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方法文章

收获、包埋及在多区室装置中培养背根神经节以研究外周神经元特征

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DOI：

10.3791/66854

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2024年6月28日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

本文内容

摘要

本方案提供了一种从成年Sprague Dawley大鼠中分离并培养背根神经节（DRG）组织块，在多隔室（MC）装置中进行原代培养的技术。

摘要

疼痛最常见的外周神经特征是背根神经节（DRG）终末神经的刺激阈值降低或出现高敏性。这种高敏性的一种可能成因与外周组织中免疫细胞和神经元之间的相互作用有关。体外模型为理解这些机制如何导致伤害感受器高敏性提供了基础性知识。然而，体外模型在将疗效转化为人类应用方面面临挑战。为应对这一挑战，已开发出一种在48孔板中具有生理和解剖相关性的体外模型，用于在三个独立隔室中培养完整的背根神经节（DRG）。初级DRG在人道安乐死后从成年Sprague Dawley大鼠中分离获取。去除多余的神经根后，将DRG切割成适合培养的大小。随后将DRG培养于天然水凝胶中，使其在所有隔室中均能实现稳健生长。该多隔室系统可在解剖学上有效分离DRG胞体与神经突，在生理学上保留相关细胞类型，并具备适宜的力学特性，可用于研究神经细胞与免疫细胞之间的相互作用。因此，该培养平台为探索治疗隔离策略提供了有力工具，最终有助于改进疼痛预测的筛选方法。

引言

慢性疼痛是全球范围内导致残疾和丧失工作能力的首要原因1。全球约有20%的成年人受慢性疼痛影响，给社会和经济带来重大负担2，仅在美国，每年的总费用估计在5600亿至6350亿美元之间3。

慢性疼痛患者表现出的主要外周特征是神经的刺激阈值降低，导致神经系统对刺激的反应性增强4,5。刺激阈值的降低可导致原本非疼痛性的刺激引发疼痛反应（痛觉超敏），或对疼痛性刺激产生更强的反应（痛觉过敏）6。目前针对慢性疼痛的治疗方法疗效有限，且在动物模型中有效的治疗方案常因疼痛表现机制的差异而在人体试验中失败7。In vitro 模型若能更准确地模拟外周致敏机制，则有望提高新型治疗手段的转化成功率8,9。此外，通过在培养系统中模拟致敏神经的关键特征，研究人员可更深入理解导致阈值降低的机制，并识别出能够逆转这些变化的新型治疗靶点10。

理想状态 体外 平台或微生理系统将整合远端神经突与背根神经节（DRG）胞体的物理分离、三维（3D）细胞环境以及天然支持细胞的存在，以紧密模拟 体内 条件。然而，Caparaso 等人最近发表的一篇论文11 表明当前的DRG培养平台缺乏这些关键特征中的一项或多项，因而不足以模拟 体内 条件。尽管这些平台易于建立，但它们无法模拟外周敏化的生物学基础，因此可能无法转化为 体内 有效性。为解决这一局限性，需采用一种生理学相关的 体外 已开发出一种模型，用于在具有三个独立隔室的水凝胶基质内培养背根神经节（DRG），以实现神经突与DRG胞体在时间上的流体隔离11该模型具有生理学和解剖学上的相关性，可用于研究神经元的外周敏化 体外.

由于背根神经节外植体在三维培养中能够促进显著的神经突生长，从而间接反映背根神经节的活性，因此其应用正受到越来越多的关注12尽管目前主要使用原代新生或胚胎期背根神经节外植体 体外 培养平台13,14使用成年啮齿类动物的组织块可更好地模拟成熟神经元的生理特性，相较于新生或胚胎期啮齿类动物的组织块，更接近人类背根神经节（DRG）的生理状态15. 外植体背根神经节（DRGs）是指通过保留天然的非神经元支持细胞，来维持原生DRG组织的细胞与分子结构。本文所述方案介绍了从成年Sprague Dawley大鼠中分离并培养背根神经节外植体，并将其置于多室（MC）装置中的方法图1).

已证明从颈椎、胸椎和腰椎分离的背根神经节（DRG）在培养中均表现出有效的神经突生长，且未观察到神经突生长存在明显差异。本应用的目标是诱导神经突生长进入装置的外周隔室，因此本文未对不同节段的DRG进行区分。然而，若特定实验需要，可根据实验需求选择特定节段的DRG。目前已有其他用于DRG三维培养的分隔式培养模型16，但这些装置不包含保存完好的天然非神经元支持细胞，这可能限制其转化应用。保留收获DRG的天然结构至关重要，因为这可确保非神经元支持细胞的存留，而这些细胞与DRG神经元之间的相互作用对于维持神经元的功能特性必不可少。已有若干研究将解离的DRG与非天然的神经细胞（如施万细胞）进行共培养，以促进神经元的髓鞘形成17,18,19。

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方案

DRG 的收获操作均遵循内布拉斯加大学林肯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。实验使用12周龄（约250 g）的雌性Sprague Dawley大鼠。本研究中所用动物、试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 多区室装置的制备与组装

  1. 多室装置的计算机辅助设计与 3D 打印
    注意：多室（MC）装置包含三个隔室，用于分离背根神经节（DRG）细胞体和神经突（图 2A）。该 MC 装置目前未商业化销售；但本文提供了其 STL 文件（补充代码文件 1），可用于 3D 打印。完成 MC 装置的打印需耗时一天（1 天）。
  2. 使用兼容软件将 MC 的 STL 文件上传至树脂 3D 打印机。
    注意：理想的打印材料为耐高温树脂。使用耐高温树脂的一个关键优势在于其具有生物相容性，可进行高压灭菌并重复使用。也可采用数字光处理（DLP）3D 打印机或其他类型的 3D 打印机来打印该装置。
  3. 将打印好的装置转移至异丙醇（>96%）清洗液中，清洗 30 分钟，以去除打印完成的 MC 装置表面残留的树脂。
  4. 使用市售固化剂（见材料表），在 80 °C 条件下后固化 120 分钟。固化剂通过加热和紫外照射，增强打印所得 MC 装置的机械性能。
  5. 将 MC 装置置于烘箱中，在 160 °C 下进行 180 分钟的热固化处理。
  6. 使用高压灭菌器，在重力循环模式下对装置灭菌 45 分钟。

2. 水凝胶制备

  1. 按照 Seidlits 等人20描述的方案合成甲基丙烯酰化透明质酸（MAHA，甲基丙烯酰化程度为85%-115%），并进行表征。
    注意：为支持背根神经节（DRG）的生长，通常使用由甲基丙烯酰化透明质酸、I型胶原蛋白和层粘连蛋白组成的三重水凝胶。研究结果表明，DRG通常在MAHA浓度为1.25–2.5 mg/mL、胶原蛋白浓度为2.0–4.5 mg/mL的条件下生长良好。对于层粘连蛋白，0.75 mg/mL的浓度已足以确保DRG的稳健生长。本文详细介绍了制备含1.25 mg/mL MAHA、4.5 mg/mL胶原蛋白和0.75 mg/mL层粘连蛋白的三重水凝胶的方法。水凝胶的制备应在层流罩中进行，以提供无菌的工作环境。

3. 光引发剂溶液的制备

注意：在紫外光下使MAHA交联需要使用光引发剂。通常使用的浓度范围为0.3%至0.6%。

  1. 在背根神经节（DRG）收获前3天制备光引发剂溶液。
  2. 在配制光引发剂溶液前，将超声水浴预热至37 °C。
  3. 在超净台内采用无菌操作技术，将碳酸氢钠（NaHCO3）溶解于5倍浓度的杜尔贝科改良伊格尔培养基-HEPES（DMEM-HEPES）溶液中，配制成23.125 mg/mL的碳酸氢钠（NaHCO3）溶液。
  4. 在玻璃小瓶中，将0.6%（质量/体积，w/v）的光引发剂溶于20%（体积/体积，vol/vol）的1倍无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和80%（体积/体积，vol/vol）的5倍浓度DMEM/HEPES溶液中，充分混合。
  5. 为避免光照，用铝箔包裹玻璃小瓶。但在将小瓶转移至预热至37 °C的超声水浴中进行30–40分钟超声处理前，务必去除铝箔。
    注意：光引发剂溶液必须避光保存，因为光照会使其分解为自由基，从而启动聚合反应21。
  6. 使用0.22 µm注射器滤器对溶液进行无菌过滤，收集至新的无菌玻璃小瓶中。

4. 甲基丙烯酰化透明质酸的溶解

  1. 在配制光引发剂溶液的当天（步骤3），溶解甲基丙烯酰化透明质酸（在步骤2中制备）。
  2. 将冷冻的冻干MAHA置于干燥器中15分钟，使其升至室温。
  3. 在超净工作台内采用无菌称量技术，将冻干MAHA称量至玻璃小瓶中。
  4. 向MAHA中加入所需体积的过滤光引发剂溶液，以达到目标MAHA浓度。常见的终凝胶浓度为1.25 mg/mL MAHA和4.5 mg/mL胶原蛋白。
  5. 用实验室封口膜密封瓶盖，再用铝箔包裹玻璃小瓶，并将其置于室温下的轨道摇床上，直至完全溶解（通常为3天）。可偶尔涡旋震荡溶液，以打散MAHA的大块团聚物，确保MAHA均匀溶解。

5. 装置组装

  1. 在收获背根神经节（DRG）前一天，将MC装置放入48孔板中。
  2. 使用3 mL注射器在MC装置下方的凹槽内涂抹一条细小的硅胶，如图2B所示。这有助于装置牢固地附着在孔板上。
  3. 借助#3镊子，如图2C所示，将MC装置轻轻放入48孔板的孔中。
    注意：可根据预期用途调整装置尺寸，也可根据需要使用其他规格的孔板。该装置可重复使用。重复使用时，需用70%乙醇轻轻震荡清洗装置所有通道中的水凝胶，并清洗装置下方的加样凹槽。处理完毕后，可在使用前重新进行高压灭菌以实现灭菌。

6. 动物准备

  1. 在开始取材前，将所有必要的解剖工具进行高压灭菌。
  2. 取一只12至20周龄的成年雄性或雌性Sprague Dawley大鼠。大鼠的性别不影响背根神经节（DRG）的生长。
  3. 根据批准的IACUC方案，采用CO2过量作为主要安乐死方法，双侧气胸穿刺作为辅助安乐死方法，参照美国兽医协会指南22执行安乐死。
  4. 将大鼠腹侧朝下置于解剖台上的无菌垫上，用70%乙醇喷洒毛发。

7. 背根神经节（DRG）的获取

  1. 配制修剪培养基，包含86% Neurobasal A培养基、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（PS）、1%谷氨酰胺以及2% B27补充剂（50x），并转移至24孔板中。该培养基和孔板将用于在将背根神经节（DRG）包埋于水凝胶前临时存放收获的DRG。
  2. 穿戴实验服、外科口罩、头帽、护目镜和手套。
  3. 使用大号钝头剪刀，从颈椎基部切开皮肤，然后沿脊柱全长向下剪开。
  4. 为进一步引流脊髓管内的血液，剪开肩胛骨下方肌肉，切断主要血管。
  5. 使用大号尖头剪刀将肌肉从脊柱上剪除，尽可能清除肌肉组织以暴露脊柱。
  6. 去除椎骨的背侧和侧部结构。使用直头咬骨钳和尖头剪刀，从颈椎端开始向腰椎端方向，逐步去除椎骨的棘突和横突。
  7. 取出脊髓。使用小型尖头剪刀，小心剪断连接在脊髓两侧DRG上的神经根。剪断脊髓的颈椎端，然后逐步小心地将其从椎管中提起，同时剪断任何残留连接至DRG的神经根。
    注意：精细的运动操作技能至关重要，以确保在此过程中不切断DRG本体。
  8. 为暴露DRG，使用弯头咬骨钳进一步去除椎骨的侧部结构。从正中线向外侧交替进行剥离操作。注意避免剪切到DRG本体，以防损伤神经元胞体和轴突。
  9. 使用#3镊子和直刃弹簧剪刀，逐个椎体水平之间取出DRG。用镊子夹住DRG的脊神经根，小心将其从神经节窝中拉出，并剪断脊神经的另一端。注意避免直接夹持DRG本体。
  10. 将取出的DRG置于含有修剪培养基（步骤7.1）的24孔板孔中，并置于冰上保存。
  11. 收集完所有DRG后，清理工作区域，将动物尸体放入高压灭菌袋中，并根据IACUC规程进行妥善储存或处理。

8. 背根神经节修剪与切割

  1. 在洁净台中，用修整培养基（步骤 7.1）填充一个 60 mm 培养皿。设置好解剖显微镜和玻璃珠灭菌器，并将已高压灭菌的修整工具盒（含 #3 镊子和直刃弹簧剪）放置于显微镜旁。
  2. 在解剖显微镜下，去除背根神经节（DRG）周围的多余组织，并将靠近 DRG 本体的神经根剪除（DRG 本体通常比周围神经颜色略深）。
  3. 用新鲜培养基填充第二个 60 mm 培养皿。在解剖显微镜下，将已修整的 DRG 切割至约 0.5 mm（或介于 0.5 mm 至 0.8 mm 之间）。切割时，在培养皿下方放置一把尺子，以准确估计所切 DRG 的尺寸。
  4. 将切割后的 DRG 转移至含有培养基并置于冰上的新鲜 24 孔板中。
    注意：DRG 的修整、切割和包埋操作应在超净工作台内进行，以提供无菌工作环境。若无超净工作台，必须严格遵守无菌操作规范，建议至少佩戴适当的个人防护装备（PPE）（实验服、口罩、护目镜和手套），并在整个过程中确保所有工具均经过灭菌，以降低潜在污染风险。

9. 胶原蛋白中和

  1. 在收获背根神经节（DRG）的当天，在修剪和切割DRG后立即对胶原蛋白进行中和处理。
  2. 在冰上操作，用移液器将约占终体积8.16%的超纯水、1.84%的1 M氢氧化钠（NaOH）、10%的10×磷酸盐缓冲液（PBS）以及约80%的胶原蛋白加入玻璃小瓶中。
  3. 使用无菌低吸附的移液枪头缓慢混合，将胶原蛋白（通常最后加入）移入混合液中。混合过程中应始终保持枪头浸没在溶液内，以避免产生气泡。使用pH试纸检测中和后胶原蛋白的pH值，确保其约为7。
    注意：中和后的胶原蛋白可在冰上保存2–3小时而不发生凝胶化；因此，一旦完成中和，应尽快进行水凝胶的制备。

10. 水凝胶制备

  1. 在冰上操作，用移液器将层粘连蛋白（终浓度为 0.75 mg/mL）和 1× PBS 加入玻璃小瓶中。
  2. 使用无菌低吸附移液器吸头，将中和后的胶原蛋白和 MAHA 溶液加入上述混合物中，达到所需浓度。
  3. 缓慢混匀，并检测所得水凝胶的 pH 值（应约为 7）。

11. 背根神经节包埋

  1. 进行多区室包埋。
    1. 分别向胞体区和神经突区加入65.1 µL和52.8 µL预混水凝胶。
      注意：此步骤假设使用48孔板中的MC装置。根据所用MC装置的尺寸，可调整上述体积。
    2. 轻柔地将切割后的背根神经节（DRG）包埋至胞体区（图2A），确保其不刮伤孔板底部。将DRG置于中央位置，以便神经突可通过通道向相邻区室生长。
    3. 在37 °C培养箱中对水凝胶进行30分钟的热交联。在此期间，打开紫外灯预热。
    4. 热交联完成后，对水凝胶进行90秒的紫外交联。
    5. 向水凝胶和DRG中加入DRG生长培养基，并在1小时后进行完全换液，以清除培养基中残留的未反应光引发剂或其痕迹。
    6. 每3天进行一次半量换液，并在显微镜下观察DRG的生长情况。
    7. 约4周后，当DRG神经突开始生长时（图3A），使用荧光板成像仪采集图像，并利用FIJI（ImageJ）软件定量分析神经突长度。

12. 控制背根神经节包埋

  1. 在48孔板中加入250 µL水凝胶（不含多室装置MC）。
  2. 将切好的背根神经节（DRG）轻轻放置于孔中央，并使其半埋入水凝胶中，注意避免刮伤孔板底部。
  3. 将水凝胶置于37 °C培养箱中进行30分钟的热交联。
  4. 对水凝胶进行90秒的紫外光交联。
  5. 向水凝胶和DRG中加入DRG生长培养基，并在1小时后进行完全换液。
  6. 每3天进行一次半量换液，并在显微镜下观察DRG的生长情况。
  7. 约4周后，当DRG神经突开始生长时（图3B），使用荧光酶标仪采集图像。
    注意：任何明场显微镜均可用于成像。使用自动化板式显微镜可加快该过程。为比较多室装置中DRG神经突的生长情况，需设置不含多室装置MC的空白凝胶对照组。当用户验证DRG在MC组与对照凝胶中的生长情况相似后，后续实验可无需重复设置对照凝胶组。

13. 背根神经节成像

  1. 使用荧光板成像仪，在4倍放大倍数下，于一系列焦距范围内拍摄明场图像，以完整观察背根神经节（DRG）和MC装置。
  2. 调整图像的亮度和对比度，以便更清晰地观察神经突。
  3. 将图像保存为.tiff文件。

14. 背根神经节神经突的定量分析

  1. 下载并安装 FIJI（ImageJ）。
  2. 打开 ImageJ。打开图像文件，并确保文件为单色图像。
  3. 增强对比度，使最细小的神经突可见。可通过快捷键 Ctrl+Shift+C 打开亮度和对比度选项来实现。
  4. 根据需要调整控制器中的滑块以清晰显示神经突，并点击 应用 以确认所需的亮度和对比度。
  5. 通过打开 插件 菜单，选择 分割，然后点击 Simple Neurite Tracer 来启动神经突追踪工具。
  6. 从神经突一端紧贴背根神经节（DRG）胞体的位置开始，点击以启动新追踪。
  7. 沿神经突点击另一点以添加追踪路径，直至完成整条神经突的端到端追踪。追踪完成后，点击 完成路径。
  8. 将追踪得到的长度转换为实际单位，并通过复制粘贴方式将结果保存至 Excel。
  9. 使用 FIJI 中的直线工具，绘制一条与标尺长度相同的直线（不要松开线的终点），并在工具栏下方查看显示的长度值。该数值将用于单位换算。
  10. 测量从背根神经节（DRG）两侧延伸出的六条较长神经突的长度（图 3C,D），并计算这些神经突的平均长度，以获得具有代表性的 DRG 神经突平均长度，如 图 4 所示。
    注意：已在普通凝胶中的 DRG 外植体上进行免疫染色检测，以显示非神经元支持细胞的存在7。DRG 在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定，用 1×PBS 洗涤三次，每次 15 分钟，并在 4 °C 下保存于 1×PBS 中，直至进行免疫染色。
  11. 对于微通道（MC）装置中的外植体，需先移除 MC 装置，然后按照上述相同步骤进行处理7。

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结果

本方案描述了一种从成年 Sprague Dawley 大鼠中分离并培养背根神经节（DRG）的多区室（MC）装置技术。如 图1 所示，从成年大鼠中获取的 DRG 经修剪并切成约 0.5 mm 大小。修剪并切分后的 DRG 随后被包埋于 MC 装置胞体区域的水凝胶中（图2），并在进行神经突长度量化前培养 27 天。DRG 在普通凝胶中培养作为对照组。本实验所用水凝胶配方浓度为 4.5/1.25 mg/mL 胶原蛋白:MAHA。在多区室凝胶培养第 27 天及普通凝胶培养第 21 天时，均观察到明显的神经突生长（图3）。MC 装置中神经突的平均长度（894.22 µm ± 308.75 µm）与对照组普通凝胶中的神经突长度（864.26 µm ± 362.84 µm）相当（图4）。该结果表明 MC 装置具备支持 DRG 培养及神经突生长的能力。神经突长度使用 ImageJ 软...

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讨论

本方案概述了一种从成年Sprague Dawley大鼠中分离背根神经节（DRG）并将其在三维天然水凝胶中进行培养的方法。与本方法不同，其他从小鼠和大鼠中分离DRG的方法通常涉及完整取出脊柱。随后将切除的脊柱一分为二，并移除脊髓以暴露DRG23,24,25。脊髓的损伤会限制血液供应，从而影响DRG及其内部神经元的活性26。这会降低DRG的活力，因此上述手术方法适用性受限。此外，本文还介绍了一种用于三维打印坚固MC装置的方法，该装置可实现具有生理相关性的DRG培养。

本方案概述了一种培养背根神经节（DRG）的方法 体外，强调在解剖学和生理学上均相关的模型中研究神经元的外周敏化。该培养方法可在三维环境中实现远端神经突起与背根神经节（DRG）胞体之间的物理分离。MC装置模拟了 体内 由于背根神经节（DRG）外植体保留了细胞...

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披露

本研究的作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国家科学基金会资助（NSF资助号：2152065）和NSF职业成就奖（NSF CAREER Award，1846857）的支持。作者谨向Wachs实验室所有现任及前任成员致谢，感谢他们对本实验方案的贡献。图1中的示意图使用Biorender软件绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#5 镊子Fine Science Tools11252-00用于修剪和切割背根神经节（DRG）
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS（高压灭菌）实验室配制pH 7.3 - 7.5
24 孔板VWR82050-892用于临时存放收获并切割后的背根神经节（DRG）
3 mL 注射器，无菌，一次性使用BD309657
48 孔板Greiner Bio-One677180
60 mm 培养皿Fisher ScientificFB0875713A用于盛放修剪和切割时所需的培养基
铝箔Fisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044用于背根神经节（DRG）培养基
I 型胶原蛋白Ibidi50205
弯曲杯状 Friedman Pearson 骨凿Fine Science Tools16221-14用于解剖
Dumont #3 镊子Fine Science Tools11293-00用于解剖
胎牛血清（FBS）ThermoFisher16000044用于背根神经节（DRG）培养基
Form cureForm Labs固化剂
Form washForm Labs用于清洗微通道（MC）上多余的树脂
玻璃珠灭菌器Fisher ScientificNC9531961
玻璃小瓶（8 mL）DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061用于背根神经节（DRG）培养基
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
高温 V2 树脂FormLabsFLHTAM02
透明质酸钠盐MilliporeSigma53747用于制备甲基丙烯酰化透明质酸（MAHA）
IrgacureMilliporeSigma410896
层粘连蛋白R&D Systems344600501
大型钝头剪刀MilitexEG5-26用于解剖
大型镊子（带齿尖端）Militex9538797用于解剖
大型尖头剪刀Fine Science Tools14010-15用于解剖
低吸附移液枪头Fisher Scientific02-707-017用于移取胶原蛋白和 MAHA
甲基丙烯酰化透明质酸（MAHA）实验室配制N/A甲基丙烯酰化程度 85 - 115%
神经生长因子（NGF）R&D Systems556-NG-100用于背根神经节（DRG）培养基
Neurobasal A 培养基ThermoFisher10888022用于背根神经节（DRG）培养基
Parafilm 封口膜BemisPM996
Parafilm 封口膜BemisPM996
青霉素/链霉素（PS）EMD Millipore516106用于背根神经节（DRG）培养基
pH 试纸VWR InternationalBDH35309.606
移液枪头（1000 µL）USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 软件Formslab用于上传 STL 文件
大鼠Charles River
树脂 3D 打印机Form LabsForm 3L用于 3D 打印微通道（MC）装置
小型尖头剪刀Fine Science Tools14094-11用于解剖
碳酸氢钠MilliporeSigmaS6014
直杯骨凿Fine Science Tools16004-16用于解剖
直刃弹簧剪刀Fine Science Tools15024-10用于解剖
手术刀片（No. 10）Fisher Scientific22-079-690
注射式滤器，PES 材质（0.22 µm）Celltreat229747
微型弹簧剪刀World Precision Instruments14003用于修剪和切割背根神经节（DRG）
紫外灯Analytik Jena US用于光交联水凝胶（15 - 18 mW/cm²）

参考文献

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