酿酒酵母线粒体转化用于研究翻译及呼吸复合物组装

摘要

本研究介绍了如何利用基因枪法转化酵母线粒体。我们还展示了如何筛选和纯化转化子，以及如何在线粒体基因组的靶位点引入所需的突变。

摘要

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae已被广泛用于研究线粒体生物学长达数十年之久。该模型帮助人们了解了真核生物中保守的关键线粒体通路，以及真菌或酵母特有的通路。S. cerevisiae的众多能力之一是能够对线粒体基因组进行操作，目前这一操作仅在S. cerevisiae和单细胞绿藻Chlamydomonas reinhardtii中实现。通过基因枪法对酵母线粒体进行转化，可实现定点突变、基因重排以及报告基因的引入。这些方法主要用于研究线粒体中两个高度协调的过程：线粒体核糖体介导的翻译以及呼吸链复合物和ATP合酶的组装。然而，线粒体转化技术也有潜力用于研究其他通路。在本研究中，我们展示了如何通过高速微弹轰击法转化酵母线粒体，筛选并纯化目标转化子，以及在线粒体基因组中引入所需突变的方法。

引言

酵母Saccharomyces cerevisiae 是研究线粒体生物发生的广泛认可的模式生物。由于酵母是一种兼性厌氧生物，因此可以深入研究导致呼吸功能受损的突变所引发的原因及其后果。此外，该生物体拥有便利的遗传学和生物化学工具，可用于研究线粒体相关通路。然而，探索呼吸复合物组装机制和线粒体蛋白质合成最强大的资源之一，是能够对线粒体进行转化并修饰其细胞器基因组的能力。此前，研究人员已成功在线粒体DNA（mtDNA）中引入点突变或小片段的缺失/插入^1,2,3,4,5，删除基因^6,7，实现基因重排^7,8，为线粒体蛋白添加表位标签^9,10，将基因从细胞核转移至线粒体^11,

方案

注意：由于线粒体转化效率通常较低，建议每种构建体进行六次转化。不同培养基的组成见表2。

1. 钨颗粒的制备

1. 取一个微量离心管，称取30 mg的0.7 µm钨微粒（WPs，微载体），加入1.5 mL 70%乙醇（EtOH）进行灭菌。涡旋混匀钨微粒，并在室温下静置10分钟。
2. 在室温下以13,200 × g 离心15分钟。向沉淀中加入1.5 mL无菌水洗涤微粒，涡旋混匀后，在室温下再次以13,200 × g 离心15分钟。弃去上清液。
3. 加入500 µL无菌的50%甘油（最终浓度为60 µg WPs/µL）。
   注意：钨微粒可在-20 °C下保存至少6个月。每次实验可从此储备液中取100 µL用于六次转化。

2. WPs DNA 包被

1. 在冰上将5 µg的2 µl质粒和15 µg含有线粒体序列的细菌质粒加入微量离心管中。
   注意：最终体积不得超过50 µL，以避免稀释DNA包被所需的试剂。
2. 加入100 µL钨微粒（WPs）悬浮液，涡旋5秒（含6 mg WPs）。
3. 加入4 µL 1 M亚精胺，短暂涡旋。
4. 加入100....

结果

本部分展示了线粒体转化不同阶段的一些代表性结果。 图6 显示了一种轰击程序。合成的 rho^- 细胞携带一种含有报告基因的细菌质粒 ARG8^m，将替换线粒体基因的编码序列（图6A）。轰击后，将平板转接到缺乏尿嘧啶的培养基（-URA）上进行复制；这是 主培养板 (图6B）。生长的菌落含有带有酵母表达载体的 URA3 营养缺陷型标记。根据第6部分实验步骤，轰击平板也复制到了含有测试菌株菌苔的YPD培养基上。在此情况下，测试菌株携带一个有缺陷的等位基因 ARG8^m 线粒体基因组中的基因（ARG8^m-1)¹经过两天的培养后，测试菌株与转化细胞发生接合，线粒体完成融合。将该平板复制到缺乏精氨酸的培养基上。只有含有线粒体质粒的二倍体细胞.......

讨论

本研究描述了如何成功转化酿酒酵母（S. cerevisiae）的线粒体。从高速微弹轰击到目标酵母菌株的纯化，整个过程大约需要8至12周，具体时间取决于合成rho^-菌株所需的纯化轮次。该方法中一些关键步骤如下：首先，在线粒体基因构建体中，突变位点两侧添加的侧翼区域越大，目标突变成功整合的概率越高。侧翼区域的最小长度约为100 nt，但强烈建议在突变位点两侧各使用超过500 nt的序列。其次，在转化后筛选合成rho^-菌落时，建议纯化轮次不超过3至4轮；否则，由于缺乏选择压力以维持质粒在线粒体中的存在，线粒体构建体最终可能丢失。第三，为避免对操作者或设备造成损害，在开始实验前必须仔细阅读轰击仪器的使用手册。该设备较为精密，操作过程中涉及高压和真空环境。

该方法的一个局限性在于，目前只有酵母和莱茵衣藻（C. reinhardtii）适用于通过此方法进行线粒体转化。如果我们能够将位点特异性突变引入其他生物的线粒体基因组中，将具有重要意义。另一个局限性是，在同一次实验中转化多种不同构建体存在较大挑战。建议对每个构建.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 吸头	Axygen	T-1000-B
1.5 mL 微量离心管	Axygen	MCT-150-C
10 μL 吸头	Axygen	T-10-C
15 mL 圆底离心管	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL 吸头	Axygen	T-200-Y
50 mL 圆底离心管	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
琼脂糖	SeaKem	50004
分析天平	OHAUS	ARA520
高压灭菌器	TOMY	ES-315
细菌用琼脂	BD	214010
细菌用蛋白胨	BD	211677
基因枪微载体支架	BIO-RAD	1652322
本生灯	VWR	89038-528
氯化钙	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
细胞培养玻璃烧瓶	KIMAX KIMBLE	25615
细胞培养玻璃管	Pyrex	9820
葡萄糖	BD	215520
乙醇	JT Baker	9000
镊子	Millipore	620006
玻璃珠	Sigma	Z265926
玻璃棒	Sigma	S4647
甘油	JT BAKER	2136-01
5 级氦气钢瓶（99.99%）	-	-
HSTaq  试剂盒	PCR BIO
微量离心机	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
旋转摇床	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR 管	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM 基因枪系统	BIO-RAD	165-2257
培养皿（100×10）	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
棉子糖	Formedium	RAF03
复制接种器	Scienceware	Z363391
破裂盘 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
山梨醇	Sigma	S7547
亚精胺	Sigma	S0266
T4 DNA 连接酶	Thermo Scientific	EL0011
组织培养旋转仪	Thermo Scientific	88882015
钨微载体 M10	BIO-RAD	1652266
100 L/min 容量真空泵	-	-
绒布垫	Bel-Art	H37848-0002
涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236
木质涂布棒	PROMA	1820060
酵母提取物	BD	212750
不含氨基酸的酵母氮源基础	BD	291920