部区域显示较短荧光寿命的球体用白色圆圈标记，将其标识为糖酵解核心（图 5A）。因此，根据糖酵解核心的存在与否，将球体分为两组，糖酵解核心组和非糖酵解核心组。采用基于质心的相量分析对两个不同组之间的差异进行统计分析，并测量从像素簇质心到游离 NAD（P）H 点的距离。如图 5B 所示，在相量图上，糖酵解组和非糖酵解组之间存在明显的像素簇差异。为了准确测量距离，使用 LAS X 软件中的 FLIM 模块精确标记相量图上的游离 NAD（P）H 点，然后导出到 FIJI 软件中以确定精确坐标。随后，按照方案 2.3，使用 FIJI 软件在每组的相量图中测量质心坐标。使用勾股定理计算从质心到游离 NAD（P）H 点的距离 （D），从而有助于分析 NAD（P）H 剖面，以区分 OxPhos 球体和具有糖酵解核心的球体。如箱线图所示，结果显示了糖酵解核心球体和非糖酵解核心组之间的显着距离差异（***P 值< 0.001）（图 5C）。该结果与快速 FLIM 成像一致，表明该相量分析方法适用于球体群 NAD（P）H 散度的定量分析。此外，为了验证这种方法是否适用于比较两个球体组之间的距离，对两组的质心和游离 NAD（P）H 点进行了线性回归分析（图 5D）。结果表明，质心与游离 NAD（P）H 对齐，具有较高的相关系数 （R2 = 0.997），验证了比较距离推断球状体组之间 NAD（P）H 差异的可行性。

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图 5:使用低吸附板制成的 HCT116 球体的相量分析:糖酵解和非糖酵解核心通过双光子 FLIM 对 NAD（P）H 分布的比较。 采集参数:激光强度:15%，分辨率:512 x 512 像素，例如 741 nm/em。411-491 纳米。（A） 荧光强度和快速 FLIM 图像显示 HCT116 球体中的 NAD（P）H 分布，区分具有糖酵解核心的球体（左）和没有糖酵解核心的球体（右）。快速 FLIM 图像中的白色圆圈显示较短的寿命区域，定义了糖酵解核心。初始接种密度:50 个细胞（左）和 500 个细胞（右），孵育时间:6 天，比例尺:50 μm。（B） 使用 LAS X FLIM 模块和 FIJI 软件测量从 HCT116 球体质心到相量图上游离 NAD（P）H 点的距离的方法（D:距离）。对于 HCT116 球体，相量图采用小波滤波器和阈值 10。（C） 显示从质心到游离 NAD（P）H 点的距离差异的箱线图，比较糖酵解核心组和非糖酵解核心组 （***P < 0.001）。（D） 来自糖酵解核心、非糖酵解核心组和游离 NAD（P）H 理论坐标的相量图质心的线性拟合表明，R2 = 0.997 准确线性对准，允许直接比较糖酵解核心和非糖酵解核心球体之间的距离差。 请单击此处查看此图的较大版本。

人牙髓干细胞 （DPSC） 球体中 FAD 自发荧光和缺氧的多重分析
牙髓干细胞球体是一种有吸引力的实验工具，用于不同组织（包括成骨细胞）的生物制造 25,66,67。然而，它们的活力和新陈代谢很少被研究。这些干细胞来源的球体显示相当小的尺寸 （<200 μm）、FAD/Flavins 的亮绿色自发荧光（后来称为 FAD）（例如 460 nm，em. 550 nm）以及"直接"和"反向"低氧梯度的存在29。图 6 展示了球体氧合（在 O2 传感纳米颗粒 MMIR 的帮助下）和 FAD 的自发荧光 FLIM 的联合共聚焦比率成像的结果。在直径为 69 mm 的球体中观察到"经典"直接氧合梯度，而较大的 （141 μm） 球体则显示出"倒置"梯度。将 FAD-FLIM 添加到这些测量中有助于验证氧化代谢的差异，如快速 FLIM 和相量图所示:小球体显示出较长 FAD 寿命的更突出部分，这可能表明较小尺寸球体中的糖酵解活性更高。

figure-results-5
图 6:黄素自发荧光（例如 460 nm/em. 510-590 nm）和氧合（使用 MMIR O2 敏感纳米颗粒的强度比分析:例如 614 nm/参考 em. 631-690 nm / 敏感 em. 724-800 nm）在通过高通量自产琼脂糖微模具法（共聚焦 FLIM）生产的不同大小（小:188 个细胞/球体，大:820 个细胞/球体）的 hDPSC 球体中的多参数成像示例。（答，B） 大 （A， "B Sphs"） 和小 （B， "S Sphs"） hDPSC 球体中氧合强度比和黄素自发荧光寿命成像的代表性示例。 （C，D）基于相量云几何中心的比较，使用相量图云分析对黄素-自发荧光寿命进行比较分析。（E） 相量图上来自大 hDPSC 球体 （B Sphs） 和小 hDPSC 球体 （S Sphs） 的黄素自发荧光的像素质心（几何中心）坐标。两种不同的颜色代码适用于不同的 FLIM 分析方法，其中带有 τ 的颜色编码显示平均光子到达时间（FAST-FLIM 图像）分布，而带有 τ φ-tau 相位的颜色编码对应于相同球体中荧光寿命的相量-FLIM 分析。请单击此处查看此图的较大版本。

人 iPSC 球体中 FAD 自发荧光和细胞死亡的多重分析
人诱导多能干细胞 （iPSC） 球状体通常用作诱导组织特异性分化和类器官生产过程中的第一步，例如，在神经类器官培养的情况下。根据它们的处理和特定的生成方案，类器官的活力和随后的可重复性可能会受到严重影响。类器官和包含神经祖细胞的球状体的无损研究对于生长和组装的神经组织在其发育过程中的结构评估、监测和预测质量至关重要68,69。图 7A 显示，自发荧光黄素/FAD 分子的非破坏性 FLIM 可以为我们提供有关 iPSC 球体活力的信息。在商业超低贴壁板孔 （Corning） 中接种 9,000 个 iPSC 后 4 天进行成像。成像前，用 0.5 μg/mL 碘化丙啶 （PI） 对球体染色 1 小时以观察死细胞。4 天后，在这些接种密度为 9,000 个细胞的 iPSC 球体中未观察到坏死核心。在黄素/FAD 自发荧光的相应相量图上可以区分三种主要模式（图 7B 左图）:培养基自发荧光模式（洋红色），模式（平均 τ φ - tau 期，~2.6 ns）对应于无 PI 区域 （ROI1） 和模式（平均 τ φ ~3.1 ns）与细胞死亡标志物 - 染色 （ROI2） 相关的区域。PI 处理和未处理的 iPSC 2D 培养物的额外比较表明，PI 对长寿命黄素/FAD 相量模式的外观没有影响（图 7C），表明黄素/FAD 寿命的增加可以是 iPSC 及其衍生细胞活力受损的独立标志物。虽然这一观察结果与最近关于基于强度的成像70 的报告一致，但我们不能完全排除 FAD 发射通道 （506-582 nm） 存在碘化丙啶强度。需要进一步的调查来证明黄素/FAD 寿命变化与细胞死亡潜在事件之间的联系。基于多参数相量的简单 ROI 区域分析展示了一种快速筛选和数据分析的优雅方法。

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图 7:iPSC 球状体中的黄素自荧光共聚焦 FLIM 和碘化丙啶染色，以评估细胞活力。 （A） 将 9,000 个细胞接种到超低贴壁板（康宁）中后 4 天，iPSC 球状体的黄素自发荧光（左）和碘化丙啶 - PI（右）FLIM，成像前进行 PI 染色（0.5 μg/mL，1 小时）。（B） 黄素自发荧光（左）和碘化丙啶（右）整体图像和相应的 ROI（ROI1 - 绿色和 ROI2 - 红色，培养基自发荧光 - 品红色）的相量图分析。ROI 是根据碘化丙啶标记的存在来选择的。（C） 用 PI 处理和未处理的 iPSC （0.5 μg/mL，1 h） 的 2D 培养物中黄素自发荧光的快速 FLIM 和相量图分析。在 469-542 nm 范围内收集黄素激发时，未检测到 PI 染色对黄素长荧光寿命外观（对应于粉红色圆圈内的相量模式）的影响。该检测器范围与 PI 的激发光谱 （550-720 nm） 不重叠。当收集到更宽的 FAD 激发范围 （469-590 nm） 时，可以注意到 PI 的影响。图像颜色编码对应于平均光子到达时间值 （fast-FLIM）。成像参数为 T = 35 °C，25X/0.95 水浸物镜 （A-B），40X/1.25 甘油物镜 （C）。黄素:例如 460 nm，em。506-582nm （A-B），针孔 4 AU。PI:例如 535 nm，em。584-667 nm，针孔 1 AU。通道:Intensity 和 Tau。40 MHz 的重复频率收集黄素自发荧光的完全衰变。相量分析设置;谐波 1、阈值 1 （AB）、47 （C）、中值滤波器 17 （AB）、11 （C）。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件 1:关于球体形成的附加协议。请点击此处下载此文件。

补充文件 2:糖酵解核心和非糖酵解 core.lif 的 FLIM 数据。请点击此处下载此文件。

补充文件 3:糖酵解 core.ptu 的 FLIM 数据。请点击此处下载此文件。

补充文件 4:non-glycolytic core.ptu 的 FLIM 数据。请点击此处下载此文件。

补充文件 5:糖酵解核心快速FLIM.tif 请单击此处下载此文件。

补充文件 6:非糖酵解核心快速FLIM.tif 请单击此处下载此文件。

补充文件 7:Glycolytic core free NAD（P）H point.tif 请单击此处下载此文件。

补充文件 8:糖酵解核心相量 plot.tif 请单击此处下载此文件。

补充文件 9:非糖酵解性无核心 NAD（P）H point.tif 请单击此处下载此文件。

补充文件 10:Non.glycolytic core phasor plot.tif 请单击此处下载此文件。

Discussion

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多细胞球状体正在成为肿瘤和干细胞生态位微环境研究、药物发现和生物制造"组织构建块"开发的首选方法。球状体的异质性内部结构、营养物质梯度和氧合可以在相对简化和可访问的环境中模拟体内组织和肿瘤的梯度。由于需要更高的方法透明度26,28 和标准化71，这些协议有望帮助研究人员为实时定量荧光寿命成像显微镜实验选择最佳的球状体形成方法。所介绍的方法利用了细胞染色纳米粒子传感器和内在细胞自发荧光，它们可以很容易地与细胞死亡染色相结合。

最关键的步骤是球状体形成方案;因此，对于基于琼脂糖的高通量方法，必须充分平衡培养基的琼脂糖模具。平衡时间不足将导致剩余 PBS 中的营养物质被稀释，并为球体异质性带来额外的因素 21,26,72,73。还必须目视检查新鲜制作的琼脂糖模具是否存在气泡、微裂纹和其他缺陷。

虽然纳米颗粒悬浮液对成像有效，但在低附着形成方法中，纳米颗粒悬浮液可以显示自聚集并导致形成形状不规则的球体。这通常可以通过向培养基中添加血清或在球状体形成之前对单层细胞培养物进行预染色来缓解。通常，在球状体压缩过程中，添加少量纳米颗粒（例如，初始染色浓度的 10%）也有助于对球状体的增殖区进行染色。最后，在所有形成方法中使用"无尘"无菌移液器吸头也很重要。

在成像实验中，必须始终考虑照明对细胞活力的潜在影响。因此，了解对每个实时成像实验产生负面影响的风险因素非常重要。一般来说，光损伤涉及多种机制:（1） 局部温度高升高，（2） 机械应力，以及 （3） 光化学应力（氧化和自由基反应）74。根据成像方式（例如，单光子共聚焦与多光子成像、连续与脉冲照明模式、探测器的灵敏度以及不同波长的光源功率（如果可以进行激发调谐）、细胞和组织类型（例如，高效吸收光色素或其他自发荧光分子的组织类型依赖性积累、3D 与 2D 组织、 生长和成像介质组成）、荧光探针的来源（例如，光敏特性）不同的风险因素组合可在成像过程中引起光毒性。此外，即使光照后没有观察到细胞死亡的增加，光功率依赖性的早期死亡前对线粒体和代谢的影响也可能干扰实验分析和解释55。

为了排除对实验结果的光毒性影响，与完整对照相比，研究人员应对细胞活力和细胞形态变化进行一般监测，或使用细胞死亡探针来估计光照后细胞死亡率的增加。如果进行代谢实验，则应在中试实验中相应地优化成像参数，以估计和最小化成像对测量的代谢参数的影响。在氧敏感探针的情况下，由于所谓的"光诱导 O2 消耗"效应，可以通过突然增加 O2 敏感染料磷光寿命和强度（参考与 O2 敏感染料的强度比的相应变化）来轻松跟踪光过量53,75.这可以通过对具有不同光功率参数的延时实验进行动力学曲线分析来轻松完成，例如，使用以下已发布的方案25。为了"捍卫"脉冲照明（例如，用于 TCSPC-F（P）LIM 显微镜），最近的研究表明，与稳态照明测量相比，它对 ROS 产生和探针光漂白的影响最小76,77，指出了 TCSPC-FLIM 与传统的基于强度的成像方法相比的额外优势。

所提出的球体形成方法的主要局限性在于直接和长期监测应用。琼脂糖模具需要长工作距离物镜（或额外的正置显微镜或荧光立体显微镜），因为琼脂糖层较厚，并且 5D 球板的材料可能会干扰红色荧光通道（O2 探针）中的测量。高通量方法产生的球体大小受微孔直径的限制，需要频繁更换培养基以避免培养基耗尽和酸化。由于所有这些限制，我们建议将 3D 培养皿（微组织）用于需要高通量的实验（例如，用于 3D 生物打印应用）和用于"中等通量"基础研究的低附着方法，也需要较少的细胞数量。

如果配备近红外 （NIR） 敏感相机、基于发光二极管 （LED） 的激发和适当的物镜25，则在广泛可用的倒置显微镜上可以负担得起比率氧合监测和传统的基于活细胞荧光染料的显微镜实验。为了获得更合适的光学切片和 FLIM，建议使用现成的商用共聚焦显微镜系统（如此处所述）。虽然我们还描述了一种检测 NAD（P）H 自发荧光的方法，需要更昂贵的双光子 FLIM 显微镜，但有许多不同的方法，与共聚焦 FLIM 系统兼容且有用，理想情况下配备白光激光和混合或 SPAD 检测器。这些包括细胞代谢评估、FRET-FLIM 生物传感器蛋白、细胞和组织力学成像、特定细胞和组织类型的自发荧光以及通过 FLIM-FRET31 可视化的受体-药物相互作用。

供应商提供的 FLIM 采集和分析软件可能会影响实验的成功，因为并不总是能够以与下游开源分析兼容的格式导出 IRF 或图像。后处理是 FLIM 分析工作流程的重要组成部分，但尚未得到普遍标准化或接受。与相量方法相比，曲线拟合需要更多的光子和更多的计算能力。FLIMfit45 （全局和逐像素拟合）和 Flimview78 是用于曲线拟合分析的开放软件，而 PAM79、FLUTE64 和 AlliGator80 用于相量分析。FLIMJ46 是一个有用的 ImageJ 插件，适用于这两种方法。总而言之，这些选项有助于改进后处理例程，使其更快、更通用且用户友好。

Acknowledgements

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这项工作得到了根特大学特别研究基金 （BOF） 资助 （BOF/STA/202009/003;BOF/IOP/2022/058）、佛兰德斯研究基金会（FWO，I001922N）和欧盟，fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN No. 101073507。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGibco25300-054也可从 Sigma
10 mL 血清移液管VWR612-3700提供类似产品，也可从 Sarstedt、Corning、VWR 和其他公司获得
12 孔细胞培养板、无菌Greiner bio-one665-180Sarstedt、Corning 和其他公司也提供类似的产品。
12 孔室载玻片，可拆卸Ibidi81201也可从 Grace Bio-Labs、ThermoFisher Scientific 等处获得
15 mL 离心管Nerbe plus02-502-3001Sarstedt、Corning、VWR 和其他公司也提供类似产品
3D 培养皿微模具微组织Z764000-6EA
6 孔细胞培养板，无菌Greinerbio-one657160Sarstedt、Corning、VWR 和其他公司也提供类似产品
70% 乙醇ChemLabCL02.0537.5000
BiofloatSarstedt83.3925.400市售包被 96 孔板，用于球状体形成
钙黄绿素 Green-AMTebubioAS-89201稀释 1：1000
CellSens Dimension 软件奥林巴斯第 3
人胎盘胶原蛋白，IV 型SigmaC5533用于制备 0.07 mg/mL 胶原蛋白和 0.03 mg/mL 聚-D-赖氨酸涂层显微镜
共聚焦 FLIM 显微镜徕卡显微系统N/AStellaris 8 Falcon 倒置显微镜，带白光激光器、HyD X 探测器、气候/T 控制室 （OkoLab）、25x/0.95 W 物镜
D（+）-葡萄糖Merck8342制备 1 M 储备液，1：100，用于制备成像培养基（终浓度 10 mM）
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），不含酚红、葡萄糖、丙酮酸和谷氨酰胺Sigma-AldrichD5030-10X1L用于制备成像培养基
胎牛血清 （FBS）Gibco10270-098也可从 Sigma 获得。使用前需要热灭活。
HEPES （1M）Gibco15630-080稀释度 1/100 用于制备成像培养基（终浓度 10 mM）
人结肠癌细胞 HCT116ATCC
ImageJNIH版本 1.54f
徕卡应用套件 X （LAS X）徕卡显微系统版本4.6.1.27508
L-谷氨酰胺Gibco25030也可从 Sigma 获得。以 1：100 的比例涂抹。
Lipidure-CM5206AmsbioAMS.52000034GB1G
McCoy's 5A，需要添加 1 mM 丙酮酸钠和 10 mM HEPESVWR392-0420HCT116 细胞的标准生长培养基
微图案 3D 打印 PDMS 邮票N/AN/A 由微系统技术中心提供，根特大学
NaClChemlab的 Jan Vanfleteren 教授博士CL00.1429.100
Neubauer 腔室Fisher Scientific15980396
O2 探针：MMIR1N/AN/A完整的表征、验证和一些应用可在以下网址找到： https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110
v1
PBSFisher scientificGibco18912014PBS 片剂溶于 500 mL 蒸馏水中。
笔式链球菌:P恩尼西林 （10,000 U/mL） / 链霉素 （10,000 &μ;g/mL） 100x 溶液Gibco15140-122也可从 Sigma 获得。以 1：100 的比例涂抹。
聚-D-赖氨酸SigmaP6407-5mg用于制备 0.07 mg/mL 胶原蛋白和 0.03 mg/mL 聚-D-赖氨酸包被的显微镜培养皿
碘化丙Sigma-Aldrich25535-16-4细胞死亡染色，使用 1 和微量;孵育 1 小时时 g/mL，PVDF
针式过滤器 0.22 µmNovolabA35149Sarstedt、Corning、VWR 和其他公司也提供类似产品
丙酮酸钠 （100 mM）Gibco11360-070稀释度 1/100 用于制备成像培养基（终浓度 1 mM）
球形板 5D 24 孔KugelmeiersSP5D-24W
无菌培养皿Greiner bio-one633181Sarstedt、Corning、VWR和其他公司也提供类似的产品
组织培养瓶（25 cm²VWR734-2311Sarstedt、Corning、VWR 和其他公司也提供类似的产品
组织培养瓶 （75 cm²）VWR734-2313类似产品也可从 Sarstedt、Corning、VWR 和其他公司获得
U 型底 96 孔板VWR10062-900类似产品也可从 Sarstedt、Corning、Greiner Bio-one 和其他公司获得
超纯琼脂糖Invitrogen （Life Technologies）16500-500其他类型的琼脂糖，如琼脂糖低熔点（A-9414，Sigma）、常规用琼脂糖（A-9539，Sigma）
宽场荧光倒置显微镜OlympusN/A倒置荧光显微镜 IX81，带电动 Z 轴控制、CoolLED pE4000（16 通道，365-770 nm）、ORCA-Flash4.0LT（滨松）cMOS 相机、玻璃加热板 Okolab、CellSens Dimension v.3 软件和空气物镜 4x/0.13 UPlanFLN 和 40x/0.6 LUCPlanFLN。（可选，用于高分辨率成像）60 倍/1.0 LUMPLFLN 水
版 将 啶

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