从植物系统中纯化重组蛋白通常会受到植物自身蛋白的干扰。本研究提供了一种有效从Nicotiana benthamiana质外体提取和纯化分泌型重组蛋白的方法。
本文内容
摘要
摘要
植物是一种正在发展的真核表达系统，可用于生产治疗性蛋白质。从植物中纯化重组蛋白是生产过程中的关键步骤之一。通常，蛋白是从总可溶性蛋白（TSP）中进行纯化的，而细胞内多种杂蛋白和细胞色素的存在给后续的蛋白纯化步骤带来了挑战。此外，大多数治疗性蛋白（如抗原和抗体）需要分泌表达以获得正确的糖基化修饰，而不完全修饰的蛋白会导致抗原或抗体结构不一致。本研究介绍了一种更有效的方法，用于从植物胞外空间（apoplast）中获得高纯度的重组蛋白。将重组绿色荧光蛋白（GFP）设计为分泌至Nicotiana benthamiana的胞外空间，然后采用渗透-离心法进行提取。从提取的胞外液中，通过镍亲和层析进一步纯化GFP-His。与传统的TSP提取方法相比，从胞外空间进行纯化可获得更高纯度的重组蛋白。这代表了植物表达生产系统的一项重要技术进步。
引言
目前，多种植物生产的重组治疗性蛋白质正在研究中，包括抗体、疫苗、生物活性蛋白、酶和小分子多肽1,2,3,4,5,6。由于植物具有安全性高、成本低以及能够快速扩大生产规模的优势，其作为治疗性蛋白质的生产平台正被越来越广泛地应用7,8。植物系统中的蛋白质表达与修饰，以及蛋白质纯化，是决定植物生物反应器生产效率的关键因素9,10。提高植物的生产效率并获得高纯度的目标蛋白质，是基于植物的生产系统面临的核心挑战11,12。
重组蛋白的亚细胞定位和修饰取决于其N端编码的特定信号肽，该信号肽在基因表达过程中将蛋白靶向至最终的细胞器目的地。根据蛋白的独特性质，可设计使其定位于质外体、内质网（ER）、叶绿体、液泡或细胞质13。对于抗原和抗体而言，分泌型蛋白更受青睐。在分泌之前，蛋白需经过内质网和高尔基体，以实现正确的折叠和翻译后修饰14,15,16。
在植物中表达后，重组蛋白必须从植物提取物中进行纯化。通常，蛋白是从总可溶性植物提取物中纯化而来，其中含有大量细胞内蛋白、错误折叠和未修饰的产物以及细胞色素17。为了去除杂质，植物提取物需要经过复杂的分级处理，包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）特异性亲和层析、植酸沉淀、聚乙二醇沉淀，以及温度和pH的调节18,19。这些去除杂质的步骤耗时费力，且可能影响蛋白的质量。
植物细胞质膜以外的细胞区室被称为质外体，包括细胞壁、细胞间隙和木质部20。其水相部分通常称为质外体洗脱液（AWF）。AWF 含有细胞分泌的多种分子，用于调控多种生物学过程，如物质运输、细胞壁代谢以及应激反应21，22。与总可溶性蛋白（TSP）相比，AWF 的分子组成较为简单。从 AWF 中提取重组蛋白可避免细胞内蛋白、错误折叠产物及胞质残留物的污染。简而言之，在负压条件下，提取用脂质通过气孔进入叶片，随后通过温和离心收集 AWF23。尽管 AWF 的分离技术已被广泛用于研究质外体内的生物学过程24，25，26，27，但在基于植物的生产系统中尚未得到充分开发。
提高植物生产效率并获得高纯度的目标蛋白是植物生产系统面临的核心挑战28。通常，蛋白从含有大量胞内蛋白、错误折叠和未修饰产物以及细胞色素的总可溶性植物提取物中纯化，后续纯化过程成本高昂2930。采用质外体洗脱液（AWF）蛋白提取方法，可有效提取分泌至质外体的外源重组蛋白，显著提高重组蛋白的均一性，并降低蛋白纯化成本。本文利用信号肽PR1a引导外源蛋白分泌至质外体空间，并介绍一种从N. benthamiana的AWF中纯化重组蛋白的详细方法。
方案
1. 本氏烟（N. benthamiana）植株的准备
- 将幼苗块放入托盘中，加入1 L水，浸泡约2小时，直至完全饱和。
- 均匀撒上野生型 N. benthamiana 将种子置于育苗块上，盖上盖子，在适宜条件下萌发1周。随后进行培育 N. benthamiana 在18小时光周期、24 °C、相对湿度45%的温室中培养，每2周施肥一次。
- 种子发芽后，用镊子轻轻取出一株幼苗，注意不要损伤其根部。在新培养盘中央挖一个小坑，将幼苗放入其中，并用土壤轻轻覆盖根部。盖上盖子，继续培养。
- 幼苗长至三片叶子时继续培养，保持盖上盖子；当第四片叶子长出时，移除盖子th 真叶出现。
- 在农杆菌浸润前，让植物继续生长两周。
2. 重组GFP-His的构建
- 根据基因序列对N. benthamiana进行密码子优化，并合成GFP和PR1a（MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG）。
- 使用Xba I和Sac I酶对pCAMBIA1300载体进行双酶切（见材料表）。
- 使用上游引物（TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
TGTTCTCTTTTC）和下游引物（TCCTCG
CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
GTGGG）扩增PR1a；使用上游引物（CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG
CAAGGGCGAGGA）和下游引物（GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG
GTGAGATCTTCCGGACTTGT）扩增GFP。 - 通过同源重组将PR1a和GFP克隆至pCAMBIA1300植物表达载体中。转化至E. coli后，筛选单克隆并送公司测序。比对测序结果，正确的质粒即为重组质粒pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His，简称p35s-PR1a-GFP-His。
3. 在 N. benthamiana 中生产 GFP-His
- 加入1 µL的GFP质粒到50 µL的 农杆菌 感受态细胞GV3101，轻柔混匀后加入电转杯中，电击后取出。
- 铺板转化菌液 Agrobacterium tumefaciens 在含有 50 µg/mL 卡那霉素（Kan）和 50 µg/mL 利福平（Rif）的 LB 固体培养基平板上倒置培养，28 °C 培养 48 小时。pCAMBIA1300 载体具有卡那霉素抗性，农杆菌具有利福平抗性；只有正确的 农杆菌 可在含卡那霉素（kan）和利福平（rif）的平板上生长。单克隆克隆即为阳性转化子，命名为 A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG)
- 使用无菌牙签挑取适量 AtGPG，接种于 4 mL 含 Kan 和 Rif 的液体 LB 培养基中。在 28 °C、220–300 rpm 条件下培养 24 h。
- 将菌液按1:50比例转接至新鲜LB培养基（含50 µg/mL Kan、10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）、20 µM 乙酰丁香酮（AS）），于28 °C、220–300 rpm条件下振荡培养10–12小时。
- 通过离心在1500 x g条件下收集细菌 g 10分钟，然后用1 mL MMA（10 mM MgCl₂）重悬沉淀2，10 mM MES pH 5.6，100 µM AS。
- 测量并调整 AtGPG 的光密度（OD）至 OD600使用MMA将浓度调至0.8，室温下继续孵育细菌2-4小时。用无针注射器吸取菌液，轻轻按压在叶片背面，施加压力使溶液渗入叶片。每株植物仅注射中间的3-4片叶片。
- 继续培养 N. benthamiana 在温室中培养3-4天后，收获叶片用于蛋白质提取。
4. 观察GFP的亚细胞定位
- 农杆菌浸润48小时后，选择一片平坦的叶片，使用6 mm打孔器夹住叶片进行打孔。
- 在载玻片上滴加30%蔗糖溶液，将叶片样品背面朝上放置，然后盖上盖玻片。
- 将激发波长设为488 nm，在400倍放大后于490–550 nm范围内检测绿色荧光。载玻片制备完成后立即拍摄第一张照片，10分钟后拍摄第二张。
5. 从植物中提取GFP
- 离体液提取
- 在农杆菌浸润后第3天，采集完整的新鲜表达重组GFP的N. benthamiana叶片。操作时应轻柔处理叶片，保持叶片完整性，以避免细胞内蛋白外泄。采集后立即用于下一步实验，防止蛋白降解。
- 用预冷的灭菌去离子水（ddH2O）冲洗叶片表面，去除杂质。
- 称取新鲜叶片20 g，将叶片背面朝下浸入盛有100 mL预冷的100 mM磷酸缓冲液（PB，分别配制100 mM Na2HPO4和100 mM NaH2PO4，按2.2:1比例混合，pH 7.0）的200 mL广口烧杯中。用100目尼龙细网纱（见材料表）和塑料板覆盖叶片。
注意：预冷可防止蛋白降解。缓冲液体积可根据实验规模调整。确保所有叶片完全浸没。 - 将烧杯放入真空泵中，施加0.8 MPa真空处理1分钟，然后迅速恢复至常压。
- 从缓冲液中取出叶片，用吸水纸轻轻吸干表面液体。将叶片卷起，用网纱包裹，每5 g叶片放入一个50 mL离心管中。为收集离体液，将卷好的叶片尖端朝上置于管中，并用管盖固定网纱。
- 在4 °C条件下，以500 × g离心5分钟。取出叶片，用移液器收集管底的离体液。每管可获得约5 mL离体液。
注意：为最大限度减少细胞内蛋白的干扰并提取尽可能多的离体液蛋白，可重复提取2–3次，但不得超过3次。
- 总可溶性蛋白提取
- 将20 g叶片在液氮中研磨成细粉，按1:2比例加入提取缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，10%甘油，1% Triton X-100，0.034% β-巯基乙醇（见材料表））。
- 在4 °C下，将匀浆液置于垂直摇床中振荡30分钟，然后在4 °C下以13,000 × g离心15分钟。
- 将上清液转移至新离心管中，再次离心15分钟。将澄清后的上清液转移至另一新管中。
- 将上清液通过0.22 µm滤膜（见材料表）过滤，获得总可溶性蛋白提取物。
6. 使用镍（Ni）亲和层析纯化 GFP-His
注意：所有步骤均在 4 °C 下进行。
- 加入Ni Sepharose Excel树脂（参见 材料表) 按照相对于第 5.1.6 步所得蛋白提取物体积的 1:1000 比例，加入到离心管中。树脂体积为蛋白提取物体积的 1/1000th 蛋白提取物体积的
- 用10倍树脂体积的ddH₂O洗涤Ni树脂3次2分别用 O 和 PB（pH 7.0）缓冲液依次处理，并去除上清液。
- 将蛋白提取物与Ni树脂孵育2小时，以确保充分结合。在500 x g下离心 g 5 分钟，以去除上清液中未结合的蛋白质。用 20 倍树脂体积的 PB 洗涤 3 次。在 500 × g 条件下离心 g 5 分钟后离心并移除上清液。
- 加入10倍树脂体积的250 mM咪唑洗脱液（50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，10%甘油，250 mM咪唑）洗脱GFP-His，收集上清液。
7. 蛋白质的考马斯亮蓝染色
- 向40 µL蛋白样品中加入10 µL 5x SDS上样缓冲液，煮沸10分钟，然后在15% SDS-PAGE凝胶中以110 V电泳60分钟。
- 用考马斯亮蓝染色液（0.1% R-250，25%异丙醇，10%冰醋酸）染色蛋白凝胶2小时。
- 倒掉染色液，用脱色液洗涤2小时。观察凝胶，凝胶上的蛋白质将呈现蓝色。
8. 蛋白质的Western印迹
- 向40 µL蛋白样品中加入10 µL 5x SDS上样缓冲液，煮沸10分钟，然后在15% SDS-PAGE凝胶中以110 V电泳60分钟。
- 将蛋白以280 mA电流转移至0.45 µm硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉封闭1小时。
- 将抗His标签抗体按1:5000稀释，与膜孵育1小时。使用含吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST）洗涤膜4次，每次5分钟。
- 将抗小鼠二抗按1:10000稀释，与膜孵育1小时。使用TBST洗涤膜4次，每次5分钟。
- 按1:1比例混合显影剂（见材料表），取400 µL加入膜上，反应1分钟。使用成像仪曝光1分钟后拍照。
9. 蛋白质浓度测定
- 将5 µL蛋白质加入1 mL Bradford 1x染料试剂中，反应5分钟。
- 调零后测定OD595值，并根据标准曲线计算蛋白质浓度。
10. 蛋白质定量 31
- 将蛋白质样品与标准品一同进行蛋白质印迹分析。
- 使用 ImageJ 1.5.0 灰度分析，通过与标准品的比值对 GFP 进行定量。
结果
GFP-His 被靶向分泌至N. benthamiana的质外体空间
将GFP克隆到pCAMBIA1300质粒中，其N端带有PR1a信号肽以实现分泌，C端带有His标签用于纯化，构建得到p35s-PR1a-GFP-His（图1A）。该重组蛋白在N. benthamiana中瞬时表达，于农杆菌浸润后3天通过抗His抗体进行Western blot检测，观察到一条30 kDa的条带（图1B）。质壁分离是指用高渗溶液处理叶片，使细胞壁与细胞膜分离的过程32。为了确定GFP是否定位于质外体，我们使用30%蔗糖溶液诱导叶片发生质壁分离。荧光显微镜观察显示GFP-His存在于质外体中（图1C）。通过真空浸润-离心法提取的质外体洗涤液（AWF）蛋白中也含有GFP-His（图1D）。这些结果表明，GFP-His成功分泌至N. benthamiana叶片的质外体洗涤液中，可进一步从中提取并用于后续纯化。
从AWF中纯化蛋白质
AWF提取的效率显著影响最终的GFP产量。在已发表的AWF提取方案24,25,26,27基础上，我们测试了多种溶液以优化分泌型GFP-His的回收效果。本研究考察了八种提取溶液：25 mM Tris-HCl (pH 7.4)、100 mM NaH2PO4 (pH 4.5)、50 mM NaCl (pH 7.1)、40 mM KCl (pH 7.0)、20 mM CaCl2 (pH 5.7)、100 mM PB (pH 7.0)、10 mM MES (pH 5.6) 和 ddH2O (pH 7.0)。其中，PB提取出的AWF和GFP-His量最多，比其他溶液高出4倍以上(图2A,B)。比较不同pH值的PB溶液发现，在中性至弱碱性条件（pH 6.0、6.5、7.0、7.5和8.0）下，AWF和GFP-His的提取效果更佳；图2C,D)。此外，还比较了50 mM、100 mM和150 mM浓度的PB溶液的提取效率。结果表明，100 mM PB在回收AWF和GFP-His方面具有最高的提取效率(图2E,F)。
基于这些优化实验，选择 100 mM PB 缓冲液（pH 7.0）用于从 N. benthamiana 大规模提取 AWF。使用该缓冲液，每克新鲜叶片材料可从质外体回收 495 µg 总 AWF 蛋白 (图 2G)。提取的 AWF 中含有 10 µg GFP-His (图 2H)，约占 TSP 中总 GFP-His 的 18% (图 2I)。经过镍亲和层析后，由 AWF 提取获得的 GFP-His 纯度达到 84.3%，显著高于通过总可溶性蛋白提取获得的 44.9% 纯度 (图 2J)。
图1：GFP-His 被靶向分泌至质外体 N. benthamiana (ApCAMBIA1300植物表达载体中PR1a-GFP-His构建体的示意图。B) 蛋白质印迹检测GFP-His的表达 N. benthamiana 此处，10 µL 蛋白质样品上样并进行检测。 N. benthamiana 同时注射MMA的叶片用作阴性对照。使用植物大亚基作为上样对照，对相同体积的样品进行检测和染色。C共聚焦显微镜显示GFP-His（绿色）的亚细胞定位。 N. benthamiana 叶片用30%蔗糖进行质壁分离。白色虚线表示细胞膜。红色箭头指示GFP-His在质外体中的积累。D) 蛋白质印迹检测显示，在提取的质外体液中存在 GFP-His。此处，10 µL 蛋白质样品上样并进行检测。该 N. benthamiana 同时注射MMA的叶片用作阴性对照. 缩写：35s = 2x 花椰菜花叶病毒 35s 启动子；PR1a = 烟草 病程相关蛋白1a信号肽；His = 6×His标签；Nos = 章鱼碱合成酶终止子。BS = 质壁分离前；PS = 质壁分离后 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2：AWF蛋白提取方法的优化。（A-B）使用不同缓冲液从AWF中提取蛋白。测试了八种溶液用于从AWF中提取蛋白：25 mM Tris-HCl（pH 7.4）、100 mM NaH2PO4（pH 4.5）、50 mM NaCl（pH 7.0）、40 mM KCl（pH 7.0）、20 mM CaCl2（pH 5.7）、100 mM PB（pH 7.0）、10 mM MES（pH 5.6）和ddH2O（pH 7.0）。通过SDS-PAGE分析提取效率（A），并使用抗His抗体通过Western印迹检测GFP-His（B）。（C-D）使用不同pH值的PB进行提取。采用pH为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的PB从AWF中提取蛋白。通过SDS-PAGE检测提取效率（C），并使用抗His抗体通过Western印迹检测GFP-His（D）。（E-F）使用不同浓度的PB进行提取。采用50 mM、100 mM和150 mM的PB从AWF中提取蛋白。通过SDS-PAGE分析提取效率（E），并使用抗His抗体通过Western印迹检测GFP-His（F）。（G-H）提取蛋白的定量分析。使用100 mM PB（pH 7.0）提取蛋白。对总可溶性蛋白（G）和GFP-His（H）进行定量以进行统计分析。（I）AWF中GFP占总GFP比例的统计分析。（J）从本氏烟草（N. benthamiana）或AWF的总可溶性蛋白中纯化GFP-His。使用100 mM PB（pH 7.0）提取蛋白，并通过Ni亲和层析纯化GFP-His。通过SDS-PAGE分析纯化效果。最右侧泳道为1 µg BSA标准品。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
近年来，利用植物生产治疗性蛋白的技术发展迅速1,2,3,4,5,6。将编码目标蛋白的基因克隆至表达载体中，并通过农杆菌浸润法导入植物组织。植物细胞表达蛋白后，对其进行纯化以用于后续应用。通常，重组蛋白从总可溶性蛋白（TSP）提取物中纯化。然而，在提取过程中，植物细胞释放出大量内源蛋白和细胞色素，可能干扰纯化过程33。一方面，植物细胞色素可能堵塞层析柱，减慢处理速度17；另一方面，诸如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）等高丰度蛋白难以去除，从而降低目标蛋白的纯度18,19。当目标蛋白表达水平较低时，这些问题尤为突出。采用离心后上清液（AWF）作为起始材料可规避上述问题，实现更高纯度的蛋白纯化 (图 2J)。
尽管质外体洗脱液（AWF）提取已广泛应用于植物生物学研究24,25,26,27，但在分子 farming 技术流程中却鲜有应用。本文中，我们利用植物表达的 GFP 模型蛋白，展示了基于 AWF 的蛋白纯化方法。通过在 GFP 上添加信号肽，使其分泌至质外体空间，从而实现从 AWF 中提取 GFP。该方法可获得更高均一性的蛋白产物，并降低下游蛋白加工成本。在植物生物反应器中实施 AWF 纯化尚需进一步研究若干关键因素：第一，高效的分泌依赖于特定 N 端信号肽的融合；第二，为保持 AWF 的质量，收获后的完整叶片必须在不冷冻的条件下迅速处理，以避免细胞内含物的释放；第三，磷酸缓冲液（PB）能有效提取 AWF 中的蛋白34，但缓冲液的 pH 值和盐浓度需根据具体的目标重组蛋白进行优化 (图 2C-D)；第四，我们在实验室条件下多次从 200 g 的 N. benthamiana 中成功获得了纯化的蛋白，且纯度和得率稳定。若要在工厂规模中实现放大应用，则需要更大容量的容器、真空泵以及更高效的纯化方法，同时可能需对真空持续时间、回收次数等条件进行优化。
该方法的局限性在于外源蛋白会分泌到液泡外周流（AWF）中，而质膜内的蛋白则被舍弃（图2H-I）。这种方法虽然能够获得经过正确修饰的更高纯度蛋白，但代价是产量较低。基于AWF的蛋白纯化面临的主要技术瓶颈是提高目标蛋白在AWF中的含量。结合强启动子和优化的分泌系统，将有助于提升植物表达平台在高纯度和高产量两方面的能力。为克服这一瓶颈，未来的研究需要建立更高表达水平的生产系统以及更高效的分泌系统。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到中国科学院青年创新促进会（2021084）和中国科学院微生物研究所三年行动计划重点部署项目支持基金的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100目尼龙细网纱线 | 广州华宇贸易有限公司 | hy-230724-2 | 用于AWF蛋白提取 |
| 50 ml离心管 | Vazyme | TCF00150 | 用于离心 |
| ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | C112-02 | 用于克隆 |
| FastDigest Sac1 | NEB | R3156S | 用于克隆 |
| FastDigest XbaI | NEB | FD0685 | 用于克隆 |
| ImageJ 1.5.0 | / | / | 用于灰度分析 |
| 大号滤器 | Thermo Fisher | NEST | 用于过滤 |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Leica SP8 | 用于亚细胞定位 | |
| Ni Sepharose Excel | Cytiva | 10339806 | 用于蛋白纯化 |
| 预制蛋白Plus胶 | YEASEN | 36246ES10 | 用于SDS-PAGE |
| 小号滤器 | Nalgene | 1660045 | 用于过滤 |
| SuperSignal West Femto底物试用试剂盒 | Thermo Fisher | 34076 | 用于Western印迹 |
| Triton X-100 | SCR | 30188928 | 用于配置提取缓冲液 |
| 旋片式真空泵 | 浙江台州求精真空泵有限公司 | 2XZ-2 | 用于真空浸润 |
| 垂直混合器 | 海门麒麟贝尔仪器制造有限公司 | BE-1200 | 用于混匀 |
| β-巯基乙醇 | SIGMA | BCBK8223V | 用于配置提取缓冲液 |
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