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酿酒酵母线粒体转化用于研究翻译及呼吸复合物组装

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DOI：

10.3791/66856

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2024年6月7日

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了如何利用基因枪法转化酵母线粒体。我们还展示了如何筛选和纯化转化子，以及如何在线粒体基因组的靶位点引入所需的突变。

摘要

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae已被广泛用于研究线粒体生物学长达数十年之久。该模型帮助人们了解了真核生物中保守的关键线粒体通路，以及真菌或酵母特有的通路。S. cerevisiae的众多能力之一是能够对线粒体基因组进行操作，目前这一操作仅在S. cerevisiae和单细胞绿藻Chlamydomonas reinhardtii中实现。通过基因枪法对酵母线粒体进行转化，可实现定点突变、基因重排以及报告基因的引入。这些方法主要用于研究线粒体中两个高度协调的过程：线粒体核糖体介导的翻译以及呼吸链复合物和ATP合酶的组装。然而，线粒体转化技术也有潜力用于研究其他通路。在本研究中，我们展示了如何通过高速微弹轰击法转化酵母线粒体，筛选并纯化目标转化子，以及在线粒体基因组中引入所需突变的方法。

引言

酵母Saccharomyces cerevisiae 是研究线粒体生物发生的广泛认可的模式生物。由于酵母是一种兼性厌氧生物，因此可以深入研究导致呼吸功能受损的突变所引发的原因及其后果。此外，该生物体拥有便利的遗传学和生物化学工具，可用于研究线粒体相关通路。然而，探索呼吸复合物组装机制和线粒体蛋白质合成最强大的资源之一，是能够对线粒体进行转化并修饰其细胞器基因组的能力。此前，研究人员已成功在线粒体DNA（mtDNA）中引入点突变或小片段的缺失/插入1,2,3,4,5，删除基因6,7，实现基因重排7,8，为线粒体蛋白添加表位标签9,10，将基因从细胞核转移至线粒体11,12，以及引入报告基因，如 BarStar13、GFP14,15、荧光素酶16，其中应用最广泛的是ARG8m17,18。线粒体基因组的修饰使我们能够解析并鉴定出原本难以理解的生物学机制。例如，将ARG8m报告基因插入线粒体DNA的COX1位点，对于揭示Mss51在Cox1生物发生过程中具有双重作用至关重要：第一，它是COX1 mRNA的翻译激活因子；第二，它是新合成Cox1蛋白的组装伴侣分子7,19。本文介绍了一种转化S. cerevisiae线粒体的详细方法。尽管线粒体转化方案此前已有发表16,20,21,22,23，但通过视频形式进行可视化展示对于全面理解该方法的各个阶段和细节至关重要。该方法包含多个步骤，总体上可分为四个阶段：

钨颗粒转化；DNA包被；rho⁰菌株；高速轰击；细胞质传递示意图。
图1：通过高速微弹轰击实现线粒体转化的流程概述： 1) 钨颗粒在包被DNA前进行灭菌和预处理。 2) 两种不同的质粒沉淀至钨颗粒（WPs）表面；其中一种为细菌质粒，包含靶向线粒体基质的构建体；另一种为携带营养缺陷型标记的酵母核表达载体。 3) 将缺乏线粒体DNA（rho0）的受体酵母菌株培养于发酵性碳源（如半乳糖或棉子糖）上，此类碳源不会对线粒体基因表达产生葡萄糖阻遏作用34,35。将菌液涂布于含有轰击培养基的培养皿上。 4) 利用高速微弹轰击技术将包被有质粒的钨颗粒导入受体菌株。 5) 通过与检测菌株交配，筛选含有线粒体质粒的阳性合成rho-克隆。 6) 通过一种称为细胞质传递（cytoduction）的过程，将合成rho-菌株（供体）与受体菌株交配，使线粒体构建体整合至线粒体基因组的特定位点。 7) 在不同培养基中筛选并纯化携带线粒体构建体的阳性单倍体受体菌株。 缩写：WPs = 钨颗粒；mtDNA = 线粒体DNA。 请点击此处查看该图的放大版本。

用旨在整合到线粒体基因组中的DNA构建体转化细胞（图1，步骤1-4）
尽管可以直接转化含有完整线粒体基因组的酵母细胞（rho+），但如果细胞缺乏线粒体DNA（rho0），转化效率会提高10-20倍24。钨微粒（WPs）需包被两种不同的质粒，以实现共转化。第一种是携带营养缺陷型标记（如LEU2或URA3）的酵母2 µ表达载体（例如YEp351或YEp352）。若DNA通过基因枪法成功导入酵母细胞，则转化子可在营养缺陷型培养基（即缺乏亮氨酸或尿嘧啶的培养基）上生长。该质粒有助于初步筛选获得核质粒的细胞；否则，产生的菌落数量将使平板饱和。第二种质粒为细菌质粒（如pBluescript或类似载体），其中包含拟整合至线粒体基因组的线粒体构建序列。该构建体必须包含至少100 nt的5'和3'侧翼线粒体序列，以实现与目标线粒体区域的同源重组。根据我们的经验，较长的侧翼序列更有可能成功与线粒体基因组中的靶位点发生重组。

一个具体的示例如图225所示。在该示例中，目标是删除线粒体COX1基因中编码相应蛋白Cox1最后15个氨基酸的区域（Cox1ΔC15）（图2A）。携带COX1ΔC15突变的细菌质粒分别包含该基因5'和3'非翻译区的395个核苷酸（nt）和990个核苷酸（nt）。该质粒来源于pBluescript（pXPM61），并与2 µ质粒YEp352共同沉淀于WPs表面（图2B）。随后通过微弹轰击法将WPs导入选定的受体菌株中（图2C）。该菌株命名为NAB6926，为MATa型、rho0型，并携带kar1-1和ade2等位基因（这些特性的意义将在下文讨论）。将细胞接种于缺乏尿嘧啶的轰击培养基上，以筛选获得2 µ质粒的转化子（图2C）。细胞在30 °C下培养5至7天。

筛选获得含线粒体构建物的细菌质粒以及携带营养缺陷型标记的核2 µ质粒的细胞（图1，步骤5）
阳性克隆将在其线粒体中保留大量拷贝的细菌质粒22。由于转化细胞最初为rho0型，其线粒体序列无法支持质粒中线粒体构建物的翻译；因此，转化的线粒体基因不会表达。必须将转化子与测试菌株进行交配，以检测获得线粒体质粒的酵母克隆。测试菌株的线粒体基因组中含有目标基因的无功能突变版本。交配后，线粒体会发生融合，转化质粒中包含的线粒体序列将与测试菌株中的突变线粒体基因发生重组；因此，野生型（WT）基因功能得以恢复。所产生的二倍体将表现出可检测的阳性表型（通常为能够在呼吸培养基或缺乏精氨酸的培养基上生长）。在线粒体中携带细菌质粒的阳性细胞被称为“合成型rho-细胞”。在图2D所示的具体实例中，携带COX1ΔC15构建物（命名为XPM199）的合成型rho-细胞被复制接种到缺乏尿嘧啶的培养基上（这是用于纯化阳性克隆的主平板）。同时，它们也被复制接种到测试菌株L4527的菌苔上，该菌株含有无功能突变cox1D369N。经过两个晚上的交配，L45与XPM199的线粒体基因组发生重组，生成有功能的COX1基因；因此，二倍体恢复了在呼吸培养基上生长的能力。从主平板上，我们挑取了阳性克隆，并在缺乏尿嘧啶的平板上划线培养，重复选择性检测，以获得纯的合成型rho-细胞（图2E）。需要特别注意的是，测试平板仅用于鉴定合成型rho-克隆，无法从此类平板上回收突变体。

将构建体整合至目标菌株的线粒体基因组中
此步骤通过一种称为细胞质导出的过程实现28,29 (图1, 第6步）。在此方法中，合成的 rho- 菌株（供体菌株）与具有相反交配型的目标受体菌株进行交配。一个基本要求是，两个交配菌株中至少有一个携带 kar1-1 突变以阻碍核融合30因此，两个细胞的结合产生一个双核合子（图3）。供体和受体亲本细胞的线粒体网络发生融合，线粒体DNA分子发生重组。将双核合子进行孵育/恢复，使其出芽，从而产生单倍体细胞。这些单倍体细胞携带其中一个亲本细胞的细胞核遗传背景。同样，这些单倍体细胞可能携带来自任一亲本细胞的线粒体DNA，或携带目标重组线粒体DNA。然而， kar1-1 突变并非100%有效，在交配过程中会形成一些真正的二倍体28,29. 合成的 rho- 菌株（供体，XPM199）携带 kar1-1 示例中的等位基因。作为选择标记，它具有 ade2 等位基因，使其成为腺嘌呤营养缺陷型（auxotroph）图4）。受体菌株为XPM10，一种rho+ 携带该菌株的 cox1Δ::ARG8m 构建，其中报告基因 ARG8m 替换 COX1 线粒体基因组中的密码子7将两种细胞培养物的混合液以液滴形式接种至YPD平板上，以诱导交配。3-5小时后，在光学显微镜下观察细胞，检测“shmoos”形态的形成。 (图3B), 一种与交配相关的细胞形态。孵育/恢复一段时间后，将双核合子接种于缺乏腺嘌呤的培养基上，以抑制供体细胞的生长。

选择含有目标线粒体基因组的单倍体菌株 (图1，步骤 7）
胞质杂交后，体系中同时存在供体细胞、受体细胞以及二倍体细胞。因此，在双核合子孵育/恢复生长后，必须将细胞培养于不同的选择性培养基中，以鉴定并纯化目标单倍体细胞。所用选择性培养基取决于供体菌株、受体菌株的基因型以及预期的线粒体构建类型。但通常而言，选择特定选择性培养基的基本原理如下： i孵育/恢复后，将细胞质转移混合物接种于选择性培养基上，供体亲本菌株无法在此培养基上生长。在下述具体示例中 图4A，B，供体（合成 rho- 菌株）携带无功能的 ade2 等位基因。因此，细胞质杂交混合物必须在缺乏腺嘌呤的培养基平板上孵育。此平板为母板。 ii菌落生长后，将主平板再次复制到不含腺嘌呤的培养基上（由此生成新的主平板，用于后续纯化目标阳性菌落），接着复制到仅二倍体能够生长的培养基上。此步骤旨在避免意外进一步纯化二倍体菌落。以本示例为例 图 4C只有二倍体能在缺乏亮氨酸的培养基上生长。 iii主培养板还需复制到一种培养基上，在该培养基中仅能生长那些已整合了目标线粒体DNA的受体单倍体细胞。以如下示例说明： 图 4C，单倍体可在含有乙醇/甘油作为碳源的呼吸培养基上生长，因为Cox1ΔC15蛋白具有功能活性。所得rho+ 携带目标线粒体DNA的菌株被命名为XPM20925. 所使用的菌株 图 2 和 图4 列于 表1.

线粒体DNA编辑示意图，展示Cox1ΔC15基因的过程；包括复制和纯化步骤。
图2：描述线粒体转化及阳性rho-细胞筛选的具体示例示意图。（A）对线粒体基因组的预期修饰是删除编码Cox1亚基最后15个氨基酸的区域（Cox1ΔC15）。（B）将两种质粒包被于钨微粒（WPs）上以转化酵母细胞。其中一种为2 µ质粒Yep352，靶向并在细胞核中表达；另一种为质粒pXPM61，包含COX1ΔC15等位基因以及分别来自COX1基因5'和3'-UTR的395 nt与990 nt序列。（C）将WPs导入缺乏线粒体DNA（rho0菌株）的NAB69菌株细胞中。从轰击平板上获得的转化子菌落被复制到缺乏尿嘧啶的培养基上，该培养基用于筛选携带核质粒YEp352的营养缺陷型标记。（D）为筛选阳性rho-菌落，将-URA平板复制到缺乏尿嘧啶的培养基上，此即主平板，从中挑选并分离阳性菌落。同时还将主平板复制到富含营养的YPD培养基平板以及涂布有测试菌株的平板上。在接合过程中，人工合成的rho-线粒体DNA与测试菌株L4527的线粒体DNA发生重组，该测试菌株在COX1基因中携带D369N突变。能够在呼吸培养基上生长的二倍体细胞即含有转化后的DNA。从主平板上挑选对应菌落进行重新划线和纯化。为在多次复制平板过程中便于识别主平板上的阳性菌落，使用永久性记号笔在平板边缘做标记（绿色线条）。（E）将筛选出的阳性菌落重新划线接种于缺乏尿嘧啶的培养基上，形成新的主平板。如同步骤D，再进行两轮测试以进一步纯化合成的rho-菌落。缩写：WPs = 钨微粒；mtDNA = 线粒体DNA；-URA/Sorb = 缺乏尿嘧啶/含山梨醇；WT = 野生型。请点击此处查看该图的放大版本。

酵母交配过程示意图、细胞融合阶段、显微镜图像、生物学研究。
图3：描述胞质导核过程的示意图。（A）胞质导核过程中细胞交配的总体概述。在胞质导核过程中，供体和受体菌株的线粒体发生融合，从而使两个菌株的线粒体DNA发生重组。由于kar1-1突变抑制了核融合30，因此形成双核合子。经过一段时间的培养/恢复后，双核合子出芽，筛选获得含有目标线粒体突变的单倍体受体细胞。（B）合成的rho-菌株（供体）与受体菌株通过胞质导核进行交配，可形成“shmoo”形态（红色箭头），这是酵母交配的典型特征。该图像在光学显微镜下以100倍物镜拍摄。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

酵母遗传重组示意图：合成 rho- 供体与 rho+ 受体杂交，DNA 整合步骤。
图 4：描述通过胞质融合将突变COX1ΔC15整合到线粒体基因组中的具体示例示意图。（A）将合成 rho- 菌株（供体，XPM199）和目标菌株（受体，XPM10）的液体培养物混合进行交配。在形成“shmoo”形态后，将混合物转移至液体培养基中继续培养 2–4 小时。随后，将胞质融合混合物涂布于缺乏腺嘌呤的培养基平板上，以抑制供体细胞的生长。（B）胞质融合过程中来自供体（XPM199）和受体（XPM10）的线粒体DNA重组事件的示意图。（C）将主平板复制到不同的选择性培养基上，以鉴定并纯化那些在线粒体DNA中成功整合了目标线粒体基因的单倍体菌株（XPM209）25。缩写：-ADE = 缺乏腺嘌呤；-LEU = 缺乏亮氨酸。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

注意：由于线粒体转化效率通常较低，建议每种构建体进行六次转化。不同培养基的组成见表2。

1. 钨颗粒的制备

  1. 取一个微量离心管，称取30 mg的0.7 µm钨微粒（WPs，微载体），加入1.5 mL 70%乙醇（EtOH）进行灭菌。涡旋混匀钨微粒，并在室温下静置10分钟。
  2. 在室温下以13,200 × g 离心15分钟。向沉淀中加入1.5 mL无菌水洗涤微粒，涡旋混匀后，在室温下再次以13,200 × g 离心15分钟。弃去上清液。
  3. 加入500 µL无菌的50%甘油（最终浓度为60 µg WPs/µL）。
    注意：钨微粒可在-20 °C下保存至少6个月。每次实验可从此储备液中取100 µL用于六次转化。

2. WPs DNA 包被

  1. 在冰上将5 µg的2 µl质粒和15 µg含有线粒体序列的细菌质粒加入微量离心管中。
    注意：最终体积不得超过50 µL，以避免稀释DNA包被所需的试剂。
  2. 加入100 µL钨微粒（WPs）悬浮液，涡旋5秒（含6 mg WPs）。
  3. 加入4 µL 1 M亚精胺，短暂涡旋。
  4. 加入100 µL冰冻的2.5 M CaCl2溶液，短暂涡旋。4 °C冰浴孵育10分钟，每隔3分钟短暂涡旋混合一次。
    注意：CaCl2溶液为滤膜除菌，切勿高压灭菌。
  5. 在4 °C、13,200 × g条件下离心WPs 30秒，弃去上清液。用200 µL -20 °C的100%乙醇轻轻重悬颗粒以洗涤。
  6. 在4 °C、13,200 × g条件下离心WPs 30秒，弃去上清液。重复洗涤一次。
  7. 用移液器吸头将WPs重悬于60–70 µL室温的100%乙醇中；切勿涡旋。
    注意：为确保质粒质量，DNA包被应与基因枪转化在同一天完成。

3. 基因枪材料的制备

  1. 轰击前，将六个宏载体固定器（图5）在高压灭菌器中灭菌，并彻底干燥。或者，将其浸入乙醇（EtOH）中，并借助镊子用火焰灭菌。将它们放置在无菌玻璃板上。
  2. 在DNA沉淀过程中（步骤2.4中冰上孵育10分钟），用无菌镊子将六个宏载体（或称“飞碟”）分别插入六个宏载体固定器中。
    注意：无需对宏载体进行灭菌。
  3. 用移液器混匀DNA包被的钨颗粒（WPs）。取10 µL钨颗粒悬液加至每个宏载体表面，并用移液器枪头将其均匀涂布至整个表面。如有需要，可向宏载体表面添加少量额外的100%乙醇，以促进钨颗粒的均匀分布。让悬液在室温下干燥约20分钟。

4. 酵母细胞的制备与轰击平板的准备

  1. 将 rho0 受体菌株接种于 2 mL YPR 培养基中（表 2）。在 30 °C 条件下，于旋转轮上培养过夜。
  2. 取 300 µL 菌液转接到 30 mL 新鲜 YPR 培养基中，在 30 °C、200 rpm 条件下于摇床中振荡培养两天，直至菌液达到饱和状态。
  3. 在室温下以 600 × g 离心 5 分钟，收集酵母细胞。弃去上清液，并将酵母细胞重悬于 600 µL YPD 培养基中（表 2）。
  4. 使用无菌玻璃涂布棒，将 100 µL 酵母细胞悬液均匀涂布于固体轰击培养基平板上。
    注意：轰击培养基必须不含将用于转化的 2 µ 质粒的选择标记。
  5. 对另外五个平板重复步骤 4.4。
  6. 轰击前，在室温下孵育 1–3 小时，以确保液体培养基完全被平板表面吸收。

通过基因枪转化法构建合成 rho- 菌株

注意：开始之前，请务必阅读基因枪设备的用户手册。我们将介绍所引用设备的操作流程（材料表 和 图5）。

  1. 使用70%乙醇清洁基因枪递送系统的腔室，以防止污染，并静置至少10分钟。在轰击前，用干净的纸巾擦拭表面。
  2. 打开氦气罐阀门，将压力调节至约2,000 psi。
  3. 开启设备电源，并打开真空源。
  4. 使用镊子将微载体托盘（macrocarrier）倒置放置在托盘支架上。
    注意：请勿使用设备附带的阻挡筛网（stopping screen）。
  5. 将微载体托盘盖旋紧在微载体托盘上方。所有部件共同构成微载体发射系统（图5）。
  6. 将微载体发射系统放入真空腔室中，置于从底部数起的第五层位置。
  7. 将一块含有rho0菌株菌苔的培养皿放置在腔室从底部数起的第二层位置。确保培养皿朝上，且未加盖皿盖。
  8. 使用无菌镊子，将一片爆破膜（rupture disk）放置在固定帽（retaining cap）上。将固定帽旋紧在加速管（acceleration tube）上；确保固定帽拧紧到位。
    注意：请勿按照说明书建议使用异丙醇处理爆破膜，因为我们观察到这会降低转化效率。
  9. 关闭真空腔室的门。
  10. 将VAC/VENT/HOLD开关置于VAC位置。当达到25–28 inHg真空度时，将VAC/VENT/HOLD开关切换至HOLD位置。
    注意：可达到的真空度可能因海拔高度而异。我们发现达到25 inHg时效果良好。
  11. 按下FIRE开关以发射钨微粒（WPs）。等待加速管内压力上升至1,300 psi，此时爆破膜破裂，发出“砰”的一声。
  12. 爆破膜破裂后，立即通过将VAC/VENT/HOLD开关切换至VENT位置，释放FIRE开关和真空。
  13. 使用无菌镊子小心地移除培养皿表面残留的爆破膜碎片，并盖上皿盖。
  14. 对剩余的五块培养皿重复上述操作，每次均更换新的爆破膜和微载体托盘。
  15. 最后，关闭氦气罐的主阀门。
  16. 关闭腔室，将VAC/VENT/HOLD开关置于VAC位置以建立真空。通过多次按下并释放FIRE开关，释放系统中残留的氦气压力。重复此操作，同时保持腔室门打开。
  17. 关闭真空泵和轰击设备。
  18. 使用70%乙醇清洁递送系统。用0.1% SDS溶液清洗微载体支撑架，随后用无菌蒸馏水和100%乙醇冲洗。

6. 合成 rho- 菌落筛选

  1. 将轰击平板在 30 °C 下孵育 5–7 夜。
    注意：必须每天检查平板是否有污染。如有必要，可用无菌刮铲切除受污染区域，以避免进一步污染。
  2. 将相反交配型的测试菌株接种于 2 mL YPD 培养基中，过夜培养（见图 2D、E中的具体示例）。
  3. 取 150 µL 测试菌株培养物接种至 YPD 平板上。使用无菌玻璃涂布棒将测试菌株均匀涂布于平板表面。让平板干燥至少 5 分钟。
  4. 使用绒布复制垫和复制印章对轰击平板进行菌落复制。
    1. 将菌落复制到与转化后的 2 µ 质粒营养缺陷型标记相对应的缺失培养基平板上。在 30 °C 下过夜孵育后即可观察到生长。之后将平板保存于 4 °C，以备后续使用。此平板为主平板。
    2. 将菌落复制到步骤 6.3 所制备的含有测试菌株菌苔的 YPD 平板上。在 30 °C 下孵育两夜。随后，将该平板复制到选择性培养基上，以检测目标线粒体基因的存在，例如呼吸培养基或缺乏精氨酸的培养基，并在 30 °C 下过夜孵育。只有那些在线粒体中携带合成细菌质粒的细胞，在与测试菌株交配后，才能在选择性培养基上生长。
  5. 在主平板（步骤 6.4.1）上确定步骤 6.4.2 中生长的对应菌落。
    注意：由于轰击平板（以及由此获得的主平板）上转化子菌落密集，可能难以识别在测试菌株交配平板上观察到的阳性菌落。因此，强烈建议使用永久性记号笔在所有平板的每侧画几条细线，并在复制印章的环上画出类似的线条。这些标记线有助于在主平板上定位和识别阳性菌落（参见图 2D中的示例）。
  6. 从主平板上挑取阳性菌落，划线接种至第二块选择性缺失培养基平板上，操作同步骤 6.4.1。在 30 °C 下孵育两夜。
    注意：划线操作必须确保形成单菌落，以获得纯培养菌株。
  7. 重复筛选过程（步骤 6.2–6.5），以确认细菌质粒存在于线粒体中。
    注意：通常可再重复此过程两次，以筛选获得稳定的合成 rho- 菌株。
  8. 一旦合成 rho- 菌株能够稳定地在线粒体中维持质粒 DNA，选取 3–5 个不同的阳性菌落，分别接种于 2 mL YPD 培养基中。利用该培养物制备冻存管（将 600 μL 培养物与 600 μL 50% 甘油混合，于 -70 °C 保存），并用于通过胞质杂交（步骤 6.7）将质粒序列导入目标 mtDNA 中。
    注意：由于合成 rho- 菌株中线粒体内的转化质粒缺乏选择压力，质粒容易丢失。因此，建议尽快进行胞质杂交操作。

通过细胞质导将合成 rho- 菌株中存在的构建体整合到线粒体基因组的目标位点

  1. 取两支试管，每支加入 3 mL YPD 培养基，分别接种供体细胞（合成型 rho- 细胞）和受体细胞（预期获得最终构建体的酵母细胞），于 30 °C 过夜培养。
  2. 在无菌微量离心管中混合 750 µL 供体菌株和 250 µL 受体菌株（比例为 3:1）。
  3. 将混合液在 13,200 × g 条件下离心 1 分钟，弃去上清液。使用剪去末端的 1 mL 枪头取一滴细胞沉淀，接种于 YPD 平板上，于 30 °C 培养 2–4 小时。
    注意：为避免交叉污染，单个平板上不要接种超过两种细胞悬液（参见 图 4A 的示例）。
  4. 取少量细胞混合物，在载玻片上用 15 µL 无菌水重悬，盖上盖玻片。在光学显微镜下使用 40x 或 100x 物镜观察是否存在“shmoos”形态；当存在两种交配型时会出现该特征性形态（图 3B）。
  5. 若观察到 shmoos，取少量（约 0.5 mm3）细胞团块，在 2 mL YPD 培养基中重悬，于 30 °C 在旋转摇床中培养 2 小时，使双核合子恢复。
  6. 涡旋混匀后，取 10 µL 细胞悬液加入 990 µL 无菌水中（1:100 稀释）。使用玻璃珠或无菌玻璃涂布棒将 100 µL 稀释液涂布于筛选培养基（dropout medium）上，仅受体菌株（及偶发的二倍体）可在该培养基上生长。于 30 °C 培养 2–3 夜。
  7. 根据引言中所述方法（阶段 4），将获得的菌落复制到相应的选择性培养基上（参见 图 4C 的具体示例）。
  8. 鉴定出阳性菌落后，将其在相同选择性培养基上重新划线，以纯化携带目标线粒体 DNA 的单倍体菌株。
  9. 挑选至少两个阳性菌落，于 30 °C 在 2 mL YPD 培养基中过夜培养。取 600 µL 饱和 YPD 培养物与 600 µL 50% 甘油混合，制备冷冻保存样本，于 -70 °C 保存。
  10. 提取所得菌株的 DNA31,32，通过 PCR 扩增目标区域并进行测序，以确认线粒体突变的存在。
    注意：每个阳性菌落均为需独立验证的技术重复，以确保线粒体基因组中序列正确无误。

结果

本部分展示了线粒体转化不同阶段的一些代表性结果。 图6 显示了一种轰击程序。合成的 rho- 细胞携带一种含有报告基因的细菌质粒 ARG8m，将替换线粒体基因的编码序列（图6A）。轰击后，将平板转接到缺乏尿嘧啶的培养基（-URA）上进行复制；这是 主培养板 (图6B）。生长的菌落含有带有酵母表达载体的 URA3 营养缺陷型标记。根据第6部分实验步骤，轰击平板也复制到了含有测试菌株菌苔的YPD培养基上。在此情况下，测试菌株携带一个有缺陷的等位基因 ARG8m 线粒体基因组中的基因（ARG8m-1)1经过两天的培养后，测试菌株与转化细胞发生接合，线粒体完成融合。将该平板复制到缺乏精氨酸的培养基上。只有含有线粒体质粒的二倍体细胞能够在该选择性培养基上生长，因为 ARG8m 合成型 rho 中存在的基因- 菌株取代了缺陷型 ARG8m-1 来自测试菌株的线粒体基因组。

每个平板上的阳性菌落数量通常在零到20个之间。在本示例中，获得了四个阳性合成 rho- 菌落，通过在缺乏尿嘧啶的培养基上划线对其进行纯化。在第一轮纯化过程中，除了阳性菌落外，还获得了许多阴性菌落。然而，经过两到三轮纯化后，可以获得纯的阳性合成 rho- 菌株。在 图6C 中，我们展示了经过三轮纯化和检测后的几个阳性合成 rho- 菌落。来自-URA主平板的大多数菌落对检测探针呈阳性。有趣的是，并非一个阳性菌落中的所有细胞都含有线粒体质粒，这表明转化而来的质粒在菌落的部分细胞群体中丢失了。该结果是预期之中的，因为缺乏维持线粒体质粒的选择压力，导致其不稳定。然而，像 图6C 所示的合成 rho- 菌株可以进入下一步实验——胞质融合（第7部分方案），也可用于制备菌种并储存于-70 °C。 图6D 还展示了一个合成 rho- 菌株的第三轮纯化结果。但在本例中，由于转化子几乎无法维持线粒体质粒，因此被弃用。

我们描述了一种用于筛选阳性合成 rho- 菌落的通用策略，如图7A所示。在此情况下，合成 rho- 细胞中存在的线粒体构建体含有数百个核苷酸，可与测试菌株的线粒体DNA发生重组（例如，合成 rho- 菌株中的构建体 COX1ΔC15 与测试菌株线粒体DNA上的突变基因 cox1D369N 重组（图2D）；或合成 rho- 菌株中的 cox1Δ::ARG8m 构建体与测试菌株线粒体DNA上的突变基因 ARG8m-1 重组（图6A））。然而，若缺乏可用于筛选目标阳性合成 rho- 细胞的测试菌株，则可采用一种间接方法进行筛选33。在此情况下，细菌质粒还必须包含一段线粒体基因片段，如 COX2 或 COX3。测试菌株含有一个无功能的线粒体 cox2 或 cox3 基因拷贝。在给定示例中，细菌质粒中存在的 cox3 片段序列可互补测试菌株线粒体中 cox3 序列的缺陷，并在重组后产生有功能的 COX3 基因。将合成 rho- 细胞与测试菌株杂交后，只有当合成 rho- 细胞的线粒体内含有细菌质粒时，二倍体细胞才能进行呼吸作用（图7B）。

图8 展示了细胞质导过程。供体菌株和受体菌株分别具有亮氨酸和腺嘌呤营养缺陷型。因此，在细胞质导后，将混合物涂布于缺乏亮氨酸的培养基上，以阻止供体细胞的生长。此为主平板。此时，只有具有受体菌株核背景的单倍体以及零星的二倍体会生长。为了排除二倍体，将主平板复制到缺乏腺嘌呤的培养基上，仅二倍体可在该培养基上生长。在此示例中，细胞质导后的线粒体DNA发生突变，目标单倍体无法在乙醇/甘油呼吸培养基上生长。因此，需将主平板复制到含有测试菌株菌苔的YPD平板上。能够呼吸的阳性二倍体所在的位置指示了应从主平板上挑选纯化的菌落。需要进行两轮纯化才能获得最终的纯菌株。线粒体整合通常通过PCR扩增目标区域周围片段并进行测序来验证。

最后，基因可以插入到线粒体基因组的特定位点。例如，报告基因可插入线粒体基因编码序列的3'端，或替换线粒体基因的编码区，还有其他多种选择方式（图9A）。此外，基因也可插入线粒体基因组非编码区的异位位点。常用的位点位于COX2基因起始密码子上游295 nt处。对该非编码区的修饰是无害的13。为了使基因在异位位点成功表达，必须在其两侧分别连接线粒体启动子和终止子。COX2的侧翼序列是最优选择，因为COX2是线粒体基因中5'和3'非翻译区最短的基因（5'非翻译区为73 nt，3'非翻译区为119 nt）（图9B）。构建该载体时，所用细菌质粒具有以下特征：模板质粒包含COX2编码区，其下游含有终止密码子后1120 nt序列，上游含有起始密码子AUG前670 nt序列，命名为pXPM5025。将目的基因两侧分别连接73 nt的COX2 5'-UTR和119 nt的COX2 3'-UTR。随后，如前所述，将该结构插入至COX2 AUG起始密码子上游295 nt处的非编码区（图9B）。需要注意的是，该质粒以及最终获得的线粒体基因组中，COX2的5'和3'非翻译区均被重复。将该质粒轰击进入细胞后，合成的rho-细胞与受体菌株进行胞质杂交，后者在COX2区域具有广泛缺失（cox2-62等位基因）1。在胞质杂交过程中，合成rho-菌株的线粒体质粒与受体菌株的线粒体DNA发生重组。最终获得的线粒体基因组包含异位插入的构建序列以及一个野生型COX2基因。因此，阳性克隆能够在呼吸培养基上生长（图9B）。

基因递送系统示意图；氦气驱动的微粒弹丸发射；微载体组分标注。
图 5：高速微弹轰击装置的示意图。 本实验室使用Biolistic-PDS-1000/He粒子递送系统（材料表）。缩写：WPs = 钨微粒。 请点击此处查看该图的放大版本。

质粒整合到线粒体DNA；酵母在URA和ARG选择性培养基上生长；菌落形成分析。
图6：高速微弹轰击转化平板示例。（A,B）轰击后，平板在30 °C下培养5-7天。若出现污染菌（蓝色箭头所示），可用无菌刮铲将其切除。将平板复制到选择标记培养基（本例中为-URA培养基）上后，还通过与测试菌株杂交来检测主平板上是否存在线粒体质粒。本例中，测试菌株携带非功能性等位基因 ARG8m-1 1。杂交2天后，将平板复制到缺乏精氨酸的培养基（-ARG）上，出现四个阳性菌落（红色箭头所示）。（C）通过在-URA培养基上重新划线纯化阳性合成rho-菌落，并如前所述进行复制测试。这些平板代表第三次纯化轮次。（D）部分阳性合成rho-菌落丢失了线粒体构建体。缩写：mtDNA = 线粒体DNA；-URA = 缺乏尿嘧啶；-ARG = 缺乏精氨酸。 请点击此处查看该图的放大版本。

基因工程示意图：将基因插入测试用线粒体DNA的细菌质粒。
图7：示意图展示如何选择阳性合成 rho- 轰击后的菌落 (A细菌质粒包含一种线粒体基因的非功能性突变版本。为实现检测，采用合成的 rho- 菌落与含有线粒体DNA中同一基因不同功能缺失突变的测验菌株杂交。杂交后，突变的线粒体DNA发生重组，通过互补作用可恢复基因功能。在此情况下，二倍体能在选择性培养基上生长，而该培养基上任一亲本的合成型rho⁻或rho⁰线粒体均无法支持生长。- 菌株和测试菌均不能生长。 (B）在此情况下，质粒包含一段额外的线粒体基因序列（即一段 COX3). 转化后，合成的 rho- 通过其互补能力筛选菌株 COX3 测试菌株中的突变使得只有二倍体能够在选择性培养基（即呼吸培养基）上生长。当目标基因缺乏相应测试菌株时，该方法尤为便捷。阳性合成型 rho 的检测- 此情况下的菌落为间接形成。缩写：mtDNA = mitochondrial DNA。 请点击此处以查看此图的放大版本。

细胞质传递培养皿实验；酵母菌落；主平板、二倍体、非呼吸型、阳性平板。
图8：通过细胞质传递将构建体整合到线粒体DNA靶位点的示例。 接合与恢复后，将混合细胞和双核合子接种于缺乏亮氨酸的培养基上。在此情况下，由于供体菌株含有leu2,3-112等位基因，该培养基可抑制供体生长。此平板被复制到相同的培养基（主平板）、仅二倍体能够生长的培养基（-ADE）以及含有预期突变的受体能够生长的培养基（红色箭头所示）。在此情况下，供体和受体细胞均无法在呼吸型培养基上生长。只有与测试菌株的菌苔接合后形成的二倍体才能在呼吸型培养基上生长。这些具有呼吸能力的二倍体菌落可用于指导从主平板中筛选和纯化阳性菌落。缩写：-LEU = 缺乏亮氨酸；-ADE = 缺乏腺嘌呤。 请点击此处查看该图的放大版本。

将合成的 rho⁻ 供体线粒体 DNA 转移至 mtDNA 受体；基因替换过程示意图。
图 9：示意图展示如何将突变的线粒体构建体（存在于合成的 rho- 菌株中）整合到受体菌株中。（A）在此示例中，受体菌株携带 ARG8m 报告基因，该基因替换了目的基因的密码子。合成的 rho- DNA 包含该基因的突变版本。质粒与线粒体 DNA 通过 5' 和 3' 侧翼区域发生重组，ARG8m 报告基因被目的基因的突变序列所替换。（B）外源基因可被异位插入线粒体基因组的特定区域7,13,36。在此示例中，可在 COX2 基因上游 295 nt 处插入一个基因。该区域为线粒体 DNA 的非编码区。目的外源基因分别由 COX2 基因 5' UTR 的 73 nt 和 3' UTR 的 119 nt 序列所包围。该构建体被插入含有 COX2 基因及其 5' 和 3' UTR 区域分别延伸 670 nt 和 1120 nt 的质粒中。合成的 rho- 菌株（供体）在线粒体中携带此构建体。在此情况下，受体菌株（XPM13）7 的 cox2 基因存在显著缺失（等位基因 cox2-62）1。经过胞质杂交后，供体与受体的线粒体 DNA 发生重组，COX2 基因得以恢复，同时目的基因被插入至异位位点（即 COX2 基因上游 295 nt 处）。缩写：mtDNA = 线粒体 DNA；nt = 核苷酸。请点击此处查看该图的放大版本。

酵母菌株基因型参考文献
NAB69Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
NB71 Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
XPM209Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
XPM13Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
L45Matα, ade1, op1  (rho+, cox1-D369N)28

表1：用于基因枪转化和细胞质杂交的酵母菌株示例。

培养基成分
YPD2% 葡萄糖, 2% 细菌蛋白胨, 1% 酵母提取物
YPR2% 棉子糖, 2% 细菌蛋白胨, 1% 酵母提取物
YPEG*3% 甘油, 3% 乙醇*1, 2% 细菌蛋白胨, 1% 酵母提取物
缺陷型培养基2% 葡萄糖, 6.8% 含 (NH4)2SO4 的酵母氮源基础, 缺陷型氨基酸混合物*2
基因枪转化培养基5% 葡萄糖, 6.8% 含 (NH4)2SO4 的酵母氮源基础, 1 M 山梨醇, 缺陷型氨基酸混合物*2,3。
*1 在培养基灭菌后温度降低时再加入乙醇。
*2 氨基酸混合物的用量可能因库存情况或生产商说明而有所不同。
*3 根据所用酵母菌株的需要添加氨基酸和氮源基础。确保培养基成分与用于筛选的 2μL 质粒所对应的营养缺陷型相匹配。

表2：本实验方案中使用的酵母培养基。

讨论

本研究描述了如何成功转化酿酒酵母（S. cerevisiae）的线粒体。从高速微弹轰击到目标酵母菌株的纯化，整个过程大约需要8至12周，具体时间取决于合成rho-菌株所需的纯化轮次。该方法中一些关键步骤如下：首先，在线粒体基因构建体中，突变位点两侧添加的侧翼区域越大，目标突变成功整合的概率越高。侧翼区域的最小长度约为100 nt，但强烈建议在突变位点两侧各使用超过500 nt的序列。其次，在转化后筛选合成rho-菌落时，建议纯化轮次不超过3至4轮；否则，由于缺乏选择压力以维持质粒在线粒体中的存在，线粒体构建体最终可能丢失。第三，为避免对操作者或设备造成损害，在开始实验前必须仔细阅读轰击仪器的使用手册。该设备较为精密，操作过程中涉及高压和真空环境。

该方法的一个局限性在于，目前只有酵母和莱茵衣藻（C. reinhardtii）适用于通过此方法进行线粒体转化。如果我们能够将位点特异性突变引入其他生物的线粒体基因组中，将具有重要意义。另一个局限性是，在同一次实验中转化多种不同构建体存在较大挑战。建议对每个构建体进行六次转化，每次转化后均需进行检测、筛选和纯化。仅为了获得单一线粒体突变的纯合rho-菌落，就可能需要使用超过50块培养基平板。

尽管存在这些局限性，对酵母线粒体基因组进行操作的能力已显著促进了人们对呼吸复合物生物发生多种途径的理解。该方法可用于引入报告基因以监测和定量线粒体翻译1,7,36,37，中断线粒体基因38，鉴定呼吸复合物的组装伴侣蛋白39，更深入地理解线粒体翻译与组装偶联的机制7,11,12,36，以及在追踪突变线粒体基因表达时寻找抑制因子40。迄今为止，尽管早前已有报道对哺乳动物线粒体基因组进行操作的某些方法41，但这些生物体中尚不存在广泛应用的线粒体DNA转化技术。

披露

作者无任何利益冲突需披露。

致谢

本出版物由墨西哥国立自治大学研究与技术创新项目支持计划（PAPIIT）资助 [项目编号：IN223623，授予 XP-M]。UPD 是墨西哥国家科学技术委员会（CONAHCYT）的在研学者（CVU：883299）。我们感谢 Ariann Mendoza-Martínez 博士在光学显微镜图像方面的技术支持。BioRender 许可证编号：DU26OMVLUU（图2）；BK26TH9GXH（图3）；GD26TH80R5（图4）；PU26THARYD（图7）；ML26THAIFG（图9）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 吸头AxygenT-1000-B
1.5 mL 微量离心管AxygenMCT-150-C
10 μL 吸头AxygenT-10-C
15 mL 圆底离心管 AxygenSCT-25ML-25-S
200 μL 吸头AxygenT-200-Y
50 mL 圆底离心管 AxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
琼脂糖SeaKem50004
分析天平OHAUSARA520
高压灭菌器TOMYES-315
细菌用琼脂BD214010
细菌用蛋白胨BD211677
基因枪微载体支架 BIO-RAD1652322
本生灯VWR89038-528
氯化钙Fisher ScientificC79-500
CSM -ADEFormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormediumDCS0169
细胞培养玻璃烧瓶KIMAX KIMBLE25615
细胞培养玻璃管Pyrex9820
葡萄糖BD215520
乙醇JT Baker 9000
镊子Millipore620006
玻璃珠SigmaZ265926
玻璃棒SigmaS4647
甘油JT BAKER2136-01
5 级氦气钢瓶（99.99%）--
HSTaq  试剂盒PCR BIO
微量离心机Eppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
旋转摇床New Brunswick scientificNB-G25
PCR 管AxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM 基因枪系统BIO-RAD165-2257
培养皿（100×10）BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
棉子糖FormediumRAF03
复制接种器SciencewareZ363391
破裂盘 1350 PsiBIO-RAD1652330
山梨醇SigmaS7547
亚精胺SigmaS0266
T4 DNA 连接酶Thermo ScientificEL0011
组织培养旋转仪Thermo Scientific88882015
钨微载体 M10BIO-RAD1652266
100 L/min 容量真空泵--
绒布垫Bel-ArtH37848-0002
涡旋振荡器 Scientific IndustriesSI-0236
木质涂布棒PROMA1820060
酵母提取物BD212750
不含氨基酸的酵母氮源基础BD291920

参考文献

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酿酒酵母线粒体转化用于研究翻译及呼吸复合物组装
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